CN104293731A

CN104293731A - 建鲤原代肝细胞的分离培养方法

Info

Publication number: CN104293731A
Application number: CN201410535197.9A
Authority: CN
Inventors: 杜金梁; 曹丽萍; 殷国俊; 贾睿; 刘英娟; 申玉金; 赵才源
Original assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2014-10-13
Filing date: 2014-10-13
Publication date: 2015-01-21

Abstract

本发明公开了建鲤原代肝细胞的分离培养方法，选取健康无伤的建鲤，从建鲤尾静脉处采血，完毕后对鱼体表面消毒，放入超净台内无菌采集建鲤肝脏；用含双抗的PBS溶液漂洗，加入胰酶消化液，消化处理温度为26~28℃，时间为15-20min；消化结束后加入培养基A终止消化，消化液经过200目过滤网进行过滤，收集滤液；分别用50g和30g各离心5min，然后用培养基B进行洗涤2次，去除上清液，得到沉淀即为提取的肝细胞，制成细胞悬液，铺板培养。本实验方法简单快捷，能很大程度上节约分离时间，本实验所用分离时间大约为40min，且获得的肝细胞生长状况良好，红细胞数量少，细胞存活率在95%左右。

Description

建鲤原代肝细胞的分离培养方法

技术领域

本发明涉及一种建鲤原代肝细胞的分离培养方法，属于细胞生物学及生物技术领域。

背景技术

原代肝细胞的培养起源于上世纪40年代，肝细胞的成功培养被应用于许多领域，如肝细胞移植、生物人工肝等方面，关于肝细胞的分离方法，哺乳动物方面进展较快，有二步胶原酶灌流法、组织块培养法、酶消化法等；而鱼类肝细胞的分离与培养起步较晚，进展缓慢，主要采用二步灌流法和酶消化法。由于肝细胞具有完整的药物代谢酶体系，是药物生物转化的主要场所，因此肝细胞的体外培养在肝病研究中发挥着日益重要的作用，体外培养的原代肝细胞具有许多独特的优点，可同时获得大量性状较均一的样本，且培养体系中仅含实质细胞，便于人为控制培养条件，排除了许多复杂因素的干扰，基本保留了肝脏原有的代谢功能和细胞分化状态，存活时间长。因此肝细胞被广泛应用于药物的药理、毒理学的研究中。

目前，关于鱼类肝细胞的分离和培养方法，获得肝细胞数量少、分离时间长、红细胞偏多、活性差，不能够很好应用于实验研究中。

发明内容

本发明的目的是提供一种建鲤原代肝细胞的分离培养方法，本方法对现有肝细胞分离方法进行了改良，方法简单快捷，能很大程度上节约分离时间，且获得的肝细胞生长状况良好，红细胞数量少，细胞存活率在95%左右。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

建鲤原代肝细胞的分离培养方法，包括如下步骤：

1）选取健康无伤的建鲤，从建鲤尾静脉处采集血液，采血完毕后对鱼体表面消毒，放入超净台内无菌采集建鲤肝脏；

2）将步骤1）采集的建鲤肝脏用含双抗的PBS溶液漂洗，去除血块，修剪成小块，加入胰酶消化液，然后转移到装有玻璃珠的锥形瓶内，将锥形瓶置于水浴锅中进行消化，消化处理温度为26~28℃，时间为15-20min；

3）消化结束后加入含有体积分数10%胎牛血清的L-15培养基终止消化，消化液经过200目过滤网进行过滤，收集滤液；

4）将步骤3）的滤液采用梯度离心，分别用50g 和30g各离心5 min，然后用不含血清的L-15培养基进行洗涤2次，去除上清液，得到沉淀即为提取的肝细胞；

5）细胞培养板预处理，在细胞培养板每孔内滴入大鼠尾胶原溶液，使其均匀铺满孔底，然后放入CO₂培养箱中培养12~24 h，取出培养板，吸弃每孔内的大鼠尾胶原溶液，以 L-15培养基冲洗，吸净培养基，置 CO₂培养箱中备用；

6）将步骤4）提取的肝细胞加入含体积分数10%胎牛血清的L-15培养基中，制成细胞悬液，在步骤5）预处理好的细胞培养板上进行铺板操作，然后将铺好的细胞培养板放入CO₂培养箱中培养。

