CN105441386A - 一种猪极小胚胎样干细胞培养与鉴定方法 - Google Patents

一种猪极小胚胎样干细胞培养与鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及干细胞培养与鉴定技术领域，尤其涉及一种偶蹄类动物猪极小胚胎样干细胞的培养与鉴定方法，技术内容包括：1.分离同种乳猪成肌细胞并制备成肌细胞饲养层；2.接种分离的猪骨髓极小胚胎样干细胞于成肌细胞饲养层，用RPMI？1640培养基进行培养，并添加细胞因子进行培养扩增极小胚胎样干细胞；3.采用形态学、免疫荧光和基因水平系列鉴定极小胚胎样干细胞。发明提出的极小胚胎样干细胞的高效培养方法和精准的鉴定步骤具有巨大的应用前景，为极小胚胎样干细胞的进一步研究提供了重要的技术保障。

Description

一种猪极小胚胎样干细胞培养与鉴定方法
技术领域
本发明涉及干细胞工程、组织工程与生物起搏等领域，特别是涉及干细胞培养与鉴定技术领域。
技术背景
极小胚胎样干细胞(verysmallembryonic-likestemcells，VSELs)于2006年由美国肯塔基州路易斯维尔大学M.Ratajczak教授等从小鼠骨髓单个核细胞中成功分离并命名,细胞表型为Sca-1（+）lin（-）CD45（-），直径2-4μm。该团队进一步研究发现人骨髓、脐带血、外周血、脑、心肌、肾脏、胰腺等组织中同样存在，细胞表型为SSEA-4+/Oct-4+/CD133+/CXCR4+/Lin-/CD45-，直径为4-6μm。人和鼠VSELs的生物学特性主要包括：较血小板大，红细胞小，细胞核大，含常染色质，表达原始多能干细胞标志Oct-4和Nanog，可以向三个胚层分化，且无免疫排异与伦理问题，被认为具有替代胚胎干细胞的潜力。由于VSELs在一般体外培养条件下极易分化且体外很难扩增，甚至引起一些学者的质疑。加州斯坦福大学Weissman按照Ratajczak团队最初所描述的方法重复实验并广泛分析，尽管在他的实验中发现这些小细胞，但其并没有像多能干细胞那样，在体外聚集成球，也无法扩增。M.Ratajczak团队研究结果也表明人或鼠的VSELs数量均极少（只占骨髓单个核细胞的0.01%-0.04%），故即使存在VSELs，其极低的数量级也成为VSELs进入临床的瓶颈。因此，如何改进培养和鉴定技术是VSELs研究中急需解决的问题。另外，迄今为止，尚缺乏大型偶蹄动物VSELs的成功培养与鉴定报道或专利申报。
经典的培养基有很多种，其中DMEM、F12、RPMI1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的非饲养层培养基，但由于VSELs类似于胚胎干细胞，维持其生长代谢所需的营养须十分充足，因此单纯采用上述培养基体外培养VSELs很难扩增且极易分化。乳猪成肌细胞饲养层以其易于取材、更能模拟体内环境，给成体VSELs提供足够营养并抑分化效果好等特点，优于上述广泛应用的饲养层。
发明内容
因此，针对目前极小胚胎样干细胞培养扩增困难、效率低、易分化、纯度不高，难以鉴定以及迄今为止尚缺乏大型偶蹄类动物VSELs分离、培养与鉴定的报道等突出问题。本发明提供了一种VSELs培养与鉴定方法，为VSELs的进一步研究提供了重要的技术保障。
猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法，技术方案为：将分离、纯化后得到的猪骨髓极小胚胎样干细胞接种于铺有成肌细胞饲养层的培养板中，用RPMI1640培养基进行培养，置于37℃、5%CO2的培养箱中，并添加双抗（青-链霉素储存液）、白血病抑制因子（LIF）、碱性纤维母细胞生长因子（bFGF）、干细胞因子（SCF）等细胞因子进行培养，每2天更换1次培养液，培养9至11天可以进行传代。
在本申请提交之前，本课题组已经提交了一种猪极小胚胎样干细胞分离与纯化方法的发明专利申请，申请号：201510909419.3.，本发明将分离、纯化后得到的极小胚胎样干细胞接种于成肌细胞饲养层加以培养，观察细胞生长情况，及时更换培养液，3天呈现聚集趋势，至5天形成类似细胞克隆的细胞集落，随着培养时间的增加，细胞集落增大，数量也有所增加，可获得扩增且未分化的极小胚胎样干细胞；而无饲养层组则不能形成类似细胞克隆的细胞集落且10天仍无明显细胞扩增。
