CN104293731A - 建鲤原代肝细胞的分离培养方法 - Google Patents
建鲤原代肝细胞的分离培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104293731A CN104293731A CN201410535197.9A CN201410535197A CN104293731A CN 104293731 A CN104293731 A CN 104293731A CN 201410535197 A CN201410535197 A CN 201410535197A CN 104293731 A CN104293731 A CN 104293731A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- jian carp
- primary hepatocyte
- jian
- digestion
- substratum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本发明公开了建鲤原代肝细胞的分离培养方法,选取健康无伤的建鲤,从建鲤尾静脉处采血,完毕后对鱼体表面消毒,放入超净台内无菌采集建鲤肝脏;用含双抗的PBS溶液漂洗,加入胰酶消化液,消化处理温度为26~28℃,时间为15-20min;消化结束后加入培养基A终止消化,消化液经过200目过滤网进行过滤,收集滤液;分别用50g和30g各离心5min,然后用培养基B进行洗涤2次,去除上清液,得到沉淀即为提取的肝细胞,制成细胞悬液,铺板培养。本实验方法简单快捷,能很大程度上节约分离时间,本实验所用分离时间大约为40min,且获得的肝细胞生长状况良好,红细胞数量少,细胞存活率在95%左右。
Description
技术领域
本发明涉及一种建鲤原代肝细胞的分离培养方法,属于细胞生物学及生物技术领域。
背景技术
原代肝细胞的培养起源于上世纪40年代,肝细胞的成功培养被应用于许多领域,如肝细胞移植、生物人工肝等方面,关于肝细胞的分离方法,哺乳动物方面进展较快,有二步胶原酶灌流法、组织块培养法、酶消化法等;而鱼类肝细胞的分离与培养起步较晚,进展缓慢,主要采用二步灌流法和酶消化法。由于肝细胞具有完整的药物代谢酶体系,是药物生物转化的主要场所,因此肝细胞的体外培养在肝病研究中发挥着日益重要的作用,体外培养的原代肝细胞具有许多独特的优点,可同时获得大量性状较均一的样本,且培养体系中仅含实质细胞,便于人为控制培养条件,排除了许多复杂因素的干扰,基本保留了肝脏原有的代谢功能和细胞分化状态,存活时间长。因此肝细胞被广泛应用于药物的药理、毒理学的研究中。
目前,关于鱼类肝细胞的分离和培养方法,获得肝细胞数量少、分离时间长、红细胞偏多、活性差,不能够很好应用于实验研究中。
发明内容
本发明的目的是提供一种建鲤原代肝细胞的分离培养方法,本方法对现有肝细胞分离方法进行了改良,方法简单快捷,能很大程度上节约分离时间,且获得的肝细胞生长状况良好,红细胞数量少,细胞存活率在95%左右。
为了实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
建鲤原代肝细胞的分离培养方法,包括如下步骤:
1)选取健康无伤的建鲤,从建鲤尾静脉处采集血液,采血完毕后对鱼体表面消毒,放入超净台内无菌采集建鲤肝脏;
2)将步骤1)采集的建鲤肝脏用含双抗的PBS溶液漂洗,去除血块,修剪成小块,加入胰酶消化液,然后转移到装有玻璃珠的锥形瓶内,将锥形瓶置于水浴锅中进行消化,消化处理温度为26~28℃,时间为15-20min;
3)消化结束后加入含有体积分数10%胎牛血清的L-15培养基终止消化,消化液经过200目过滤网进行过滤,收集滤液;
4)将步骤3)的滤液采用梯度离心,分别用50g 和30g各离心5 min,然后用不含血清的L-15培养基进行洗涤2次,去除上清液,得到沉淀即为提取的肝细胞;
5)细胞培养板预处理,在细胞培养板每孔内滴入大鼠尾胶原溶液,使其均匀铺满孔底,然后放入CO2培养箱中培养12~24 h,取出培养板,吸弃每孔内的大鼠尾胶原溶液,以 L-15培养基冲洗,吸净培养基,置 CO2培养箱中备用;
6)将步骤4)提取的肝细胞加入含体积分数10%胎牛血清的L-15培养基中,制成细胞悬液,在步骤5)预处理好的细胞培养板上进行铺板操作,然后将铺好的细胞培养板放入CO2培养箱中培养。
步骤1)中选取的野生建鲤的质量为80-100g。发明人通过多次摸索,总结出80-100g左右的幼鱼的肝脏分离后肝细胞活力较好,质量较高;可能是随着个体生长,其肝脏活性可能会下降,进而影响分离后肝细胞的活力强弱。
步骤2)中加入的胰酶消化液的体积为肝组织块体积的5倍。
步骤2)中修剪成小块的体积为1~3mm3。
步骤2)中所述玻璃珠的直径为2-4mm。加入玻璃珠可以促进组织与消化液的充分接触,消化时间较短,能够很好地保持细胞活力,通过实验摸索发现,消化时间和消化液浓度过高,会严重影响肝细胞活力。
