CN108410802A - 一种大鼠心房肌细胞培养方法 - Google Patents

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李慧
范振峰
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Abstract

本发明公开了一种大鼠心房肌细胞的培养方法，属于细胞培养技术领域。所述培养方法包括取材、消化、分离、离心、接种培养等步骤，本发明的大鼠心房肌细胞的培养方法成本低，高效、稳定，分离出的细胞活力好，纯度高，心房肌细胞数量大、产量高；本发明的方法在培养过程中加大了对细胞的保护作用，提高了细胞活性，细胞存活率高；培养过程中不使用青霉素和Brdu等药物，从而能够避免青霉素和Brdu对后续研究的潜在影响。

Description

一种大鼠心房肌细胞培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种大鼠心房肌细胞的培养方法。
背景技术
心房肌细胞培养模型可以排除在体实验多种干扰因素的影响，在特定环境下研究目的因子对心房肌细胞的作用。利用体外培养的心房肌细胞建立多种病理生理模型，有利于从细胞和分子生物学水平研究心血管疾病的发明机制和预防手段。然而，心房肌细胞在分离、消化、离心等过程中容易受损，也极少分裂，不易传代，因此需要找到一种可以提高心房肌细胞数量和高存活率的心房肌细胞的培养方法。
发明内容
为解决背景技术中存在的技术问题，本发明目的在于提供一种高效、稳定，分离出的细胞活性高，产量大、存活率高的大鼠心房肌细胞的培养方法。
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种大鼠心房肌细胞的培养方法，包括以下步骤：
（1）取材：取大鼠活体心脏，保持取下心脏后仍然跳动，迅速从左心室灌注无菌PBS缓冲液，将心脏内血液冲洗干净，在超净台下，显微手术器械打开右心房，剥离心房内壁薄膜，用显微剪剥离肌层，用显微剪剪碎成 1mm3体积大小组织块；
（2）消化
A.胰酶消化：用0.25%胰酶-EDTA消化上述剪好的组织团块1min，再加入消化液体积1-1.5倍的含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基，终止消化；
B.综合酶消化：800rpm离心3min，去掉上清，加入综合酶消化液，消化10min，然后加入消化液体积1-1.5倍的含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基，终止消化，用移液器吸头轻柔吹打3-5次，至组织分离，无明显组织团块，细胞均匀分散；
（3）分离：800rpm离心3min，去掉上清，加入培养基DMEM/F12+10% FBS，重悬细胞，移液器吸头吹打3-5次，制成单细胞悬液，镜下细胞计数，以5×105/孔，接种6孔板，轻柔摇晃混匀后，放入37℃培养箱，7h后差时贴壁，将上清缓慢吸出；
（4）接种培养：800rpm离心3min，去除上清，加入心房肌细胞专用培养基，接种至包被有多聚赖氨酸的新的6孔板中，放置在37℃，5% CO2培养箱中常规培养，36h后半量换液，之后每24h半量换液一次，5d后，α-actin染色鉴定心房肌细胞。
进一步的，步骤（1）中的打开右心房为右心耳部位。
进一步的，步骤（2）的综合酶消化液为2%木瓜蛋白酶+1% IV型胶原酶。
进一步的，步骤（2）中胰酶消化温度为37℃，消化过程中50rpm摇晃；综合酶消化温度为37℃，消化过程中100rpm摇晃。
进一步的，步骤（2）胰酶消化和综合酶消化过程中，加入的含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基为消化液体积的1.2倍。
进一步的，步骤（4）中将上清缓慢吸出的过程中不触及板底。
进一步的，步骤（4）中心房肌细胞专用培养基为：DMEM/F12+10% FBS+10nM PDGF重组大鼠蛋白+5nM EGF重组大鼠蛋白。
进一步的，步骤（4）中所用多聚赖氨酸分子量3W-7W。
进一步的，步骤（4）中换液的液体为心房肌细胞专用培养基。
本发明的有益效果：
本发明消化采用胰酶和综合酶消化液两步进行，相比传统方法，更为温和，对心房肌细胞有独特作用，配合操作手法和取材部位，提高心房肌细胞的获得率和纯度，更好的排除血管内皮细胞等杂细胞的干预，细胞团块的消化分离更为彻底。本发明的方法成本低，高效、稳定，分离出的细胞活力好，纯度高，心房肌细胞数量大、产量高；本发明的方法在培养过程中加大了对细胞的保护作用，提高了细胞活性，细胞存活率高；培养过程中不使用青霉素和Brdu等药物，从而能够避免青霉素和Brdu对后续研究的潜在影响。
