CN109402051A - 一种人脐带间充质干细胞无血清培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于包括α‑MEM基础培养基，还包括如下组分：以终浓度计，谷氨酰胺1‑20mM、HEPEs 1‑20mM、腐胺10‑100μM、转铁蛋白0.1‑10μM、维生素C 10‑400μM、重组胰岛素1‑10μM、黄体酮1‑20nM、皮质醇10‑200nM、人血白蛋白1‑20mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1‑10ng/mL、转化生长因子β11‑10ng/mL、螺旋藻速溶蛋白多糖1‑50mg/mL。本发明提供的人脐带间充质干细胞无血清培养基可显著提高人脐带间充质干细胞的增殖速率和贴壁性能，有利于人脐带间充质干细胞的增殖和干细胞特性的保持，具有成脂、成骨诱导分化潜能。培养基成分简单、明确、稳定，不含任何血清组分，克服了异种蛋白污染和致病微生物的危险，安全性高。

Description

一种人脐带间充质干细胞无血清培养基
技术领域
本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种人脐带间充质干细胞无血清培养基的配方及其应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是来源于早期中胚层的成体干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，是造血微环境中的一种重要的细胞成分，可以向多种组织如骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质细胞增殖分化，而且免疫原性弱，是组织工程立项的种子细胞来源。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells，hUC-MSCs)来源于新生儿脐带中的华通氏胶，除具有MSCs的所有特性外，还具有含量丰富，细胞纯净，免疫原性更低，细胞原始、分化能力更强，无伦理限制等优势，可为实验和临床提供充足的细胞来源，具有广阔的临床应用前景。
现有的用于培养hUC-MSCs的培养基主要分为三类。一类是基础培养基中添加动物血清，弊端是无法规避动物血清中的异源体，可能存在人体异种蛋白污染或过敏，风险较大；第二类是基础培养基中添加人血小板裂解液之类的血清替代物，但是同样有成分不明的蛋白存在，批次差异较大，来源不稳定等缺点。第三类是基础培养基中添加化学组分明确的血清替代成分，这既满足了hUC-MSCs的培养要求，又有效避免了前两类培养基的诸多不利因素。因此，适合hUC-MSCs细胞生长的化学配方确定的细胞培养基是干细胞走向临床的重要条件。
然而，目前市面上正在销售的商品化MSCs无血清培养基，无论是国外进口还是国内研发生产，不仅价格昂贵，细胞培养的效果也不理想。与血清培养体系相比细胞状态差、细胞贴壁性差、操作繁琐、细胞增殖速率不够，而且细胞老化速度快，MSCs的分化能力降低。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，发明人通过反复的实验验证，获得了一种新的人脐带间充质干细胞无血清培养基，可以有效的对脐带间充质干细胞进行培养。
本发明所提供的人脐带间充质干细胞无血清培养基，是使用α-MEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：谷氨酰胺1-20mM、HEPEs 1-20mM、腐胺10-100μM、转铁蛋白0.1-10μM、维生素C 10-400μM、胰岛素1-10μM、黄体酮1-20nM、皮质醇10-200nM、人血白蛋白1-20mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1-10ng/mL、转化生长因子1-10ng/mL、速溶蛋白多糖1-50mg/mL。
所述的速溶蛋白多糖是从螺旋藻中提取的一种水溶性多糖，是一种无毒的天然生物活性物质，具有促进细胞生长、提高免疫力、抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、抗衰老、对核酸内切酶活性和DNA修复合成有增强作用等功能。