作为本方法的优选，所添加双抗（青-链霉素储存液）是取青、链霉素各100万单位溶于100mLPBS缓冲液中。
作为本方法的优选，所述的成肌细胞饲养层，其制备包括如下步骤：
一是乳猪成肌细胞分离，步骤包括：
将乳猪麻醉后，无菌条件下分离新生乳猪的骨骼肌样本，用PBS清洗，并尽量剔除表面结缔组织；将骨骼肌组织样本剪成1mm3的小块置于离心管中，加入1g/L的胶原蛋白酶Ⅱ，置于37℃恒温水浴中消化，20～40分钟后，1200rpm离心6分钟，弃上清；加入0.25%胰蛋白酶消化液，取上清液加入等体积含有10～15%胎牛血清的DMEM终止消化，剩余组织可重复消化1次；轻轻吹打细胞悬液，尽量吹散细胞，用400目过滤筛过滤，1200rpm离心6分钟,弃去上清液。用新鲜DMEM液洗2～3次，1200rpm离心6分钟；用10～15%胎牛血清＋10%马血清的F12培养基重悬细胞，接种于培养皿中，置于培养箱中培养；培养1.5～2小时后，将上清液移于另一培养皿中继续培养，以去除非肌原性细胞；培养5～6天，细胞生长至80%贴壁，可以进行传代；弃去培养基，用PBS清洗细胞3次，加入适量0.25%胰酶消化3～5分钟，用含有10%胎牛血清的培养基终止消化，1200rpm离心6分钟，用F12培养基重悬细胞，接种于培养皿中，置于37℃，5%CO2培养箱中继续培养；40分钟后，将上清液移于另一培养皿中继续培养。
二是乳猪成肌细胞饲养层制备，步骤包括：
将传至3代细胞的培养基吸出，加入适量丝裂霉素C，培养1～2小时后，弃去丝裂霉素C溶液，用PBS清洗7～8次，加入适量0.25%胰酶消化液消化3～5分钟，用含有10%胎牛血清的培养基终止消化，1200rpm离心6分钟，用培养基重悬清洗细胞2次，1200rpm离心6分钟，培养基重悬细胞，接种于96孔板中，置于培养箱中培养；观察到细胞融合至60%左右，即获得成肌细胞饲养层。
作为本方法的进一步优选，所选取用于麻醉的为出生2-4天的乳猪，雌雄不限，由扬州大学实验动物中心提供，所有实验动物均受到人道对待，符合美国国立卫生研究院颁布的《实验动物管理和使用指南》。实验方案获得扬州大学实验动物伦理委员会和江苏省苏北人民医院伦理委员会批准。
作为本方法的进一步优选，上述所用的0.25%胰蛋白酶，是将0.25g胰蛋白酶溶于100mLPBS缓冲液中，调整PH值至7.2，使用0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后置于-20℃环境中，常温下应用。
作为本方法的进一步优选，所应用到的PBS缓冲液（不含Ca、Mg），是取Na2HPO4·12H2O1.4425g，KH2PO40.1g，NaCl4g，KCl0.1g，溶解于500mL新制备的超纯水中，定容后调整PH至7.2，高压灭菌后，保存在4℃环境中。
本发明同时提供了3种方法鉴定分离或培养的猪VSELs。具体为：
1、透射电镜鉴定猪VSELs的方法，步骤包括：将分离或培养后的CD45(-)CD133(+)lin(-)的单核细胞和骨髓间充质干细胞收集、固化、包埋进行透视电镜观察细胞形态和超微结构。
2、免疫荧光鉴定猪VSELs的方法，步骤包括：将分离或培养后的VSELs培养液从培养孔板中吸出，加入4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS润洗3次；0.2％TritonX-100透膜处理20min，PBS润洗3次；含10％FBS的PBS封闭2h；分别在不同孔中加一抗SSEA-1、SOX-2、OCT-4、NANOG，4℃冰箱过夜；过夜细胞孵育后，分别加入相对应的二抗；添加0.5%Tween20的PBS溶液（PBS-T）润洗3次，每次5min，滴加二抗，37℃温育2h（避光）；PBS-T润洗3次，每次5min；5ng/μLDAPI常温下染色2min；荧光显微镜观察；碱性磷酸酶（AKP）染色将荧光染色后的细胞孔板中的培养液吸出，加入配置好的碱性磷酸酶染色液，放在倒置显微镜下观察。
3、基因水平鉴定猪VSELs方法，步骤包括：