步骤1）中选取的野生建鲤的质量为80-100g。发明人通过多次摸索，总结出80-100g左右的幼鱼的肝脏分离后肝细胞活力较好，质量较高；可能是随着个体生长，其肝脏活性可能会下降，进而影响分离后肝细胞的活力强弱。

步骤2）中加入的胰酶消化液的体积为肝组织块体积的5倍。

步骤2）中修剪成小块的体积为1~3mm³。

步骤2）中所述玻璃珠的直径为2-4mm。加入玻璃珠可以促进组织与消化液的充分接触，消化时间较短，能够很好地保持细胞活力，通过实验摸索发现，消化时间和消化液浓度过高，会严重影响肝细胞活力。

步骤2）中消化处理温度为27℃，时间为15min；

步骤5）和步骤6）中的CO₂培养箱中温度为27℃，CO₂体积分数为5%。

步骤3）的滤液中主要是肝细胞，还有少量杂细胞，步骤4）中采用梯度离心可以起到纯化肝细胞的目的，洗涤的目的是尽可能多去除杂细胞。

步骤5）对细胞培养板预处理的目的是促进肝细胞的贴壁。

本发明中培养基选择稳定性较好的L-15培养基进行培养，可以避免培养基pH值变化过快给肝细胞的培养造成影响。

有益效果：

本实验方法对现有肝细胞分离方法进行了改良，方法简单快捷，能很大程度上节约分离时间，本实验所用分离时间大约为40min，且获得的肝细胞生长状况良好，红细胞数量少，细胞存活率在95%左右。且不用红细胞裂解液能够很好的去除大部分红细胞（使用红细胞裂解液虽然可以很好的去除红细胞，但是同时也会对肝细胞造成一定损伤，影响肝细胞活力，进而导致肝细胞活性较差，影响后续试验），生长状况良好，能够很好地满足实验需求，为后续试验的顺利开展奠定了基础。

附图说明

图1：刚分离出来的肝细胞12h在显微镜下观察呈现小亮点状态，肝细胞图片×100倍；

图2：肝细胞在24h，出现贴壁现象，肝细胞图片×100倍；

图3：肝细胞在72h，出现伸展变形现象，呈岛屿状生长，肝细胞图片×200倍。

具体实施方式

L-15培养基：购自于美国sigma公司；

培养基A: 含有体积分数10%胎牛血清的L-15培养基，配方为：L-15培养基1000ml、100ml新生胎牛血清FBS、10ml双抗、胰岛素10mg。

培养基B: 不含血清L-15培养基，配方为：L-15培养基1000ml、10ml双抗。

双抗(青霉素及链霉素溶液)，含有青霉素(10,000 IU/mL)和链霉素(10,000μg/mL)在100倍的工作浓度的混合液。

实施例1

实验材料及仪器消毒处理：

将实验所需的L-15培养基、大鼠尾胶原、胎牛血清、双抗、0.25%胰酶消化液、75%酒精、0.4%台盼蓝等试剂药品，剪刀、镊子、枪头、移液管、锥形瓶、玻璃珠、过滤器、计数板等进行灭菌消毒处理。（其中百分比均为体积百分比）

细胞培养板预处理：

细胞培养板预处理的目的是为了促进细胞的贴壁，取出细胞培养板，无菌条件下，在每孔内滴入200μL大鼠尾胶原溶液，轻晃使其均匀铺满孔底。把涂有胶原溶液的培养板放入CO₂培养箱（27℃、5%CO₂）中过夜。次日取出培养板至超净工作台中，吸弃每孔内的胶原溶液，再加入500 μL L-15培养基冲洗，以消除醋酸对建鲤肝细胞的影响，最后吸净培养基，置 CO₂培养箱中备用。

建鲤原代肝细胞的分离培养：

选取健康无伤质量为80-100g左右的野生建鲤进行实验 (通过多次实验证明，质量较小的鱼类获得的肝细胞活力较好)，于建鲤尾静脉处采集血液，尾静脉采血完毕后，在建鲤鳃脉弓处剪开放血，此处放血相当于动物上面的动脉血管，可以将鱼体内血液去除干净，这样培养出来的肝细胞会去除绝大部分红细胞，将血液去除干净可明显降低分离后肝细胞中红细胞数量，采血完毕后对鱼体表面用75%酒精进行消毒，放入超净台内无菌采取建鲤肝脏。