步骤2)中消化处理温度为27℃,时间为15min;
步骤5)和步骤6)中的CO2培养箱中温度为27℃,CO2体积分数为5%。
步骤3)的滤液中主要是肝细胞,还有少量杂细胞,步骤4)中采用梯度离心可以起到纯化肝细胞的目的,洗涤的目的是尽可能多去除杂细胞。
步骤5)对细胞培养板预处理的目的是促进肝细胞的贴壁。
本发明中培养基选择稳定性较好的L-15培养基进行培养,可以避免培养基pH值变化过快给肝细胞的培养造成影响。
有益效果:
本实验方法对现有肝细胞分离方法进行了改良,方法简单快捷,能很大程度上节约分离时间,本实验所用分离时间大约为40min,且获得的肝细胞生长状况良好,红细胞数量少,细胞存活率在95%左右。且不用红细胞裂解液能够很好的去除大部分红细胞(使用红细胞裂解液虽然可以很好的去除红细胞,但是同时也会对肝细胞造成一定损伤,影响肝细胞活力,进而导致肝细胞活性较差,影响后续试验),生长状况良好,能够很好地满足实验需求,为后续试验的顺利开展奠定了基础。
附图说明
图1:刚分离出来的肝细胞12h在显微镜下观察呈现小亮点状态,肝细胞图片×100倍;
图2:肝细胞在24h,出现贴壁现象,肝细胞图片×100倍;
图3:肝细胞在72h,出现伸展变形现象,呈岛屿状生长,肝细胞图片×200倍。
具体实施方式
L-15培养基:购自于美国sigma公司;
培养基A: 含有体积分数10%胎牛血清的L-15培养基,配方为:L-15培养基1000ml、100ml新生胎牛血清FBS、10ml双抗、胰岛素10mg。
培养基B: 不含血清L-15培养基,配方为:L-15培养基1000ml、10ml双抗。
双抗(青霉素及链霉素溶液),含有青霉素(10,000 IU/mL)和链霉素(10,000μg/mL)在100倍的工作浓度的混合液。
实施例1
实验材料及仪器消毒处理:
将实验所需的L-15培养基、大鼠尾胶原、胎牛血清、双抗、0.25%胰酶消化液、75%酒精、0.4%台盼蓝等试剂药品,剪刀、镊子、枪头、移液管、锥形瓶、玻璃珠、过滤器、计数板等进行灭菌消毒处理。(其中百分比均为体积百分比)
细胞培养板预处理:
细胞培养板预处理的目的是为了促进细胞的贴壁,取出细胞培养板,无菌条件下,在每孔内滴入200μL大鼠尾胶原溶液,轻晃使其均匀铺满孔底。把涂有胶原溶液的培养板放入CO2培养箱(27℃、5%CO2)中过夜。次日取出培养板至超净工作台中,吸弃每孔内的胶原溶液,再加入500 μL L-15培养基冲洗,以消除醋酸对建鲤肝细胞的影响,最后吸净培养基,置 CO2培养箱中备用。
建鲤原代肝细胞的分离培养:
选取健康无伤质量为80-100g左右的野生建鲤进行实验 (通过多次实验证明,质量较小的鱼类获得的肝细胞活力较好),于建鲤尾静脉处采集血液,尾静脉采血完毕后,在建鲤鳃脉弓处剪开放血,此处放血相当于动物上面的动脉血管,可以将鱼体内血液去除干净,这样培养出来的肝细胞会去除绝大部分红细胞,将血液去除干净可明显降低分离后肝细胞中红细胞数量,采血完毕后对鱼体表面用75%酒精进行消毒,放入超净台内无菌采取建鲤肝脏。
将肝脏放置于事先准备好的含双抗的PBS溶液(NaCl 8.0g、KCl 0.2g、 Na2HPO3·12H2O 3.63g、KH2PO4 0.24g、10mL双抗,加蒸馏水600mL 溶解,调 pH 至 7.2,再加蒸馏水定容到 1L,高压灭菌待用。)中进行漂洗,修剪,去除血块,然后将肝组织修剪成1mm3小块,加入5倍肝组织块体积的胰酶消化液,另外准备一只50mL锥形瓶,里面放入10颗直径2-4mm的玻璃珠,加入玻璃珠可以促进肝组织与酶消化液的充分接触(锥形瓶和玻璃珠均已进行洗涤灭菌处理),然后将肝组织转移至锥形瓶内,于27度水浴锅中进行消化,瓶口用灭菌消毒过的锡箔纸进行遮盖处理,防止外界污染物进入瓶内造成细胞污染,消化处理时间为15min,期间每隔2min进行摇晃一次,促进胰酶消化液与肝组织充分接触。
所用胰酶消化液浓度为0.125%,经过试验摸索如果浓度过大,会严重影响肝细胞活力,因此将0.25%的胰酶消化液与L-15培养基按1:1比例进行了稀释。(百分比是体积百分比)
消化结束后加入培养基A(含有体积分数10%胎牛血清的L-15培养基)1mL终止消化,以200目过滤网进行过滤,采用梯度离心法分别用50g 和30g离心5min,用培养基B(不含血清L-15培养基)进行洗涤2次,将上清液去掉,将沉淀中加入5mL培养基A制成细胞悬液,细胞存活率是采用细胞板计数得来的台盼蓝染色法(细胞悬液与0.5%台盼蓝染液按1∶1体积比混合,1 min后于血球计数板上计数,活细胞圆形透明,死细胞染成蓝色,用活细胞占计数细胞中的百分比表示细胞存活率)。计数结束后根据实验需要进行铺板操作,铺好的细胞培养板放入CO2培养箱中培养,27℃、5%体积分数 CO2 条件下培养。刚分离出来的肝细胞,还没有贴壁,在显微镜下观察只是一个个“亮圈”,见图1;随着培养时间的增加,肝细胞开始贴壁、变形,出现伸展现象,见图2;72h后肝细胞连接紧密,出现岛屿状生长,见图3。本方法简单快捷,所用分离时间大约为40min,且获得的肝细胞生长状况良好,红细胞数量少,细胞存活率在95%左右。且不用红细胞裂解液能够很好的去除大部分红细胞(使用红细胞裂解液虽然可以很好的去除红细胞,但是同时也会对肝细胞造成一定损伤,影响肝细胞活力,进而导致肝细胞活性较差,影响后续试验)。