一是RNA提取。包括先将细胞悬液收集至离心管中，1000rpm，6-8min，之后用PBS重悬细胞，重复三遍以达到清洗细胞的目的，按1×107细胞加入1mLTRIZOL试剂；将上述样品于15-30℃（常规室温即可）静置5min，使蛋白质充分解离；加入0.2mL氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15s并于15-30℃静置2-3min;于2-8℃12000rpm离心15min。离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA;取上清，加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，于15-30℃静置10min后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA;于4℃12000rpm离心10min后，弃上清;向沉淀中加入1mL75%乙醇，轻轻混匀;于4℃7500rpm离心5min后，弃上清;将RNA样品晾干，加入适量去离子甲酰胺溶解（可于55-60℃促溶10min）；
二是反转录制备cDNA，步骤包括：制备gDNA去除反应体系，将5×gDNABuffer2μl、TotalRNA-、RNase-FreeddH2O补足至10μl混合均匀，简短离心，于42℃孵育3min，至于冰上备用;制备反转录反应体系：将10×FastRTBuffer2μl、RTEnzymeMix1μl、FQ-RTPrimerMix2μl、RNase-FreeddH2O补足至10μl混合;将反转录反应体系中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀;42℃孵育15min，95℃孵育3min，得到的cDNA用于后续实验，或-20℃保存；
三是荧光定量PCR，步骤包括：建立20μl反应体系，将2×SuperRealPreMixPlus10μl、50×ROXReferenceDye-、模板-，正、反向引物各0.6μl和RNase-FreeddH2O补足至20μl混合，在室温下平衡并彻底混匀，离心。设置荧光定量检测仪进行检测;建立20μl反应体系，将Template＜1μl、Primer11μl、Primer21μl、2×TaqPCRMasterMix12.5μl、RNase-FreeddH2O补足至25μl混合均匀;PCR反应循环的设置：反应条件设置为94℃3min、94℃30sec、56℃15sec、72℃30sec、72℃5min，以上反应条件进行34个循环;琼脂糖凝胶电泳检测成肌细胞基因样品顺序：β-actin、Sox2、Oct4、Nanog、CD133、CD45；VSELs基因样品顺序：CD45、CD133、Nanog、Oct4、Sox2、β-actin。
透射电镜显示猪VSELs十分细小，5～7微米，细胞超微结构表现为细胞核大、细胞质少。免疫荧光染色证实其表达胚胎样干细胞标志Nanog、SSEA-1、Oct-4、Sox-2，非造血干细胞标志Lin（?）、CD45（?）、CD133（+）和其它干细胞标志CXCR4（+），碱性磷酸酶染色阳性。
本发明方法涉及到的主要实验仪器，包括超净工作台、CO2恒温培养箱、倒置荧光显微镜、恒温水浴锅、微量移液枪、漩涡振荡仪、冰箱、电子天平制冰机、超纯水设备、免疫磁珠分选仪、流式细胞仪、5810R型低温高速离心机等。涉及到的主要实验器械，包括(1)手术器械：骨髓穿刺包，1mL、5mL、20mL注射器。(2)细胞培养相关实验器材：T25细胞培养瓶、6孔、24孔及96孔细胞培养板，15mL及50mL离心管,0.22um滤膜及塑料滤器,40um滤网，烧杯,量筒,细胞计数板等。涉及到的主要实验试剂，包括DMEM/F12培养基、胎牛血清、PBS缓冲液、双抗（青、链霉素）、RPMI1640条件培养基、胶原蛋白酶Ⅱ、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、干细胞因子（SCF）、白血病抑制因子（LIF）等。
本发明的优越性在于：
1.采用成肌细胞饲养层培养极小胚胎样干细胞显著增加扩增成功率，而无饲养层细胞培养VSELs则培养失败；
2.方法实用、易行，可重复性强；
3.可靠性明显增加，细胞得率高；
4.取材方便、实用；
5.为偶蹄类动物其它组织如外周血、脑、心肌、肾脏、胰腺等VSELs的扩增和鉴定提供了新的方法，同时也为偶蹄类动物VSELs细胞后续研究提供了方法和途径；
6.该技术也适用于其它物种如鼠、人、禽类等VSELs的培养、鉴定，可用于珍贵物种的研究与开发。
发明提出的VSELs的高效培养方法和精准的鉴定步骤具有巨大的应用前景，为VSELs的临床研究提供了重要的技术保障。
