CN105907706A - 一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法 - Google Patents

一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法，本发明的原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法获得细胞总量大，分离度高，活率高，而且细菌、真菌和其他细胞的污染概率低，同时还能够进行传代培养，为以大鼠结肠平滑肌细胞培养为基础的相关研究提供了良好的细胞培养方案。

Description

一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法。
背景技术
平滑肌收缩是胃肠蠕动中基本的运动方式。研究表明，肠平滑肌细胞在IL-1b和TNF-a的刺激下分泌IL-6，IL-6能显著诱发全身的炎症反应。利用结肠平滑肌细胞的培养，可以帮助了解收缩、增殖和胃肠道结缔组织对平滑肌细胞的反应。目前所用的结肠平滑肌培养技术，多数都是取自成年小鼠或大鼠的结肠组织，这样培养的细胞极大地增加了污染的概率。但是由于取材技术的特殊性，导致新生小鼠或大鼠的结肠组织不易操作。原代细胞培养的核心是，越年轻的个体，细胞存活率越高，有特殊年龄要求的除外。尤其是肌细胞，如：心肌、骨髂肌和平滑肌，对细胞外环境的要求比较高，同时又比较脆弱。这就更强调了选择新生小鼠或大鼠在成功培养出结肠平滑肌细胞中的重要性。既往的研究多采用组织块培养法培养。其缺点在于，首先，由于结肠内容物的存在，结肠平滑肌细胞的培养是非常容易遭受各种污染的，简单的清洗施以组织块培养法，完全无法控制各种细菌、真菌等污染；其次，细胞种类不纯，简单地使用组织块消化分离培养，导致了非结肠平滑肌细胞的很多其他细胞的混入，例如各种结缔组织细胞；最后，使用单一的胶原酶消化细胞，导致分离过程吹打较多，细胞分离度差且活性降低。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种高纯度、高活率、高活性同时低污染的原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法。
为了实现上述技术目的，本发明所采取的技术措施为：
一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
步骤1：清洗和预灌流
将离体的大鼠结肠使用含有2％双抗的37℃预热的D-Hanks溶液清洗结肠内容物后，使用针头被砂纸磨平的头皮针向结肠内灌注37℃预热的预灌流液，所述预灌流液配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/LNa2HPO4·12H2O，0.6mM/L的EGTA，2％双抗和1％两性霉素；
步骤2：冲洗灌流
将步骤1处理后的大鼠结肠使用37℃预热的冲洗灌流液灌流冲洗，所述冲洗灌流液的配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/LNa2HPO4·12H2O，3mM/L CaCl2，2％双抗和1％两性霉素；
步骤3：复合酶消化
将步骤2处理后的大鼠结肠置于37℃预热的复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；
步骤4：分离培养平滑肌细胞
将步骤3消化完毕的结肠使用37℃预热的D-Hanks溶液吹打洗脱，过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到大鼠结肠平滑肌细胞，使用含10％-20％胎牛血清、2％双抗的培养基在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。
为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，上述步骤1中预灌流的速度为2-8mL/min，预灌流时间为5-8分钟。
优选地，上述步骤2中冲洗灌流的速度为5-10mL/min，冲洗灌流时间为3-5分钟。
优选地，上述步骤3中复合酶消化液中各个酶的浓度均为1mg/ml。
优选地，上述步骤3中复合酶消化过程为在4℃条件下消化4-20h，或者在37℃条件下消化10min-2h。
优选地，上述步骤4的培养基选自DMEM培养基、Williams'medium E培养基或DMEM/F12培养基；更优选为DMEM培养基。
优选地，上述双抗为青霉素和链霉素。
另一方面，本发明还提供根据上述的原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法所培养的大鼠结肠平滑肌细胞。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
与现有的大鼠结肠平滑肌分离培养方法(如组织块消化法)相比，本发明的原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法进行了重大的改进，建立了成熟的高活率、低污染的原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法，同时使得获得的细胞培养时间长、分化好、细胞活力高。
