CN114621922A - 一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法 - Google Patents
一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114621922A CN114621922A CN202210137145.0A CN202210137145A CN114621922A CN 114621922 A CN114621922 A CN 114621922A CN 202210137145 A CN202210137145 A CN 202210137145A CN 114621922 A CN114621922 A CN 114621922A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rat
- schwann cells
- cavernous
- concentration
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 title claims abstract description 65
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title description 5
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 25
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 claims description 25
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 16
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 15
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 14
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 claims description 12
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 101001109800 Homo sapiens Pro-neuregulin-1, membrane-bound isoform Proteins 0.000 claims description 11
- 102000055650 human NRG1 Human genes 0.000 claims description 11
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims description 10
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 claims description 10
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims description 10
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 9
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 9
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 9
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 claims description 9
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 9
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 claims description 8
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims description 8
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 7
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 7
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 7
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 7
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 claims description 6
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 5
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 claims description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 claims description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 claims description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 claims description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 3
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 abstract 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 23
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 23
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000003497 sciatic nerve Anatomy 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 208000010886 Peripheral nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 241000243172 Spongilla Species 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000000562 peritoneum layer Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000007651 self-proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/06—Anti-neoplasic drugs, anti-retroviral drugs, e.g. azacytidine, cyclophosphamide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及施旺细胞的培养，具体是一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，其包括取大鼠的海绵体神经；剥离上述海绵体神经上附着的血管与结缔组织；将剥离干净的海绵体神经进行组织消化，消化后轻柔吹打消化液至未见明显组织块，以制备成单细胞悬液；将上述单细胞悬液过滤，滤液离心得到沉淀，然后用含FBS的DMEM高糖培养基重悬沉淀；再取重悬液培养，纯化、扩增培养，得到施旺细胞。本发明剪取成年SD大鼠的海绵体神经，并进行培养、纯化、扩增培养等方法，以获得施旺细胞；该方法通过成年SD大鼠海绵体神经提取原代施旺细胞进行原代培养，可获得稳定传代的高纯度原代施旺细胞，从而拓展了施旺细胞的来源，为海绵体神经相关疾病的科学研究提供了最佳的种子细胞。
Description
技术领域
本发明涉及施旺细胞的培养，具体说是一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法。
背景技术
施旺细胞是周围神经系统特有的胶质细胞，其发育的终点是形成髓鞘细胞和非髓鞘细胞，分别包裹大直径和小直径轴突。施旺细胞在外周神经损伤后起重要作用，通过自身增殖、分泌神经营养因子或外泌体等方式促进受损的轴突再生修复。由于原代细胞能保留原有组织微环境的特征，因此对于海绵体神经损伤相关疾病研究而言，海绵体神经来源施旺细胞是此领域科学研究的最佳种子细胞。然而，现有技术中大鼠原代施旺细胞的提取主要来源于坐骨神经，并且现有提取方法存在着所得施旺细胞纯度偏低、成纤维细胞残留较多等问题。另一方面，坐骨神经与海绵体神经存在结构与组织微环境的差异，且海绵体神经十分纤细，较坐骨神经体积相差一个数量级左右，存在施旺细胞获取量低的问题，不利于原代施旺细胞的提纯培养及后续研究。同时，目前尚无相关文献报道大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，该方法具有操作易、周期短、成本低的特点，通过该方法可获得稳定传代的高纯度原代施旺细胞。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，其包括以下步骤：
（1）解剖提取大鼠的海绵体神经；
（2）剥离上述海绵体神经上附着的血管与结缔组织；
（3）将剥离干净的海绵体神经剪切成0.4～0.6mm的小段，然后用含I型胶原酶与胰蛋白酶的消化液进行组织消化，消化后轻柔吹打消化液至未见明显组织块，以制备成单细胞悬液；
（4）将上述单细胞悬液过滤，滤液离心得到沉淀，然后用含FBS的DMEM高糖培养基重悬沉淀；再取重悬液于经多聚赖氨酸氢溴酸溶液和层粘蛋白溶液处理过的35mm培养皿，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱培养；
（5）采用步骤（4）培养24h后，去除旧培养基，更换含FBS和Arac的DMEM高糖培养基，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱继续培养48h，然后去除旧培养基，更换含FBS、青霉素/链霉素、Forskolin和重组人heregulinβ-1的DMEM高糖培养基，再置于37℃、5% CO2的细胞培养箱进行扩增培养，得到施旺细胞。
作为优选，所述消化液为含0.1% I型胶原酶与0.25% 胰蛋白酶的L-15基础培养基。
作为优选，消化反应温度为36.5～37.5℃，消化时间为30～50 分钟，且每隔5～10分钟轻柔震荡一次。
作为优选，所述单细胞悬液采用40～70μm的细胞滤网进行过滤，滤液离心时的离心力为350～400 g，离心时间为5～8 分钟。
作为优选，所述含FBS的DMEM高糖培养基中FBS浓度为9～11％w/v，葡萄糖浓度4.5g/L；所述多聚赖氨酸氢溴酸浓度为0.01% w/v，分子量为70000～150000；层粘蛋白浓度为1～2μg/ml。