Claims (9)
1.建鲤原代肝细胞的分离培养方法,其特征在于包括如下步骤:
1)选取健康无伤的建鲤,从建鲤尾静脉处采集血液,并在建鲤鳃脉弓处剪开放血,完毕后对鱼体表面消毒,放入超净台内无菌采集建鲤肝脏;
2)将步骤1)采集的建鲤肝脏用含双抗的PBS溶液漂洗,去除血块,修剪成小块,加入胰酶消化液,然后转移到装有玻璃珠的锥形瓶内,将锥形瓶置于水浴锅中进行消化,消化处理温度为26~28℃,时间为15-20min;
3)消化结束后加入培养基A终止消化,消化液经过200目过滤网进行过滤,收集滤液;
4)将步骤3)的滤液采用梯度离心,分别用50g 和30g各离心5 min,然后用培养基B进行洗涤2次,去除上清液,得到沉淀即为提取的肝细胞;
5)细胞培养板预处理,在细胞培养板每孔内滴入大鼠尾胶原溶液,使其均匀铺满孔底,然后放入CO2培养箱中培养12~24 h,取出培养板,吸弃每孔内的大鼠尾胶原溶液,以 L-15培养基冲洗,吸净培养基,置 CO2培养箱中备用;
6)将步骤4)提取的肝细胞加入培养基A中,制成细胞悬液,在步骤5)预处理好的细胞培养板上进行铺板操作,然后将铺好的细胞培养板放入CO2培养箱中培养。
2.根据权利要求1所述的建鲤原代肝细胞的分离培养方法,其特征在于:步骤1)中选取的野生建鲤的质量为80-100g。
3.根据权利要求1所述的建鲤原代肝细胞的分离培养方法,其特征在于:步骤2)中加入的胰酶消化液的体积为肝组织块体积的5倍,胰酶消化液浓度为0.125%(体积百分比)。
4.根据权利要求1所述的建鲤原代肝细胞的分离培养方法,其特征在于:步骤2)中修剪成小块的体积为1~3mm3。
5.根据权利要求1所述的建鲤原代肝细胞的分离培养方法,其特征在于:步骤2)中所述玻璃珠的直径为2-4mm。
6.根据权利要求1所述的建鲤原代肝细胞的分离培养方法,其特征在于:步骤2)中消化处理温度为27℃,时间为15-20min。
7.根据权利要求1所述的建鲤原代肝细胞的分离培养方法,其特征在于:步骤5)和步骤6)中的CO2培养箱中温度为27℃,CO2体积分数为5%。
8.根据权利要求1所述的建鲤原代肝细胞的分离培养方法,其特征在于:培养基A配方为:L-15培养基1000mL、100mL新生胎牛血清FBS、10mL双抗、胰岛素10mg。
9.根据权利要求1所述的建鲤原代肝细胞的分离培养方法,其特征在于:培养基B配方为:L-15培养基1000mL、10mL双抗。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410535197.9A CN104293731A (zh) | 2014-10-13 | 2014-10-13 | 建鲤原代肝细胞的分离培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410535197.9A CN104293731A (zh) | 2014-10-13 | 2014-10-13 | 建鲤原代肝细胞的分离培养方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104293731A true CN104293731A (zh) | 2015-01-21 |
Family
ID=52313689
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410535197.9A Pending CN104293731A (zh) | 2014-10-13 | 2014-10-13 | 建鲤原代肝细胞的分离培养方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104293731A (zh) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106929468A (zh) * | 2017-03-21 | 2017-07-07 | 西南大学 | 一种鱼类单细胞悬液的制备方法 |
CN108300688A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-07-20 | 上海赛立维生物科技有限公司 | 原代肝细胞分离和培养方法 |
CN109161515A (zh) * | 2018-08-06 | 2019-01-08 | 南京农业大学 | 团头鲂原代肝细胞的分离培养方法 |
CN109321516A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-02-12 | 贵州大学 | 一种鸭原代肝细胞分离及培养方法 |
