CN105907708A - 一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法 - Google Patents

一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，采用特制的复合酶进行长期消化，使得获得细胞总量大，分离度高，活率高；由于采集方式的不同，杜绝了心脏内残留血液的污染和影响，使得本发明的方法获得的心肌细胞细菌、真菌和其他细胞的污染概率极低，同时还能够进行传代培养，为以心肌培养为基础的相关研究提供了良好的细胞培养解决方案。

Description

一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法。
背景技术
心肌细胞是机体最具有能量的细胞，属于高含氧细胞，拥有大量的线粒体。心肌细胞占心脏体积的75％，但数目仅为心脏总细胞量的三分之一。虽然分化的心肌细胞很难增殖，然而，通过Ras/MEK通路的a-1肾上腺素的刺激，心脏可出现过度肥厚。所有心肌细胞的胞膜都可以自发性地产生有节律的去极化和复极化。心肌细胞的收缩属于肌源性的，不依赖神经的刺激。心肌细胞中存在一个复杂的网络信号系统，可以调节心脏有节律的舒缩。心衰时心肌收缩功能的缺失，会导致心肌细胞的肥大和凋亡。更好地理解和研究心脏网络信号系统的功能，将有助于深入了解心肌细胞死亡的内在机制，而心肌细胞的培养，是上述研究的基础。
目前，国内外已经有大量的研究者进行了小鼠/大鼠心肌细胞的培养和药理学特性方面的研究，既往的研究多采用胰酶消化法培养。其缺点在于：
首先，胰酶对心肌组织细胞的伤害极大，很难控制消化时间和吹打的力度，容易导致的结果往往是，细胞活力差，死细胞特别多，贴壁细胞很少，且很少有细胞能观察到搏动。即使有部分细胞搏动，占总细胞数的比例也很低，多数都是心肌成纤维细胞。且伴随细胞的传代，心肌细胞的数目会越来越少，心肌成纤维的占比会越来越大，严重影响实验结果。
其次，由于心脏采集过程的特殊性，即使是外部冲洗加上心脏自身节律性收缩排出心脏内大部分血液，但是仍不足以清楚血液污染，所以在去心肌细胞组织块时，往往混入少量血液，而此部分血液大大增加了后续细胞培养过程中各种细菌、细胞、真菌污染的可能性。为了完全克服此部分血液污染的影响，本领域技术人员常用心脏灌流的方法，然而小鼠/大鼠的心脏灌流操作难度负责、耗时长，并不适合应用。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种针对大鼠或小鼠的心肌细胞，不但可以杜绝心脏内剩余血液的污染，同时还可以得到高纯度、高活率、高活性的原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法。
为了实现上述技术目的，本发明所采取的技术措施为：
一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
步骤1：心脏的预处理
清理离体的心脏，并利用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗；
步骤2：取心肌细胞
使用活检针刺入步骤1处理后的心脏的左心室壁，切取心肌细胞；
步骤3：酶消化
将步骤2获得的心肌细胞置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；
步骤4：分离培养心肌细胞
将步骤3消化完毕的心肌细胞过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到心肌细胞，使用含10％-20％胎牛血清、2％双抗的培养基在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。
为了优化上述分离培养方法，本发明所采取的技术措施还包括：
优选地，上述步骤1中清理离体的心脏的操作为使用眼科剪剥除心脏周围的残留心包和结缔组织。
优选地，上述步骤2中使用的活检针为半自动或全自动活检针。
优选地，上述步骤3中复合酶消化液中各个酶的初始浓度均为1mg/ml。
优选地，上述步骤3中酶消化过程为使用4℃复合酶消化液消化4-20h；或者使用37℃预热的复合酶消化液消化10min-2h。
优选地，上述步骤4的培养基选自DMEM培养基、Williams'medium E培养基或DMEM/F12培养基；更优选为DMEM培养基。
优选地，上述双抗为1％青链霉素。
另一方面，本发明还提供一种根据上述的原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法所培养的小鼠或大鼠心肌细胞。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
首先，针对心肌细胞分离过程的特殊性，冲洗后直接采用活检针在心室壁内采集心肌细胞，不但成功的避免了心脏内残存血液的污染，更使得获得的心肌细胞纯度大大提升，基本无其他细胞的参杂。其次，本发明的原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，使用的为申请人特殊制备的复合酶消化液，复合酶消化液由I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶组成，并使用4℃条件过夜消化(4-20h)，相比传统单一的胶原酶预热消化，不但避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，而且消化的更均匀透彻。综上所述，本发明的的原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，能够获得高纯度、高活率、高活性同时污染风险极低的原代小鼠或大鼠心肌细胞，培养的细胞分化好、细胞活力高，具有较大的推广意义。
附图说明
图1为本发明的分离培养方法得到的小鼠心肌细胞显微照片(10X)；
具体实施方式
本发明提供了一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
步骤1：心脏的预处理
清理离体的心脏，并利用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗；
步骤2：取心肌细胞
使用活检针刺入步骤1处理后的心脏的左心室壁，切取心肌细胞；
步骤3：酶消化
将步骤2获得的心肌细胞置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；
步骤4：分离培养心肌细胞
将步骤3消化完毕的心肌细胞过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到心肌细胞，使用含10％-20％胎牛血清、2％双抗的培养基在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1
本实施例采用SD大鼠，使用本发明的分离培养方法分离心肌细胞，具体步骤如下：
1.大鼠心脏的获取
首先处死新生大鼠(颈椎脱臼)，酒精浸泡5分钟，在解剖显微镜下，打开胸腔，充分暴露心脏。用镊子夹紧心脏根部，靠近心房部位的血管，将完整的心脏剪取下来，尽量不要夹到心室部分的组织，因为心肌细胞对钳夹非常敏感，易导致钳夹部位的心肌细胞死亡。清理心包和其他附带的结缔组织，并利用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗。