本发明在分离细胞的操作中开创性的引入了灌流的方法。预灌流的预灌流液中添加了0.6mM/L的EGTA、双抗和两性霉素。EGTA一方面可以起到抗凝的作用(防止血凝块附着)，使灌流更充分，无灌流死角；另一方面，EGTA可以去除细胞间的Ca2+依赖性粘附因子，使细胞间连接变松散，提高所得平滑肌细胞的分离度。添加2％的双抗和两性霉素，可以有效地抑制组织或操作中存在的潜在的细菌和真菌污染。由于复合酶的包括多种胶原酶，而胶原酶的在具有Ca2+活化时可以达到最佳的消化效果，故本发明相应地引入了冲洗灌流的步骤，冲洗灌流液中含有CaCl2，Ca2+可以有效螯合预灌流液残存于的EGTA，同时提供足够的钙离子增加复合酶消化液中胶原酶的活性。另外，本发明使用复合酶消化液，复合酶消化液由I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶组成，相比传统单一的胶原酶，避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，尤其是对于平滑肌这样对缺血缺氧比较敏感的组织细胞。
附图说明
图1为普通显微镜视图下拍摄的本发明方法分离得到的大鼠结肠平滑肌细胞；
图2为使用荧光染色(DAPI)细胞的显微照片；
图3为使用荧光染色(a-SMA)细胞的显微照片；
图4为图2和图3合并的显微照片。
具体实施方式
本发明提供了一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
步骤1：清洗和预灌流
将离体的大鼠结肠使用含有2％双抗的37℃预热的D-Hanks溶液清洗结肠内容物后，使用针头被砂纸磨平的头皮针向结肠内灌注37℃预热的预灌流液，所述预灌流液配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/LNa2HPO4·12H2O，0.6mM/L的EGTA，2％双抗和1％两性霉素；
步骤2：冲洗灌流
将步骤1处理后的大鼠结肠使用37℃预热的冲洗灌流液灌流冲洗，所述冲洗灌流液的配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/LNa2HPO4·12H2O，3mM/L CaCl2，2％双抗和1％两性霉素；
步骤3：复合酶消化
将步骤2处理后的大鼠结肠置于37℃预热的复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；
步骤4：分离培养平滑肌细胞
将步骤3消化完毕的结肠使用37℃预热的D-Hanks溶液吹打洗脱，过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到大鼠结肠平滑肌细胞，使用含10％-20％胎牛血清、2％双抗的培养基在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1
本实施例以新生SD大鼠为细胞来源，首先颈椎脱臼处死，酒精浸泡5分钟，开腹，自肛门上1cm取结肠至盲肠，见到阑尾即止。取材时注意剥去肠系膜。将取下的结肠组织浸泡在含2％青链霉素的PBS里，放在冰上保存。将离体的大鼠结肠使用含有2％双抗的37℃预热的D-Hanks溶液清洗结肠内容物。然后取最小号的头皮针，用砂纸将前端磨平，以防针尖戳破结肠组织。将头皮针向结肠内灌注37℃预热的预灌流液，预灌流的速度为5mL/min，预灌流时间为5分钟，预灌流液配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/LNa2HPO4·12H2O，0.6mM/L的EGTA，2％双抗和1％两性霉素；经过预灌流后，结肠变成白色，没有内容物残留。
将灌洗后变白的结肠组织的包膜剥离，然后剪开，加入复合酶消化液(I型胶原酶+II型胶原酶+IV型胶原酶+Dispase酶＝1:1:1:1)，4种酶的初始浓度均为1mg/ml。在4度冰箱过夜，便于酶与组织充分结合，使组织松散，细胞容易剥离。这样可以避免消化过程中，对组织的吹打过于频繁和过于粗暴，对细胞造成极大的伤害。第2天，将组织从冰箱中取出，稍微吹打几次，放入37度水浴15分钟，再次轻微吹打不超过5次，过70um筛网。
取过筛后的细胞滤液，根据体积加入对等的PBS，400g离心5分钟，即可获得纯化的大鼠结肠平滑肌细胞，然后用0.2％台盼兰计数活细胞数，接种培养。
由于平滑肌细胞的特殊性，在原代培养、传代和复苏的第一天，用含20％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM培养基。其它时间，用含10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM培养基。
二维培养
将纯化的小鼠或大鼠结肠平滑肌细胞用上述培养基重悬，制得结肠平滑肌细胞重悬液，加入到T25培养瓶中进行培养，接种密度为0.5*106/瓶。置于37度，5％CO2的培养箱中进行培养。每3天更换新的培养基，每天于显微镜下观察细胞生长情况，至细胞融合度达70％～80％，进行传代培养。