将肝脏放置于事先准备好的含双抗的PBS溶液（NaCl 8.0g、KCl 0.2g、 Na₂HPO₃·12H₂O 3.63g、KH₂PO₄0.24g、10mL双抗，加蒸馏水600mL 溶解，调 pH 至 7.2，再加蒸馏水定容到 1L，高压灭菌待用。）中进行漂洗，修剪，去除血块，然后将肝组织修剪成1mm³小块，加入5倍肝组织块体积的胰酶消化液，另外准备一只50mL锥形瓶，里面放入10颗直径2-4mm的玻璃珠，加入玻璃珠可以促进肝组织与酶消化液的充分接触（锥形瓶和玻璃珠均已进行洗涤灭菌处理），然后将肝组织转移至锥形瓶内，于27度水浴锅中进行消化，瓶口用灭菌消毒过的锡箔纸进行遮盖处理，防止外界污染物进入瓶内造成细胞污染，消化处理时间为15min，期间每隔2min进行摇晃一次，促进胰酶消化液与肝组织充分接触。

所用胰酶消化液浓度为0.125%，经过试验摸索如果浓度过大，会严重影响肝细胞活力，因此将0.25%的胰酶消化液与L-15培养基按1:1比例进行了稀释。（百分比是体积百分比）

消化结束后加入培养基A（含有体积分数10%胎牛血清的L-15培养基）1mL终止消化，以200目过滤网进行过滤，采用梯度离心法分别用50g 和30g离心5min，用培养基B(不含血清L-15培养基)进行洗涤2次，将上清液去掉，将沉淀中加入5mL培养基A制成细胞悬液，细胞存活率是采用细胞板计数得来的台盼蓝染色法（细胞悬液与0.5%台盼蓝染液按1∶1体积比混合，1 min后于血球计数板上计数，活细胞圆形透明，死细胞染成蓝色，用活细胞占计数细胞中的百分比表示细胞存活率）。计数结束后根据实验需要进行铺板操作，铺好的细胞培养板放入CO₂培养箱中培养，27℃、5%体积分数 CO₂ 条件下培养。刚分离出来的肝细胞，还没有贴壁，在显微镜下观察只是一个个“亮圈”，见图1；随着培养时间的增加，肝细胞开始贴壁、变形，出现伸展现象，见图2；72h后肝细胞连接紧密，出现岛屿状生长，见图3。本方法简单快捷，所用分离时间大约为40min，且获得的肝细胞生长状况良好，红细胞数量少，细胞存活率在95%左右。且不用红细胞裂解液能够很好的去除大部分红细胞（使用红细胞裂解液虽然可以很好的去除红细胞，但是同时也会对肝细胞造成一定损伤，影响肝细胞活力，进而导致肝细胞活性较差，影响后续试验）。

Claims

1.建鲤原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于包括如下步骤：

1）选取健康无伤的建鲤，从建鲤尾静脉处采集血液，并在建鲤鳃脉弓处剪开放血，完毕后对鱼体表面消毒，放入超净台内无菌采集建鲤肝脏；

3）消化结束后加入培养基A终止消化，消化液经过200目过滤网进行过滤，收集滤液；

4）将步骤3）的滤液采用梯度离心，分别用50g 和30g各离心5 min，然后用培养基B进行洗涤2次，去除上清液，得到沉淀即为提取的肝细胞；

6）将步骤4）提取的肝细胞加入培养基A中，制成细胞悬液，在步骤5）预处理好的细胞培养板上进行铺板操作，然后将铺好的细胞培养板放入CO₂培养箱中培养。

2.根据权利要求1所述的建鲤原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤1）中选取的野生建鲤的质量为80-100g。

3.根据权利要求1所述的建鲤原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤2）中加入的胰酶消化液的体积为肝组织块体积的5倍，胰酶消化液浓度为0.125%（体积百分比）。

4.根据权利要求1所述的建鲤原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤2）中修剪成小块的体积为1~3mm³。

5.根据权利要求1所述的建鲤原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤2）中所述玻璃珠的直径为2-4mm。

6.根据权利要求1所述的建鲤原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤2）中消化处理温度为27℃，时间为15-20min。

7.根据权利要求1所述的建鲤原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤5）和步骤6）中的CO₂培养箱中温度为27℃，CO₂体积分数为5%。

8.根据权利要求1所述的建鲤原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于：培养基A配方为：L-15培养基1000mL、100mL新生胎牛血清FBS、10mL双抗、胰岛素10mg。

9.根据权利要求1所述的建鲤原代肝细胞的分离培养方法，其特征在于：培养基B配方为：L-15培养基1000mL、10mL双抗。