附图说明
图1培养的大鼠心房肌细胞形态显微图；
图2培养的大鼠心房肌细胞α-actin免疫荧光染色图。
具体实施方式
实施例1
一种大鼠心房肌细胞的培养方法，包括以下步骤：
（1）取材：取大鼠活体心脏，保持取下心脏后仍然跳动，迅速从左心室灌注无菌PBS缓冲液，将心脏内血液冲洗干净，在超净台下，显微手术器械打开右心房的右心耳部位，剥离心房内壁薄膜，用显微剪剥离肌层，用显微剪剪碎成 1mm3体积大小组织块；
（2）消化
A.胰酶消化：用0.25%胰酶-EDTA消化上述剪好的组织团块1min，消化温度为37℃，消化过程中50rpm摇晃，再加入消化液体积1.2倍的含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基，终止消化；
B.综合酶消化：800rpm离心3min，去掉上清，加入综合酶消化液即2%木瓜蛋白酶+1% IV型胶原酶，消化10min，消化温度为37℃，消化过程中100rpm摇晃，然后加入消化液体积1.2倍的含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基，终止消化，用移液器吸头轻柔吹打3次，可见组织已分离为单细胞，无明显组织团块，细胞均匀分散，显微镜下观察，经过消化的心房肌细胞，几乎不见细胞团块；；
（3）分离：800rpm离心3min，去掉上清，加入培养基DMEM/F12+10% FBS，重悬细胞，移液器吸头吹打3次，制成单细胞悬液，镜下细胞计数，以5×105/孔，接种6孔板，轻柔摇晃混匀后，放入37℃培养箱，7h后差时贴壁，将上清缓慢吸出且过程中不触及板底；
（4）接种培养：800rpm离心3min，去除上清，加入组成为“DMEM/F12+10% FBS+10nM PDGF重组大鼠蛋白+5nM EGF重组大鼠蛋白，”的心房肌细胞专用培养基，接种至包被有分子量为3W多聚赖氨酸的新的6孔板中，放置在37℃，5% CO2培养箱中常规培养，36h后用心房肌细胞专用培养基半量换液，之后每24h半量换液一次，5d后，α-actin染色鉴定心房肌细胞。
显微镜下，可见心房肌细胞形态较好，细胞活力佳（显微镜拍照如图1），α-actin免疫荧光染色呈阳性（如图2所示），阳性率达93%以上。
实施例2
一种大鼠心房肌细胞的培养方法，包括以下步骤：
（1）取材：取大鼠活体心脏，保持取下心脏后仍然跳动，迅速从左心室灌注无菌PBS缓冲液，将心脏内血液冲洗干净，在超净台下，显微手术器械打开右心房的右心耳部位，剥离心房内壁薄膜，用显微剪剥离肌层，用显微剪剪碎成 1mm3体积大小组织块；
（2）消化
A.胰酶消化：用0.25%胰酶-EDTA消化上述剪好的组织团块1min，消化温度为37℃，消化过程中50rpm摇晃，再加入消化液体积1.5倍的含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基，终止消化；
B.综合酶消化：800rpm离心3min，去掉上清，加入综合酶消化液即2%木瓜蛋白酶+1% IV型胶原酶，消化10min，消化温度为37℃，消化过程中100rpm摇晃，然后加入消化液体积1.2倍的含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基，终止消化，用移液器吸头轻柔吹打5次，可见组织已分离为单细胞，无明显组织团块，细胞均匀分散，显微镜下观察，经过消化的心房肌细胞，几乎不见细胞团块；；
（3）分离：800rpm离心3min，去掉上清，加入培养基DMEM/F12+10% FBS，重悬细胞，移液器吸头吹打5次，制成单细胞悬液，镜下细胞计数，以5×105/孔，接种6孔板，轻柔摇晃混匀后，放入37℃培养箱，7h后差时贴壁，将上清缓慢吸出且过程中不触及板底；
（4）接种培养：800rpm离心3min，去除上清，加入组成为“DMEM/F12+10% FBS+10nM PDGF重组大鼠蛋白+5nM EGF重组大鼠蛋白，”的心房肌细胞专用培养基，接种至包被有分子量为7W多聚赖氨酸的新的6孔板中，放置在37℃，5% CO2培养箱中常规培养，36h后用心房肌细胞专用培养基半量换液，之后每24h半量换液一次，5d后，α-actin染色鉴定心房肌细胞。
显微镜下，可见心房肌细胞形态较好，细胞活力佳，α-actin免疫荧光染色呈阳性，阳性率达90%以上。