附图说明
图1猪成肌细胞饲养层；
图2采用成肌细胞饲养层培养极小胚胎样干细胞；
图3无成肌细胞饲养层培养极小胚胎样干细胞；
图4无成肌细胞饲养层培养骨髓间充质干细胞；
图5透射电镜下观察比较猪骨髓极小胚胎样干细胞及MSCs的超微结构；
图6细胞间接免疫荧光检测；
图7VSELs碱性磷酸酶染色呈深棕红色；
图8荧光定量RT-PCR从基因水平检测极小胚胎样干细胞和成肌细胞；
图9凝胶电泳图显示极小胚胎样干细胞胚胎样标记物表达水平显著高于成肌细胞。
具体实施方式
实施例一
一、猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法
1.分离同种乳猪成肌细胞
（1）将乳猪麻醉后，无菌条件下分离新生乳猪的骨骼肌样本，用PBS清洗，并尽量剔除表面结缔组织；
（2）将骨骼肌组织样本置于离心管中，剪成1mm3的块状，加入1g/L的胶原蛋白酶Ⅱ，置于37℃恒温水浴中消化，20～40分钟后，1200rpm离心6分钟，弃上清；
（3）加入0.25%胰蛋白酶消化液，轻微吹打3～5分钟，可见消化液变浑，此时取上清液于另一干净的试管中，加入等体积含有10～15%胎牛血清的DMEM终止消化，剩余组织可重复消化1次；
（4）轻轻吹打细胞悬液，尽量吹散细胞。用400目过滤筛过滤，1200rpm离心6分钟,弃去上清液。用新鲜DMEM液洗2～3次，1200rpm离心6分钟；
（5）用10～15%胎牛血清＋10%马血清的F12培养基重悬细胞，接种于培养皿中，至于培养箱中培养；
（6）培养1.5～2小时后，将上清液移于另一培养皿中继续培养，以去除非肌原性细胞；
（7）培养5～6天，细胞生长至80%贴壁，可以进行传代；
（8）弃去培养基，用PBS清洗细胞3次，加入适量0.25%胰酶消化液，3～5分钟后用含有10%胎牛血清的培养基终止消化，1200rpm离心6分钟，用培养基重悬细胞，接种于培养皿中，置于37℃，5%CO2培养箱中继续培养；40分钟后，将上清液移于另一培养皿中继续培养。
2、乳猪成肌细胞饲养层制备
（1）将传至3代的细胞的培养基吸出，加入适量丝裂霉素C溶液，置于培养箱中培养1～2小时后，弃去丝裂霉素C溶液，用PBS清洗7～8次，加入适量0.25%胰酶消化3～5分钟，用含有10%胎牛血清的培养基终止消化，1200rpm离心6分钟，用培养基重悬清洗细胞2次，1200rpm离心6分钟，培养基重悬细胞，接种于96孔板中，置于培养箱中培养；
（2）观察到细胞融合至60%左右，即获得成肌细胞饲养层。图1所示为乳猪成肌细胞饲养层。
3、极小胚胎样干细胞培养
(1)将流式分选后得到的VSELs分别接种于铺有成肌细胞饲养层和无饲养层细胞的培养板中，用RPMI1640培养基进行培养，同时以骨髓间充质干细胞进行对照。培养于37℃、5%CO2的培养箱中，并添加双抗和LIF、bFGF、SCF等细胞因子进行培养；
(2)观察细胞生长情况，每2天更换1次培养液，原代细胞培养至10天左右可以进行传代。培养于成肌细胞饲养层的VSELs至3天呈现聚集趋势，至5天形成类似细胞克隆的细胞集落，随着培养时间的增加，细胞集落增大，数量也有所增加。图2所示自左至右分别代表接种于成肌细胞层的极小胚胎样干细胞第3、5、10天增殖情况，3天开始聚集，5天形成细胞克隆，10天细胞集落进一步增大。而无成肌细胞饲养层只有RPMI1640条件培养基培养则不能形成类似细胞克隆的细胞集落，至10天仍无明显增殖。图3所示为骨髓间充质干细胞在单纯RPMI1640条件培养基培养3-4天后开始呈梭状生长；图4所示为骨髓间充质干细胞，原代细胞培养至10天左右可以进行传代。
二、透射电镜鉴定猪VSELs的方法
将分离或培养后的CD45(-)CD133（+)lin(-)的单核细胞以及骨髓间充质干细胞收集、固化、包埋进行透视电镜观察细胞形态和超微结构，透射电镜观察。图5中左图为极小胚胎样干细胞，细胞核大，胞质少，细胞器不发达，核质比高，直径约5-8um；右图为间充质干细胞细胞核较小，胞质丰富，细胞器发达,核质比相对较低，直径约8-11um。
实施例二
一、猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法
步骤同上，不再重复表述。
二、细胞间接免疫荧光鉴定猪VSELs的方法