CN111117947A (zh) * | 2020-01-09 | 2020-05-08 | 电子科技大学 | 一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离方法 |
CN115109745A (zh) * | 2022-07-19 | 2022-09-27 | 南京师范大学 | 一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101538552A (zh) * | 2009-04-24 | 2009-09-23 | 扬州大学 | 一种大鼠肝细胞分离培养方法 |
CN101864394A (zh) * | 2010-06-12 | 2010-10-20 | 昆明亚灵生物科技有限公司 | 猕猴成体肝脏前体细胞的分离及培养方法 |
CN102041242A (zh) * | 2010-05-12 | 2011-05-04 | 北京汇智泰康医药技术有限公司 | 一种肝原代细胞的分离和培养方法 |
CN102304492A (zh) * | 2011-08-27 | 2012-01-04 | 上海海洋大学 | 鲫肝细胞原代培养方法 |
CN102321569A (zh) * | 2011-10-19 | 2012-01-18 | 山东省分析测试中心 | 一种石鲽肝脏细胞系的构建方法 |
CN103088106A (zh) * | 2013-01-25 | 2013-05-08 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法 |
CN103509751A (zh) * | 2013-07-08 | 2014-01-15 | 康珞生物科技(武汉)有限公司 | 人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法 |
-
2014
- 2014-10-13 CN CN201410535197.9A patent/CN104293731A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101538552A (zh) * | 2009-04-24 | 2009-09-23 | 扬州大学 | 一种大鼠肝细胞分离培养方法 |
CN102041242A (zh) * | 2010-05-12 | 2011-05-04 | 北京汇智泰康医药技术有限公司 | 一种肝原代细胞的分离和培养方法 |
CN101864394A (zh) * | 2010-06-12 | 2010-10-20 | 昆明亚灵生物科技有限公司 | 猕猴成体肝脏前体细胞的分离及培养方法 |
CN102304492A (zh) * | 2011-08-27 | 2012-01-04 | 上海海洋大学 | 鲫肝细胞原代培养方法 |
CN102321569A (zh) * | 2011-10-19 | 2012-01-18 | 山东省分析测试中心 | 一种石鲽肝脏细胞系的构建方法 |
CN103088106A (zh) * | 2013-01-25 | 2013-05-08 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 用鱼原代肝细胞损伤模型筛选鱼类保肝药物的方法 |
CN103509751A (zh) * | 2013-07-08 | 2014-01-15 | 康珞生物科技(武汉)有限公司 | 人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法 |
Non-Patent Citations (9)
Title |
---|
FAN YANHONG ET AL.: "Optimization of the isolation and cultivation of Cyprinus carpio primary hepatocytes", 《CYTOTECHNOLOGY》 * |
曹丽萍等: "建鲤体内外急性肝损伤模型的建立", 《安徽农业大学学报》 * |
李效宇 等: "鲢、鲤和鲫肝细胞原代培养", 《水生生物学报》 * |
杜金梁 等: "丹参提取物对体外培养建鲤肝细胞的保护作用", 《湖南农业科学》 * |
梁勇等: "2,3,7,8-四氯代二苯并二英(TCDD)和苯并芘(B[a]P)对原代培养鲫鱼肝细胞中卵黄蛋白原诱导的影响", 《科学通报》 * |
罗立新等编著: "《细胞工程》", 31 January 2003, 华南理工大学出版社 * |
谢保胜 等: "青海湖裸鲤体外肝胰细胞原代与传代培养", 《生物学杂志》 * |
贾睿 等: "鱼类肝细胞分离、原代培养与应用研究综述", 《江西农业大学学报》 * |
贾睿: "黄芪多糖对四氯化碳诱导鲤鱼肝(细胞)损伤的保护作用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106929468A (zh) * | 2017-03-21 | 2017-07-07 | 西南大学 | 一种鱼类单细胞悬液的制备方法 |