作为优选，所述含FBS和Arac的DMEM高糖培养基中FBS浓度为9～11％w/v，Arac浓度为9～11μM，葡萄糖浓度4.5g/L；所述含FBS、Forskolin和重组人heregulinβ-1的DMEM高糖培养基中FBS浓度为9～11％w/v，青霉素/链霉素浓度为0.9～1.0%， Forskolin浓度为2～2.5μM，重组人heregulinβ-1浓度为9.5～10.5 ng/ml，葡萄糖浓度4.5g/L。
作为优选，取大鼠的海绵体神经时，先选取SPF级SD大鼠10-12周龄，雄性，体重为300-350g；然后向大鼠腹腔注射麻醉剂，待大鼠麻醉稳定后，将大鼠仰卧位固定在手术台上，腹部除毛，碘伏消毒，铺巾，75%的酒精脱碘；接着用手术刀在大鼠下腹部正中线切开皮肤，然后用电刀逐层切开皮下脂肪、肌肉及腹膜进入腹腔，再用大鼠腹部撑开器撑开腹腔以暴露手术视野，找到大鼠前列腺，沿前列腺两侧找到大鼠盆腔神经节及海绵体神经，然后用显微器械游离并剪取海绵体神经。
作为优选，所述麻醉剂为3%w/v戊巴比妥钠生理盐水溶液，麻醉剂量为1.5～2ml/kg；游离海绵体神经的长度为10～15mm。
作为优选，在取大鼠的海绵体神经前须对手术过程中使用的器械进行灭菌消毒备用，灭菌消毒方法为121℃高压灭菌20～40min。
作为优选，在预冷的无菌Hank’s平衡盐溶液中剥离海绵体神经上附着的血管与结缔组织，所述Hank’s平衡盐溶液为1～4℃预冷的溶液。
从以上技术方案可知，本发明剪取成年SD大鼠的海绵体神经，并进行培养、纯化、扩增培养等方法，以获得施旺细胞；该方法通过成年SD大鼠海绵体神经提取原代施旺细胞进行原代培养，可获得稳定传代的高纯度原代施旺细胞，从而拓展了施旺细胞的来源，为海绵体神经相关疾病的科学研究提供了最佳的种子细胞。
附图说明
图1为光镜下观察海绵体神经来源原代施旺细胞。
图2为细胞免疫荧光鉴定原代施旺细胞。
具体实施方式
下面结合图1和图2详细介绍本发明，在此本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
本发明提供了一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，其采用以下步骤：
取大鼠的海绵体神经，具体是选取SPF级SD大鼠10-12周龄，雄性，体重为300-350g；术前对手术过程中使用的常规器械进行灭菌消毒备用；然后腹腔注射麻醉剂，待大鼠麻醉稳定后，将大鼠仰卧位固定在手术台上，腹部除毛，碘伏消毒，铺巾，75%的酒精脱碘；接着用手术刀在大鼠下腹部正中线切开皮肤，手术切口大小约4cm，然后用电刀逐层切开皮下脂肪、肌肉及腹膜进入腹腔，用大鼠腹部撑开器撑开腹腔以暴露手术视野，找到大鼠前列腺，沿前列腺两侧找到大鼠盆腔神经节及海绵体神经，然后用显微器械游离并剪取海绵体神经；所述麻醉剂为3%w/v戊巴比妥钠生理盐水溶液，麻醉剂量为1.5～2ml/kg；游离海绵体神经的长度为10～15mm。
在取大鼠的海绵体神经前须对手术过程中使用的器械进行灭菌消毒备用，灭菌消毒方法为121℃高压灭菌20～40min。剥离上述海绵体神经上附着的血管与结缔组织，具体是在预冷的无菌Hank’s平衡盐溶液中仔细剥离海绵体神经上附着的血管与结缔组织，所述Hank’s平衡盐溶液为1～4℃预冷的溶液。将剥离干净的海绵体神经剪切成小段，用含I型胶原酶与胰蛋白酶的消化液进行组织消化，消化后轻柔吹打消化液至未见明显组织块，以制备单细胞悬液。具体来说，将剥离干净的海绵体神经剪切成0.4～0.6mm的小段，然后用含I型胶原酶与胰蛋白酶的消化液进行组织消化，消化后轻柔吹打消化液至未见明显组织块，以制备成单细胞悬液；所述消化液为含0.1% I型胶原酶与0.25% 胰蛋白酶的L-15基础培养基；消化反应温度为36.5～37.5℃，消化时间为30～50 分钟，且每隔5～10分钟轻柔震荡一次。
将上述单细胞悬液过滤，滤液离心得到沉淀，滤液离心得到沉淀，用含胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养基重悬沉淀。取重悬液于经多聚赖氨酸氢溴酸溶液和层粘蛋白溶液处理过的35mm培养皿，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱培养。培养24h后，去除旧培养基，更换含FBS和阿糖胞苷（Arac）的DMEM高糖培养基，置于37℃，5% CO2的细胞培养箱培养；继续培养48h后，去除旧培养基，更换含FBS、青霉素/链霉素、佛司可林（Forskolin）和重组人heregulinβ-1的DMEM高糖培养基，置于37℃，5% CO2的细胞培养箱进行扩增培养，即得大量高纯度施旺细胞。其中，所述含FBS的DMEM高糖培养基中FBS浓度为9～11％w/v，葡萄糖浓度4.5g/L；所述多聚赖氨酸氢溴酸浓度为0.01% w/v ，分子量为70000～150000；层粘蛋白浓度为1～2μg/ml（0.1% v/v）；所述含FBS和Arac的DMEM高糖培养基中FBS浓度为9～11％w/v，Arac浓度为9～11μM，葡萄糖浓度4.5g/L；所述含FBS、Forskolin和重组人heregulinβ-1的DMEM高糖培养基中FBS浓度为9～11％w/v，青霉素/链霉素浓度为0.9～1.0%， Forskolin浓度为2～2.5μM，重组人heregulinβ-1浓度为9.5～10.5 ng/ml，葡萄糖浓度4.5g/L。
实施例
1、实验动物：雄性SPF级SD大鼠（10-12周龄 300-350g）5只；
2、实验器材：常规外科手术器械（手术刀、组织剪、线剪、弯钳、大鼠腹部撑开器、镊子）；眼科显微镊（弯头14cm宽0.15mm，苏州施强）；蚊式钳（蚊式止血钳-直/1.0mm宽/12.5cm，HARTMAN）；戊巴比妥钠（Sigma, 1507002）；Hank’s平衡盐溶液(Gibco,C14175500BT)；I型胶原酶（Gibco，17100017）；胰蛋白酶（Gibco，15090046）；多聚赖氨酸氢溴酸(Sigma,P1274)；层粘连蛋白（Sigma, L2020）；L-15基础培养基（Gibco，11415064）；35mm培养皿（Corning，430165）；细胞滤网（Corning，352350），胎牛血清（Gibco，10099141C）；DMEM高糖培养基（Gibco，C11995500BT）；磷酸盐缓冲液（Gibco，C10010500BT）；阿糖胞苷（Sigma,C1768）；佛司可林（MCE，HY-15371）；重组人heregulinβ-1（PeproTech，AF-100-03）