（1）将分离或培养后的VSELs培养液从培养孔板中吸出，加入4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS润洗3次；0.2％TritonX-100透膜处理20min，PBS润洗3次；含10％FBS的PBS封闭2h；
（2）分别在不同孔中加一抗Sox-2、Oct-4、Nanog，4℃冰箱过夜；
（3）过夜细胞孵育后，分别加入相对应的二抗；添加0.5%Tween20的PBS溶液（PBS-T）润洗3次，每次5min，滴加二抗，37℃温育2h（避光）；PBS-T润洗3次，每次5min；
（4）5ng/μLDAPI常温下染色2min；
（5）荧光显微镜观察。图6中免疫荧光鉴定猪骨髓极小胚胎样干细胞高表达SSEA-1、Nanog、Oct-4和Sox-2；
（6）碱性磷酸酶（AKP）染色将荧光染色后的细胞孔板中的培养液吸出，加入配置好的碱性磷酸酶染色液，放在倒置显微镜下观察。图7中极小胚胎样干细胞经碱性磷酸酶染色呈深棕红色。
实施例三
一、猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法
步骤同上，不再重复表述。
二、基因水平鉴定猪VSELs的方法
一.RNA提取
(1)将细胞悬液收集至离心管中，1000rpm，6-8min之后用PBS重悬细胞，重复三遍以达到清洗细胞的目的，按1×107细胞加入1mLTRIZOL试剂；
(2)将上述样品于15-30℃（常规室温即可）静置5min，使蛋白质充分解离；
(3)加入0.2mL氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15s并于15-30℃静置2-3min;
(4)于2-8℃12000rpm离心15min。离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA;
(5)取上清，加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，于15-30℃静置10min后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA;
(6)于4℃12000rpm离心10min后，弃上清;
(7)向沉淀中加入1mL75%乙醇，轻轻混匀;
(8)于4℃7500rpm离心5min后，弃上清;
(9)将RNA样品晾干，加入适量去离子甲酰胺溶解（可于55-60℃促溶10min）。
二.反转录制备cDNA
(1)制备gDNA去除反应体系将5×gDNABuffer2μl、TotalRNA-、RNase-FreeddH2O补足至10μl混合均匀，简短离心，于42℃孵育3min，至于冰上备用;
(2)反转录反应体系：将10×FastRTBuffer2ul、RTEnzymeMix1ul、FQ-RTPrimerMix2ul、RNase-FreeddH2O补足到10ul;
(3)将反转录反应体系中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀;
(4)42℃孵育15min，95℃孵育3min，得到的cDNA用于后续实验，或-20℃保存。
三荧光定量RT-PCR
（1）建立20μl反应体系，将2×SuperRealPreMixPlus10μl、50×ROXReferenceDye-、模板-，正、反向引物各0.6μl和RNase-FreeddH2O补足至20μl混合，在室温下平衡并彻底混匀，离心。设置荧光定量检测仪进行检测;
（2）PCR步骤建立20μl反应体系，将Template＜1μl、Primer11μl、Primer21μl、2×TaqPCRMasterMix12.5μl、RNase-FreeddH2O补足至25μl混合均匀;
（3）PCR反应循环的设置：反应条件设置为94℃3min、94℃30sec、56℃15sec、72℃30sec、72℃5min，以上反应条件进行34个循环;
（4）琼脂糖凝胶电泳检测成肌细胞基因样品顺序：β-actin、Sox2、Oct4、Nanog、CD133、CD45；VSELs基因样品顺序：CD45、CD133、Nanog、Oct4、Sox2、β-actin。图8荧光定量RT-PCR基因水平检测示VSELs高表达Nanog、Oct4、Sox2，而成肌细胞低表达；图9凝胶电泳图显示VSELs胚胎样标记物表达水平显著高于成肌细胞。