所述的速溶蛋白多糖，其制备方法如下：将螺旋藻干粉清洗，加水后在75-90℃下加热，然后冷却至常温，减压过滤分离，用盐酸调节滤液pH值至3-5，放置12-36h，4000rpm，离心15min离心；分离得到的上清液用Na2CO3溶液调节pH至7.0，然后喷雾干燥，得到藻蛋白多糖提取物。
优选的，本发明提供的一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，包括α-MEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：谷氨酰胺5mM，HEPEs 7mM，腐胺60μM、转铁蛋白1μM、维生素C 200μM、胰岛素6μM、黄体酮20nM、皮质醇110nM、人血白蛋白6mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子2ng/mL、转化生长因子4ng/mL、速溶蛋白多糖5mg/mL。
优选地，所述胰岛素为重组胰岛素，所述转化生长因子为转化生长因子-β1，所述速溶蛋白多糖来源于螺旋藻。
相应地，本发明还提供人脐带间充质干细胞无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：向α-MEM基础培养基中，按所述浓度加入谷氨酰胺、HEPEs、腐胺、转铁蛋白、维生素C、胰岛素、黄体酮、皮质醇、人血白蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、速溶蛋白多糖，混匀，经0.2μm滤膜过滤除菌，得到人脐带间充质干细胞的无血清培养基。
与现有技术相比，采用以上技术方案配制的人脐带间充质干细胞无血清培养基培养脐带间充质干细胞，具有以下优势：
1.因为没有添加动物来源的血清，所以可以控制感染的风险；
2.所含组分均来自重组蛋白或化学合成，不会引起人体免疫排斥；
3.操作简单，不需要提前对培养皿或培养瓶进行包被；
4.细胞贴壁性好，细胞形态佳；
5.细胞增殖速率高，干细胞特性保持佳。
附图说明
图1三种不同培养基(A、B、C)培养的人脐带间充质干细胞至汇合的对比图(P3代)；
图2三种不同培养基(A、B、C)培养的人脐带间充质干细胞增殖曲线的对比图；
图3三种不同培养基(A、B、C)培养的P5代人脐带间充质干细胞的成脂诱导分化染色结果图；
图4三种不同培养基(A、B、C)培养的P5代人脐带间充质干细胞的成骨诱导分化染色结果图；
其中：A培养基为DMEM-LG基础培养基+10％体积百分比的FBS(Gibco)；
B培养基为α-MEM基础培养基+10％血小板裂解液
C培养基为实施例1中提供的人脐带间充质干细胞无血清培养基。
具体实施方法
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明中的各组分可选用常规市售产品，例如黄体酮购自sigma，货号为V900699。
实施例1人脐带间充质干细胞无血清培养基配比的筛选
制备方法：向α-MEM基础培养基中，按所述浓度加入谷氨酰胺母液、HEPEs母液、腐胺、转铁蛋白母液、维生素C母液、胰岛素母液、黄体酮母液、皮质醇母液、人血白蛋白母液、碱性成纤维细胞生长因子母液、转化生长因子母液、速溶蛋白多糖母液，搅拌混匀，经0.2μm滤膜过滤除菌即得。
谷氨酰胺母液：取0.5g，用三蒸水溶解，配成200mM的母液，-20℃保存。重组转铁蛋白母液的制备：取50mg，用α-MEM基础培养基溶解，配成1mM的母液，-20℃保存。维生素C母液的制备：取1g，用α-MEM基础培养基溶解，配成50mg/ml的母液，-20℃保存。重组人胰岛素母液的制备：取20mg，用pH3的盐酸溶解，配成1mg/ml的母液，-20℃保存。黄体酮母液的制备：取5g，用乙醇溶解，配成1mM的母液，-20℃保存。碱性成纤维细胞生长因子母液的制备：取10μg，用PBS溶解，配成10μg/ml的母液，-20℃保存。转化生长因子母液的制备：取2μg，用PBS溶解，配成2μg/ml的母液，-20℃保存。
速溶蛋白多糖的提取：将螺旋藻干粉1kg用1L水冲洗，抽滤，向滤渣中加入10L水搅拌，在88℃下加热1h，冷却后常温后，减压过滤分离，用盐酸调节滤液pH值至3.8，放置过夜，4000rpm离心15min，分离获得的上清液用Na2CO3溶液调节pH至7，然后喷雾干燥，得到藻蛋白多糖提取物粗品(淡黄色粉末，无毒，可溶于水)200g，测定提取物中蛋白多糖含量为72.3％。