3、实验准备：
实验前一天：1）取500 μl多聚赖氨酸氢溴酸溶液包被35mm培养皿，室温孵育10分钟后吸尽液体，置于4℃冰箱过夜备用。2）所用手术器械在121℃高压下灭菌20～40min。
实验当天：1）向经多聚赖氨酸氢溴酸包被的35mm培养皿中加入500 μl层粘蛋白溶液，置于37℃细胞培养箱孵育25～35分钟，吸尽液体后无菌磷酸盐缓冲液冲洗3次。2）准备30 ml 无菌Hank’s平衡盐溶液，置于冰上预冷。3）配置10ml 3%（w/v）戊巴比妥钠生理盐水溶液。
4、施旺细胞的提取纯化和培养：
1）分离并剪取海绵体神经：根据大鼠体重腹腔注射相应剂量戊巴比妥钠生理盐水溶液，待大鼠麻醉稳定后，将大鼠仰卧位固定在手术台上，腹部除毛，碘伏消毒，铺巾，75%的酒精脱碘。用手术刀在大鼠下腹部正中线切开皮肤，手术切口大小约4cm，然后用逐层切开皮下脂肪、肌肉及腹膜进入腹腔。用大鼠腹部撑开器撑开腹腔以暴露手术视野，找到大鼠前列腺，沿前列腺两侧找到大鼠盆腔神经节（MPG）及海绵体神经(CN)，然后用显微器械游离并剪取海绵体神经。
2）海绵体神经消化方法：在预冷的无菌Hank’s平衡盐溶液中仔细剥离海绵体神经上附着的血管与结缔组织；将剥离干净的海绵体神经剪切成长约5mm的小段，转移至5ml含0.1% I型胶原酶与0.25% 胰蛋白酶的L-15培养基消化液中进行组织消化；置于37℃细胞培养箱消化40分钟，且每隔10 分钟轻柔震荡一次；消化后轻柔吹打消化液至未见明显组织块，以制备单细胞悬液；
3）初始原代施旺细胞的培养：用70μm的细胞滤网过滤单细胞悬液，滤液以400 g离心力离心5分钟得到沉淀，弃去上清液，用3ml含10% FBS的DMEM高糖培养基重悬沉淀。取重悬液于经多聚赖氨酸氢溴酸溶液和层粘蛋白溶液处理过的35mm培养皿，置于37℃，5% CO2的细胞培养箱培养。
4）施旺细胞的纯化：培养24h后，去除旧培养基，更换含10% FBS和11μM Arac的DMEM高糖培养基，置于37℃，5% CO2的细胞培养箱培养；
5）施旺细胞的扩大培养：继续培养48h后，去除旧培养基，更换含10% FBS、1%青霉素/链霉素、2μM Forskolin和10.5 ng/ml重组人heregulinβ-1的DMEM高糖培养基，置于37℃，5% CO2的细胞培养箱进行扩增培养，即得大量高纯度施旺细胞。
5、细胞形态检测：如图1，光学显微镜下观察细胞形态，可见原代细胞呈单极/双极梭形型，形态均一，从细胞形态上证实本发明方法制得的细胞为施旺细胞。
6、细胞纯度检测：如图2，施旺细胞特异性标志物有S100和p75NTR蛋白。通过免疫荧光染色鉴定施旺细胞纯度高达96％。
7、细胞数量检测：在培养第7天可以获得大量稳定传代的施旺细胞，细胞数量约2×106个。
Claims (10)
1.一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，其特征包括以下步骤：
（1）解剖提取大鼠的海绵体神经；
（2）剥离上述海绵体神经上附着的血管与结缔组织；
（3）将剥离干净的海绵体神经剪切成0.4～0.6mm的小段，然后用含I型胶原酶与胰蛋白酶的消化液进行组织消化，消化后轻柔吹打消化液至未见明显组织块，以制备成单细胞悬液；
（4）将上述单细胞悬液过滤，滤液离心得到沉淀，然后用含FBS的DMEM高糖培养基重悬沉淀；再取重悬液于经多聚赖氨酸氢溴酸溶液和层粘蛋白溶液处理过的35mm培养皿，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱培养；
（5）采用步骤（4）培养24h后，去除旧培养基，更换含FBS和Arac的DMEM高糖培养基，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱继续培养48h，然后去除旧培养基，更换含FBS、青霉素/链霉素、Forskolin和重组人heregulinβ-1的DMEM高糖培养基，再置于37℃、5% CO2的细胞培养箱进行扩增培养，得到施旺细胞。
2.根据权利要求1所述大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，其特征在于：所述消化液为含0.1% I型胶原酶与0.25% 胰蛋白酶的L-15基础培养基。
3.根据权利要求2所述大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，其特征在于：消化反应温度为36.5～37.5℃，消化时间为30～50 分钟，且每隔5～10分钟轻柔震荡一次。
4.根据权利要求1所述大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，其特征在于：所述单细胞悬液采用40～70μm的细胞滤网进行过滤，滤液离心时的离心力为350～400 g，离心时间为5～8 分钟。
5.根据权利要求1所述大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，其特征在于：所述含FBS的DMEM高糖培养基中FBS浓度为9～11％w/v，葡萄糖浓度4.5g/L；所述多聚赖氨酸氢溴酸浓度为0.01% w/v ，分子量为70000～150000；层粘蛋白浓度为1～2μg/ml。