CN106929468B (zh) * | 2017-03-21 | 2020-11-13 | 西南大学 | 一种鱼类单细胞悬液的制备方法 |
CN108300688A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-07-20 | 上海赛立维生物科技有限公司 | 原代肝细胞分离和培养方法 |
CN109161515A (zh) * | 2018-08-06 | 2019-01-08 | 南京农业大学 | 团头鲂原代肝细胞的分离培养方法 |
CN109161515B (zh) * | 2018-08-06 | 2021-12-03 | 南京农业大学 | 团头鲂原代肝细胞的分离培养方法 |
CN109321516A (zh) * | 2018-11-07 | 2019-02-12 | 贵州大学 | 一种鸭原代肝细胞分离及培养方法 |
CN111117947A (zh) * | 2020-01-09 | 2020-05-08 | 电子科技大学 | 一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离方法 |
CN111117947B (zh) * | 2020-01-09 | 2022-03-08 | 电子科技大学 | 一种鲤科鱼类肝细胞的快速分离方法 |
CN115109745A (zh) * | 2022-07-19 | 2022-09-27 | 南京师范大学 | 一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法 |
CN115109745B (zh) * | 2022-07-19 | 2024-05-31 | 南京师范大学 | 一种黄颡鱼肝细胞高效分离和原代培养方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104293731A (zh) | 建鲤原代肝细胞的分离培养方法 | |
EP3124600B1 (en) | Method for generating a cell condensate for self-organisation | |
CN102061284A (zh) | 人原代肝细胞分离培养方法 | |
CN114317443B (zh) | 乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法 | |
CN102304492B (zh) | 鲫肝细胞原代培养方法 | |
CN106265740B (zh) | 脐带间充质干细胞联合黄芪多糖在制备治疗高血糖和糖尿病肾病药物中的应用 | |
CN102643778A (zh) | 一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法 | |
CN102634480A (zh) | 一种分离培养肝脏原代细胞的方法 | |
CN102051344B (zh) | 一组人成骨肉瘤细胞系及小鼠体内移植模型 | |
CN108300688A (zh) | 原代肝细胞分离和培养方法 | |
CN104694466A (zh) | 间充质干细胞来源的胞外体制备及在急性肺损伤中的应用 | |
CN102154202A (zh) | 储存宫内膜干细胞的方法 | |
CN102697581A (zh) | 一种构建组织工程血管的方法 | |
CN104232575A (zh) | 水牛睾丸间质细胞的分离培养方法 | |
CN105670989A (zh) | 高效诱导成体细胞表观重编程的试剂盒及其方法 | |
CN102154203B (zh) | 宫内膜干细胞定向诱导胰岛素分泌细胞的方法 | |
CN107541497A (zh) | 人垂体腺瘤细胞株及其用途 | |
CN101451121B (zh) | 褐点石斑鱼心脏细胞系的构建方法 | |
CN103382458A (zh) | 诱导间充质干细胞向肾小球系膜细胞分化的培养液及方法 | |
CN101880648B (zh) | 一种胰腺腺泡细胞的原代培养方法 | |
CN104818243A (zh) | 一种胎盘源胎儿干细胞的分离方法 | |
CN106906177A (zh) | 一种裸鼹鼠睾丸间质细胞分离纯化及培养方法 | |
CN105907706A (zh) | 一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法 | |
CN105039239A (zh) | 细胞转化诱导液及其应用 | |
CN106508758B (zh) | 一种紫黑翼蚌钩介幼虫体外培养的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150121 |