传代培养
当细胞融合度达70％～80％时，每瓶细胞加0.25％胰酶-EDTA1ml，在37度培养箱中孵育消化2分钟。显微镜下观察，当细胞变圆、间隙增大时，用含血清的培养基终止消化，并将细胞吹打下来。400g离心5分钟，获得的细胞再加入含20％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM培养基，接种于T25培养瓶中，接种密度为0.5*106/瓶。置于37度，5％CO2的培养箱中继续扩增培养。每3天更换新的培养基，每天于显微镜下观察细胞生长情况。
其他检测
进行荧光染色检测，同时记录细胞的污染情况等。
对比实施例
对比实施例采用传统的组织块消化法，获得结肠组织后，冲洗组织，将结肠内容物冲出，在无菌操作下剪碎，并使用II胶原酶消化过夜，使用缓冲液吹打组织，分散细胞，过筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到大鼠结肠平滑肌细胞，细胞计数后，加入到T25培养瓶中进行培养，接种密度为0.5*106/瓶，置于37度，5％CO2的培养箱中进行培养并观察。
上述的实施例和对比例实验，申请人进行了多次实验，并进行了相关指标的比较和数据统计。如表1所示：
表1
通过显微图片(图1-图4)的细胞形态也可以看出，本发明的方法分离培养的平滑肌细胞，饱满健康，分离度高。
由此可以看出，本发明的原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法获得细胞总量大，分离度高，活率高，而且细菌、真菌和其他细胞的污染概率低，同时还能够进行传代培养，为以结肠平滑肌细胞培养为基础的相关研究提供了良好的细胞培养方案。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：清洗和预灌流
将离体的大鼠结肠使用含有2％双抗的37℃预热的D-Hanks溶液清洗结肠内容物后，使用针头被砂纸磨平的头皮针向结肠内灌注37℃预热的预灌流液，所述预灌流液配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/LNa2HPO4·12H2O，0.6mM/L的EGTA，2％双抗和1％两性霉素；
步骤2：冲洗灌流
将步骤1处理后的大鼠结肠使用37℃预热的冲洗灌流液灌流冲洗，所述冲洗灌流液的配方为15mM/L HEPES，127.8mM/L NaCl，3mM/L KCl，0.7mM/LNa2HPO4·12H2O，3mM/L CaCl2，2％双抗和1％两性霉素；
步骤3：复合酶消化
将步骤2处理后的大鼠结肠置于37℃预热的复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；
步骤4：分离培养平滑肌细胞
将步骤3消化完毕的结肠使用37℃预热的D-Hanks溶液吹打洗脱，过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到大鼠结肠平滑肌细胞，使用含10％-20％胎牛血清、2％双抗的培养基在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。
2.根据权利要求1所述的一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤1中预灌流的速度为2-8mL/min，预灌流时间为5-8分钟。
3.根据权利要求1所述的一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤2中冲洗灌流的速度为5-10mL/min，冲洗灌流时间为3-5分钟。
4.根据权利要求1所述的一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤3中复合酶消化液中各个酶的浓度均为1mg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤3中复合酶消化过程为在4℃条件下消化4-20h。
6.根据权利要求1所述的一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤3中复合酶消化过程为在37℃条件下消化10min-2h。
7.根据权利要求1所述的一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤4的培养基选自DMEM培养基、Williams'medium E培养基或DMEM/F12培养基。
8.根据权利要求7所述的一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤4的培养基为DMEM培养基。
9.根据权利要求1所述的一种原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述双抗为青霉素和链霉素。
10.一种根据权利要求1-9任意一项所述的原代大鼠结肠平滑肌细胞的分离培养方法所培养的大鼠结肠平滑肌细胞。
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