设计如下正交试验，对人脐带间充质干细胞无血清培养基中转化生长因子、人血白蛋白、速溶蛋白多糖的配比进行筛选，筛选过程中使用P3代复苏后传代的人脐带间充质干细胞，详细设计见表1。
表1正交试验设计探究人脐带间充质干细胞无血清培养基的配比
结果发现：人脐带间充质干细胞无血清培养基，如下配比培养的人脐带间充质干细胞形态、增殖最佳。该培养基包括α-MEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：谷氨酰胺5mM，HEPEs 7mM，腐胺60μM、转铁蛋白1μM、维生素C 200μM、胰岛素6μM、黄体酮20nM、皮质醇110nM、人血白蛋白6mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子2ng/mL、转化生长因子4ng/mL、速溶蛋白多糖5mg/mL。
实施例2人脐带间充质干细胞的分离
取新生儿新鲜脐带，放入含有100U/ml青链霉素混合液的DMEM-LG培养基100ml中，置于4℃～12℃运输；于百级生物安全柜处理脐带，用75％医用酒精浸泡脐带，浸泡时间30s～60s，去除脐带两端，中间段剪成1～2cm长的小段，用生理盐水反复冲洗脐带小段，剖开，去除其中的动脉、静脉，并用生理盐水反复冲洗去除血迹，剪碎至2mm3。将剪碎的组织块均匀的放于150mm细胞培养皿中(每1～1.5平方厘米放置1块组织块固体)，安全柜内静置10min(风干培养皿与组织块之间的液体)，之后将培养皿倒置放于在37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中1h(使组织块吸附于培养皿上)，然后分别用A培养基、B培养基及C培养基培养，以此类推重复传代即得大量的人脐带间充质干细胞。图1是三种不同培养基培养的P3代人脐带间充质干细胞至汇合的对比图。从图中可以看出，三种培养基培养的细胞均呈梭形，成纤维样，但C培养基培养下的细胞显著的成纤维样，细胞呈旋涡状生长。
实施例3流式细胞术检测细胞表面标记的表达水平
取实施例2中用三种培养基(A、B、C)培养的P3代人脐带间充质干细胞，待细胞融合至90％时，消化收集细胞，用PBS洗涤2遍，分别加入带有荧光标记的CD44、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45和HLA-DR表面抗体孵育30min，再用PBS洗涤2遍，采用流式细胞仪检测细胞表面标记的表达水平，结果见表2。
表2细胞表面标记的表达水平
从表2中可得，三种培养基(A、B、C)培养的P3代人脐带间充质干细胞表面标记蛋白均符合MSCs的生物学特性。
实施例4三种培养基对人脐带间充质干细胞增殖能力的影响
取实施例2中用培养基A培养的P3代人脐带间充质干细胞，用0.125％胰蛋白酶消化后离心，之后用PBS洗两遍，再分别用培养基A、B、C重悬计数，按1×104个/ml接种到24孔板中，1ml/孔，每24h分别计算每种培养基培养下的2个孔消化的每孔细胞总量的平均值，每48h对剩下的未计数的孔进行换液。连续计数12天。根据计数结果，绘制细胞增殖曲线，如图2所示。由图2可知，培养基C(本发明培养基)与A、B两种培养基相比，培养的细胞贴壁时间更短，增殖速度更快，增殖细胞总数更多。培养基A和培养基B分别在第6、7天生长达到高峰，第8、9天开始衰亡，而培养基C在第8天达到高峰，第10天才开始衰亡，三种培养基的细胞增殖总数也是培养基C的最多。由此可见，本发明培养基培养的细胞增殖速率高，细胞增殖数目多。
实施例5三种培养基对人脐带间充质干细胞黏附度的影响
取实施例2中三种培养基(A、B、C)培养的P3代细胞，调整密度以2×105个/孔接种至6孔板中，并分别添加相应的培养基A、培养基B、培养基C进行培养，细胞生长汇合至85％待用。分别用PBS溶解纤维连接蛋白(Fn)和牛血清白蛋白(BSA)至浓度100μg/ml和10mg/ml，4℃保存。每孔加500μl Fn包被12孔板，4℃过夜。吸弃Fn，每孔加500μl 1％BSA，4℃封闭2h。将待用三组细胞分别消化收集，调整密度为4×104个/ml，按每孔1ml细胞悬液加入12孔板。置于培养箱继续孵育3h，4％多聚甲醛固定10min，0.1％结晶紫染色液染色10min，单蒸水脱色3次，室温晾干。每组设3个复孔，每孔取2个视野，采用Image pro plus 6软件采集个图片进行细胞计数。结果见表2。从表3中可知，三种培养基对UC-MSCs的黏附效果分别是：培养基C＞培养基A＞培养基B。