以上所述仅为本发明的主要实施方式，凡依本发明申请专利范围所作的均等改进和润饰也应视为本发明专利的涵盖范围。

Claims (9)

1.一种猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法，其特征在于，将分离、纯化后得到的猪骨髓极小胚胎样干细胞接种于铺有成肌细胞饲养层的培养板中，用RPMI1640培养基进行培养，置于37℃、5%CO2的培养箱中，并添加双抗（青-链霉素储存液）、白血病抑制因子（LIF）、碱性纤维母细胞生长因子（bFGF）、干细胞因子（SCF）等细胞因子进行培养，每2天更换1次培养液，培养9至11天可以进行传代。
2.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法，其特征在于，所述的双抗（青-链霉素）：取青、链霉素各100万单位溶于100mLPBS缓冲液中。
3.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法，其特征在于，所述的成肌细胞饲养层，其制备包括如下步骤：
一是乳猪成肌细胞分离，步骤包括：
（1）将乳猪麻醉后，无菌条件下分离新生乳猪的骨骼肌样本，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗，并尽量剔除表面结缔组织；
（2）将骨骼肌组织样本置于离心管中，剪成1mm3的块状，加入1g/L的胶原蛋白酶Ⅱ，置于37℃恒温水浴中消化，20～40分钟后，1200rpm离心6分钟，弃上清；
（3）加入0.25%胰酶消化液，轻微吹打3～5分钟，可见消化液变浑，此时取上清液于另一干净的试管中，加入等体积含有10～15%胎牛血清的DMEM终止消化，剩余组织可重复消化1次；
（4）轻轻吹打细胞悬液，吹散细胞，用400目过滤筛过滤，1200rpm离心6分钟,弃去上清液，用新鲜DMEM液洗2～3次，1200rpm离心6分钟；
（5）用10～15%胎牛血清＋10%马血清的F12培养基重悬细胞，接种于培养皿中，至于培养箱中培养；
（6）培养1.5～2小时后，将上清液移于另一培养皿中继续培养，以去除非肌原性细胞；
（7）培养5～6天，细胞生长至80%贴壁，可以进行传代；
（8）弃去培养基，用PBS清洗细胞3次，加入适量0.25%胰酶消化3～5分钟，用含有10%胎牛血清的培养基终止消化，1200rpm离心6分钟，用培养基重悬细胞，接种于培养皿中，置于37℃，5%CO2培养箱中继续培养；40分钟后，将含细胞的上清液移于另一培养皿中继续培养；
二是乳猪成肌细胞饲养层制备，步骤包括：
（1）将传至3代细胞的培养基吸出，加入适量丝裂霉素C溶液，置于培养箱中培养1～2小时后，弃去丝裂霉素C溶液，用PBS清洗7～8次，加入适量0.25%胰酶消化3～5分钟，用含有10%胎牛血清的培养基终止消化，1200rpm离心6分钟，用培养基重悬清洗细胞2次，1200rpm离心6分钟，培养基重悬细胞，接种于96孔板中，置于培养箱中培养；
（2）观察到细胞融合至60%左右，即获得成肌细胞饲养层。
4.根据权利要求3所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法，其特征在于，所述的乳猪为出生2-4天的乳猪。
5.如权利要求3所述的所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法，其特征在于，所述的0.25%胰蛋白酶，是将0.25g胰蛋白酶溶于100mLPBS缓冲液中，调整PH值至7.2，使用0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后置于-20℃环境中备用。
6.根据权利要求3所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法，其特征在于，所述的PBS缓冲液（不含Ca、Mg）：取Na2HPO4·12H2O1.4425g，KH2PO40.1g，NaCl4g，KCl0.1g，溶解于500mL新制备的超纯水中，定容后调整PH至7.2，高压灭菌后，4℃环境中保存。
7.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法的鉴定方法，其特征在于，用透射电镜鉴定所述的猪VSELs，步骤包括：将分离或培养后的CD45(-)CD133(+)lin(-)的单核细胞收集、固化、包埋进行透视电镜观察细胞形态和超微结构。