6.根据权利要求1所述大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，其特征在于：所述含FBS和Arac的DMEM高糖培养基中FBS浓度为9～11％w/v，Arac浓度为9～11μM，葡萄糖浓度4.5g/L；所述含FBS、Forskolin和重组人heregulinβ-1的DMEM高糖培养基中FBS浓度为9～11％w/v，青霉素/链霉素浓度为0.9～1.0%， Forskolin浓度为2～2.5μM，重组人heregulinβ-1浓度为9.5～10.5 ng/ml，葡萄糖浓度4.5g/L。
7.根据权利要求1至6中任意一项所述大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，其特征在于：取大鼠的海绵体神经时，先选取SPF级SD大鼠10-12周龄，雄性，体重为300-350g；然后向大鼠腹腔注射麻醉剂，待大鼠麻醉稳定后，将大鼠仰卧位固定在手术台上，腹部除毛，碘伏消毒，铺巾，75%的酒精脱碘；接着用手术刀在大鼠下腹部正中线切开皮肤，然后用电刀逐层切开皮下脂肪、肌肉及腹膜进入腹腔，再用大鼠腹部撑开器撑开腹腔以暴露手术视野，找到大鼠前列腺，沿前列腺两侧找到大鼠盆腔神经节及海绵体神经，然后用显微器械游离并剪取海绵体神经。
8.根据权利要求7所述大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，其特征在于：所述麻醉剂为3%w/v戊巴比妥钠生理盐水溶液，麻醉剂量为1.5～2ml/kg；游离海绵体神经的长度为10～15mm。
9.根据权利要求7所述大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，其特征在于：在取大鼠的海绵体神经前须对手术过程中使用的器械进行灭菌消毒备用，灭菌消毒方法为121℃高压灭菌20～40min。
10.根据权利要求7所述大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法，其特征在于：在预冷的无菌Hank’s平衡盐溶液中剥离海绵体神经上附着的血管与结缔组织，所述Hank’s平衡盐溶液为1～4℃预冷的溶液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210137145.0A CN114621922A (zh) | 2022-02-15 | 2022-02-15 | 一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210137145.0A CN114621922A (zh) | 2022-02-15 | 2022-02-15 | 一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114621922A true CN114621922A (zh) | 2022-06-14 |
Family
ID=81898096
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210137145.0A Pending CN114621922A (zh) | 2022-02-15 | 2022-02-15 | 一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114621922A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997016534A1 (en) * | 1995-11-01 | 1997-05-09 | Genentech, Inc. | Normal neural epithelial precursor cells |
| CN101902911A (zh) * | 2007-10-19 | 2010-12-01 | 阿维拉制药公司 | 杂芳基化合物和其用途 |
| CN107338221A (zh) * | 2016-05-03 | 2017-11-10 | 江苏齐氏生物科技有限公司 | 一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法 |
| CN108410802A (zh) * | 2018-03-09 | 2018-08-17 | 云南洛宇生物科技有限公司 | 一种大鼠心房肌细胞培养方法 |
| CN109330591A (zh) * | 2018-09-17 | 2019-02-15 | 江苏省人民医院（南京医科大学第附属医院） | 一种腹腔镜术中实时监测阴茎海绵体神经损伤的诱发电位监测仪 |
| CN110248957A (zh) * | 2016-11-14 | 2019-09-17 | 株式会社图尔金 | 经人工操纵的sc功能控制系统 |
| CN110387348A (zh) * | 2018-04-18 | 2019-10-29 | 江苏齐氏生物科技有限公司 | 一种人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法 |
-
2022
- 2022-02-15 CN CN202210137145.0A patent/CN114621922A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997016534A1 (en) * | 1995-11-01 | 1997-05-09 | Genentech, Inc. | Normal neural epithelial precursor cells |
| CN101902911A (zh) * | 2007-10-19 | 2010-12-01 | 阿维拉制药公司 | 杂芳基化合物和其用途 |
| CN107338221A (zh) * | 2016-05-03 | 2017-11-10 | 江苏齐氏生物科技有限公司 | 一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法 |