Claims (9)

1.一种大鼠心房肌细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取材：取大鼠活体心脏，保持取下心脏后仍然跳动，迅速从左心室灌注无菌PBS缓冲液，将心脏内血液冲洗干净，在超净台下，显微手术器械打开右心房，剥离心房内壁薄膜，用显微剪剥离肌层，用显微剪剪碎成 1mm3体积大小组织块；
（2）消化
A.胰酶消化：用0.25%胰酶-EDTA消化上述剪好的组织团块1min，再加入消化液体积1-1.5倍的含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基，终止消化；
B.综合酶消化：800rpm离心3min，去掉上清，加入综合酶消化液，消化10min，然后加入消化液体积1-1.5倍的含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基，终止消化，用移液器吸头轻柔吹打3-5次，至组织分离，无明显组织团块，细胞均匀分散；
（3）分离：800rpm离心3min，去掉上清，加入培养基DMEM/F12+10% FBS，重悬细胞，移液器吸头吹打3-5次，制成单细胞悬液，镜下细胞计数，以5×105/孔，接种6孔板，轻柔摇晃混匀后，放入37℃培养箱，7h后差时贴壁，将上清缓慢吸出；
（4）接种培养：800rpm离心3min，去除上清，加入心房肌细胞专用培养基，接种至包被有多聚赖氨酸的新的6孔板中，放置在37℃，5% CO2培养箱中常规培养，36h后半量换液，之后每24h半量换液一次，5d后，α-actin染色鉴定心房肌细胞。
2.根据权利要求1所述的大鼠心房肌细胞的培养方法，其特征在于，步骤（1）中的打开右心房为右心耳部位。
3.根据权利要求1所述的大鼠心房肌细胞的培养方法，其特征在于：步骤（2）的综合酶消化液为2%木瓜蛋白酶+1% IV型胶原酶。
4.根据权利要求1所述的大鼠心房肌细胞的培养方法，其特征在于：步骤（2）中胰酶消化温度为37℃，消化过程中50rpm摇晃；综合酶消化温度为37℃，消化过程中100rpm摇晃。
5.根据权利要求1所述的大鼠心房肌细胞的培养方法，其特征在于：步骤（2）胰酶消化和综合酶消化过程中，加入的含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基为消化液体积的1.2倍。
6.根据权利要求1所述的大鼠心房肌细胞的培养方法，其特征在于：步骤（4）中将上清缓慢吸出的过程中不触及板底。
7.根据权利要求1所述的大鼠心房肌细胞的培养方法，其特征在于：步骤（4）中心房肌细胞专用培养基为：DMEM/F12+10% FBS+10nM PDGF重组大鼠蛋白+5nM EGF重组大鼠蛋白。
8.根据权利要求1所述的大鼠心房肌细胞的培养方法，其特征在于：步骤（4）中所用多聚赖氨酸分子量3W-7W。
9.根据权利要求1所述的大鼠心房肌细胞的培养方法，其特征在于：步骤（4）中换液的液体为心房肌细胞专用培养基。
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