8.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法的鉴定方法，其特征在于，用免疫荧光鉴定所述的猪VSELs，步骤包括：
（1）将分离或培养后的VSELs培养液从培养孔板中吸出，加入4％多聚甲醛固定细胞30min，PBS润洗3次；0.2％TritonX-100透膜处理20min，PBS润洗3次；含10％FBS的PBS封闭2小时；
（2）分别在不同孔中加一抗SSEA-1、SOX-2、OCT-4、NANOG，4℃冰箱过夜；
（3）过夜细胞孵育后，分别加入相对应的二抗；添加0.5%Tween20的PBS溶液（PBS-T）润洗3次，每次5分钟，滴加二抗，37℃温育2小时（避光）；PBS-T润洗3次，每次5分钟；
（4）5ng/μLDAPI常温下染色2分钟；
（5）荧光显微镜观察；
（6）碱性磷酸酶（AKP）染色将荧光染色后的细胞孔板中的培养液吸出，加入配置好的碱性磷酸酶染色液，放在倒置显微镜下观察。
9.一种猪极小胚胎样干细胞的鉴定方法，其特征在于，用基因水平鉴定猪VSELs，步骤包括：
一.RNA提取
(1)先将细胞悬液收集至离心管中，1000rpm，6-8分钟，之后用PBS重悬细胞，重复三遍以达到清洗细胞的目的，按1×107细胞加入1mLTRIZOL试剂；
(2)将上述样品于15-30℃（常规室温即可）静置5分钟，使蛋白质充分解离；
(3)加入0.2mL氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15秒并于15-30℃静置2-3min;
(4)于2-8℃12000rpm离心15min；离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA;
(5)取上清，加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，于15-30℃静置10min后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA;
(6)于4℃12000rpm离心10min后，弃上清;
(7)向沉淀中加入1mL75%乙醇，轻轻混匀;
(8)于4℃7500rpm离心5min后，弃上清;
(9)将RNA样品晾干，加入适量去离子甲酰胺溶解（可于55-60℃促溶10min）；
二.反转录制备cDNA
(1)gDNA去除反应体系：将5×gDNABuffer2μl、TotalRNA-、RNase-FreeddH2O补足至10μl混合均匀，简短离心，于42℃孵育3min，至于冰上备用;
(2)反转录反应体系：将10×FastRTBuffer2μl、RTEnzymeMix1μl、FQ-RTPrimerMix2μl、RNase-FreeddH2O补足至10μl混合;
(3)将反转录反应体系中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀;
(4)42℃孵育15min，95℃孵育3min，得到的cDNA用于后续实验，或-20℃保存；
三荧光定量PCR
（1）建立20μl反应体系，将2×SuperRealPreMixPlus10μl、50×ROXReferenceDye-、模板-，正、反向引物各0.6μl和RNase-FreeddH2O补足至20μl混合，在室温下平衡并彻底混匀，离心；设置荧光定量检测仪进行检测;
（2）建立20μl反应体系，将Template＜1μl、Primer11μl、Primer21μl、2×TaqPCRMasterMix12.5μl、RNase-FreeddH2O补足至25μl混合均匀;
（3）PCR反应循环的设置：反应条件设置为94℃3min、94℃30sec、56℃15sec、72℃30sec、72℃5min，以上反应条件进行34个循环;
（4）琼脂糖凝胶电泳检测成肌细胞基因样品顺序：β-actin、Sox2、Oct4、Nanog、CD133、CD45；VSELs基因样品顺序：CD45、CD133、Nanog、Oct4、Sox2、β-actin。
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