2.取心肌细胞
在解剖显微镜下，使用小型的活检针刺入处理后的心脏的左心室壁内，然后切取内部心肌细胞。此步骤的操作还可以是，第一次刺入后，移除切取得到的心肌细胞，然后再沿着原来的路径切取内部的心肌细胞，此举可以将心脏外的包膜细胞也排除。
3.酶消化
多次执行上述切取步骤，获得足够的心肌细胞后，将获得心肌细胞加入复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶，4种酶的初始浓度均为1mg/ml。在4度冰箱过夜，便于酶与组织充分结合，使组织松散，细胞容易剥离。这样可以避免消化过程中，对组织的吹打过于频繁和过于粗暴，对细胞造成极大的伤害。第2天，将组织从冰箱中取出，稍微吹打几次，放入37度水浴15分钟，再次轻微吹打不超过5次，过70um筛网。
4.离心纯化
取过筛后的细胞滤液，根据体积加入对等的PBS，400g离心5分钟，即可获得纯化的小鼠或大鼠心肌细胞，然后用0.2％台盼兰计数活细胞数。
5.培养基配制
由于心肌细胞的特殊性，在原代培养、传代和复苏的第一天，用含20％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM培养基。其它时间，用含10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM培养基。
6.二维培养
将纯化的小鼠或大鼠心肌细胞用上述培养基重悬，制得心肌细胞重悬液，加入到T25培养瓶中进行培养，接种密度为0.5*106/瓶。置于37度，5％CO2的培养箱中进行培养。为了充分去除可能存在的心肌成纤维细胞，根据差速贴壁的原理，分别在细胞接种后的1小时和2小时，将细胞悬液更换至新的培养瓶，这样便可在第3个培养瓶中获得纯化的心肌细胞。第2天更换培养基为含10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM培养基。每3天更换新的培养基，每天于显微镜下观察细胞生长情况，至细胞融合度达70％～80％，进行传代培养。
7.传代培养
当细胞融合度达70％～80％时，每瓶细胞加0.25％胰酶-EDTA 1ml，在37度培养箱中孵育消化2分钟。显微镜下观察，当细胞变圆、间隙增大时，用含血清的培养基终止消化，并将细胞吹打下来。400g离心5分钟，获得的细胞再加入含20％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM培养基，接种于T25培养瓶中，接种密度为0.5*106/瓶。置于37度，5％CO2的培养箱中继续扩增培养。第2天更换培养基为含10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM培养基。每3天更换新的培养基，每天于显微镜下观察细胞生长情况。
8.细胞形态观察
使用显微镜观察细胞形态，如图1所示，心肌细胞分离度较好、活力较高、生长良好。
9.其他相关指标测定
培养期间测定细菌及真菌污染情况、细胞污染情况、统计细胞活率等。
对比实施例
对比实施例采用传统的组织块消化法，分离获得心脏后，剥离去除其他连带组织，使用含有双抗的PBS冲洗，待心脏将残存的血液泵出大部分后，再次清洗。然后在无菌操作下将心脏剪碎，并使用II胶原酶37℃消化2h，使用缓冲液吹打组织，分散细胞，过筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到小鼠心肌细胞，细胞计数后，加入到T25培养瓶中进行培养，接种密度为0.5*106/瓶，置于37度，5％CO2的培养箱中进行培养并观察和测定相关指标。
上述的实施例和对比例实验，申请人进行了多次实验，并进行了相关指标的比较和数据统计。如表1所示：
表1
同时申请人使用小鼠进行了若干次实验，实验结果同大鼠相同，证明本发明的方法对大鼠和小鼠的心肌分离培养的良好效果真实有效。
综上所述，本发明的原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，采用特制的复合酶进行长期消化，使得获得细胞总量大，分离度高，活率高；由于采集方式的不同，杜绝了心脏内残留血液的污染和影响，使得本发明的方法获得的心肌细胞细菌、真菌和其他细胞的污染概率极低，同时还能够进行传代培养，为以心肌培养为基础的相关研究提供了良好的细胞培养解决方案。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：心脏的预处理
清理离体的心脏，并利用含双抗和两性霉素B的D-hanks溶液冲洗；
步骤2：取心肌细胞
使用活检针刺入步骤1处理后的心脏的左心室壁，切取心肌细胞；
步骤3：酶消化
将步骤2获得的心肌细胞置于复合酶消化液中消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；
步骤4：分离培养心肌细胞
将步骤3消化完毕的心肌细胞过70um筛网，进行离心洗涤，然后进行重悬并再次离心，最后用无血清培养液再次重悬，分离得到心肌细胞，使用含10％-20％胎牛血清、2％双抗的培养基在37℃5％CO2的培养箱中进行培养。
2.根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤1中清理离体的心脏的操作为使用眼科剪剥除心脏周围的残留心包和结缔组织。
3.根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤2中使用的活检针为半自动或全自动活检针。
4.根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤3中复合酶消化液中各个酶的初始浓度均为1mg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤3中酶消化过程为使用4℃复合酶消化液消化4-20h。
6.根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤3中酶消化过程为使用37℃预热的复合酶消化液消化10min-2h。
7.根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤4的培养基选自DMEM培养基、Williams'medium E培养基或DMEM/F12培养基。
8.根据权利要求7所述的一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述步骤4的培养基为DMEM培养基。
9.根据权利要求1所述的一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，其特征在于，所述双抗为1％青链霉素。
10.一种根据权利要求1-9任意一项所述的原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法所培养的小鼠或大鼠心肌细胞。
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