表3三种培养基对UC-MSCs黏附的影响(个)
分组 重复(N) 细胞数目
培养基A 6 129±7.28<sup>*</sup>
培养基B 6 102±6.44
培养基C 6 142±3.88<sup>**</sup>
实施例6三种培养基培养的人脐带间充质干细胞的成脂诱导分化潜能
取实施例2中三种培养基(A、B、C)培养的P5代细胞，以5×103个/cm2的密度接种于6孔板中，并分别添加相应的培养基A、培养基B、培养基C进行培养，待细胞汇合达80％时，将培养基吸出，并加入成脂诱导分化培养基(购自STEMCELL公司，货号05412)，每隔3天换液一次，培养20天后，用油红O染色液试剂盒(购自索莱宝公司，货号G1262)进行成脂鉴定，结果如图3所示。从图中可知，本发明提供的培养基C所培养的细胞成脂诱导分化潜能更佳。
实施例7三种培养基培养的人脐带间充质干细胞的成骨诱导分化潜能
取实施例2中三种培养基(A、B、C)培养的P5代细胞，以5×103个/cm2的密度接种于6孔板中，并分别添加相应的培养基A、培养基B、培养基C进行培养，待细胞汇合达80％时，将培养基吸出，并加入成骨诱导分化培养基(购自STEMCELL公司，货号05404)，每隔3天换液一次，培养28天后，用茜素红染色液进行成骨鉴定，结果如图4所示。从图中可知，本发明提供的培养基C所培养的细胞成骨诱导分化潜能更佳。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种人脐带间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述的无血清培养基是包括如下浓度组分的α-MEM基础培养基：谷氨酰胺1-20mM、HEPEs 1-20mM、腐胺10-100μM、转铁蛋白0.1-10μM、维生素C 10-400μM、胰岛素1-10μM、黄体酮1-20nM、皮质醇10-200nM、人血白蛋白1-20mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子1-10ng/mL、转化生长因子1-10ng/mL、速溶蛋白多糖1-50mg/mL。
2.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述的速溶蛋白多糖的制备方法如下：将螺旋藻干粉清洗，加水后在75-90℃下加热，然后冷却至常温，减压过滤分离，用盐酸调节滤液pH值至3-5，放置12-36h，4000rpm，离心15min离心；分离得到的上清液用Na2CO3溶液调节pH至7.0，然后喷雾干燥，得到藻蛋白多糖提取物。
3.如权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述的培养基中各组分的浓度如下：谷氨酰胺5mM，HEPEs 7mM，腐胺60μM、转铁蛋白1μM、维生素C 200μM、胰岛素6μM、黄体酮20nM、皮质醇110nM、人血白蛋白6mg/mL、碱性成纤维细胞生长因子2ng/mL、转化生长因子4ng/mL、速溶蛋白多糖5mg/mL。
4.如权利要求1或3所述的无血清培养基，其特征在于，所述的胰岛素为重组胰岛素。
5.如权利要求1或3所述的无血清培养基，其特征在于，所述的转化生长因子为转化生长因子-β1。
6.权利要求1或3所述的无血清培养基的制备方法，其特征在于，是向α-MEM基础培养基中，按所述浓度加入谷氨酰胺、HEPEs、腐胺、转铁蛋白、维生素C、胰岛素、黄体酮、皮质醇、人血白蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、速溶蛋白多糖，混匀，经0.2μm滤膜过滤除菌，得到人脐带间充质干细胞的无血清培养基。
7.权利要求1或3所述的无血清培养基在培养人脐带间充质干细胞中的应用。
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