| CN110248957A (zh) * | 2016-11-14 | 2019-09-17 | 株式会社图尔金 | 经人工操纵的sc功能控制系统 |
| CN108410802A (zh) * | 2018-03-09 | 2018-08-17 | 云南洛宇生物科技有限公司 | 一种大鼠心房肌细胞培养方法 |
| CN110387348A (zh) * | 2018-04-18 | 2019-10-29 | 江苏齐氏生物科技有限公司 | 一种人皮肤角质形成层细胞的分离及培养方法 |
| CN109330591A (zh) * | 2018-09-17 | 2019-02-15 | 江苏省人民医院（南京医科大学第附属医院） | 一种腹腔镜术中实时监测阴茎海绵体神经损伤的诱发电位监测仪 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 戴春福: "中西医临床男科学", 31 December 2016, 中国医药科技出版社, pages: 421 * |
| 赵际童;沈强;黄斐;: "无血清神经球培养下神经干细胞的生长与分化", 中国组织工程研究, no. 14 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9387226B2 (en) | Neural cell proliferation induced through the culture of neural cells with umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells | |
| CN108865986B (zh) | 用于修复关节软骨损伤/缺损的间充质干细胞制剂及其制备方法和应用 | |
| ES2550456T3 (es) | Uso de una composición que contiene células madre mesenquimatosas derivadas de sangre de cordón umbilical humano para inducir diferenciación y proliferación de células precursoras neurales o células madre neurales a células neurales | |
| CN107254431B (zh) | 一种新型组织工程皮肤制备方法 | |
| CN113813289B (zh) | 基于脐带间充质干细胞外泌体的毛囊生成促进液制备方法 | |
| KR20180122288A (ko) | 사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 기반 3d 바이오프린팅 조직체 및 이의 이용 | |
| CN112195151B (zh) | 一种牙髓间充质干细胞复苏培养液、制备方法及复苏培养方法 | |
| CN117258048A (zh) | 一种搭载外泌体的神经修复生物材料及其制备方法 | |
| CN114621922A (zh) | 一种大鼠海绵体神经来源施旺细胞的提取纯化和培养方法 | |
| CN105154388B (zh) | 一种皮肤角质细胞分离、培养方法 | |
| CN112402458A (zh) | 一种间充质干细胞和外泌体联合制剂在制备心肌梗死药物中的应用 | |
| WO2013191531A1 (en) | Autologous tissue-engineered human skin construct and a method for producing thereof | |
| CN113713175B (zh) | 制备水凝胶支架的方法及由此得到的支架的用途 | |
| RU2148970C1 (ru) | Способ восстановления кожного покрова | |
| US20030134414A1 (en) | Nerve growth assistance improvement | |
| RU2652902C1 (ru) | Способ стимуляции сперматогенеза | |
| CN115418341B (zh) | 成纤维细胞向毛乳头细胞转分化的方法及其应用 | |
| CN110904036B (zh) | 一种分离髓核原代细胞的方法 | |
| WO2023143519A1 (zh) | 一种细胞修复蛋白提取物及其制备方法和其应用 | |
| US20230075134A1 (en) | Method for isolating and purifying mesenchymal stem cells from hernia sac and method for tissue repair by using mesenchymal stem cells from hernia sac | |
| CN117126813A (zh) | 一种用于治疗神经源性勃起功能障碍的药物及其应用 | |
| RU2676142C2 (ru) | Способ получения препарата обкладочных клеток обонятельной выстилки млекопитающих для лечения травм спинного мозга | |
| CN114457009A (zh) | 一种干细胞提取物的制备方法及其应用 | |
| CN117487753A (zh) | 一种治疗型小胶质细胞的建立和应用 | |
| CN117568275A (zh) | 一种同时提取大鼠原代雪旺细胞和成纤维细胞的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |