CN107338221A - 一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法 - Google Patents

一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：(1)组织处理器械消毒；(2)选取2～3周的雄性SD大鼠，断颈处死，用眼科剪剪去大鼠腿部被毛，截取坐骨神经，将组织放入预冷无菌含双抗的PBS液中洗涤数次除去血渍和外膜；(3)剪碎组织，并用预热的II型胶原酶和IV型胶原酶消化；(4)终止消化，离心，弃上清，加培养基重悬；(5)组织块贴壁法接种到6孔培养板培养；(6)孵育1～2h，置于37℃、5％CO2环境中培养；(7)细胞传代纯化；(8)细胞形态学观察与鉴定。本发明提供的一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法，简单易操作，稳定，高效，获得的施旺细胞活力高，可用于建立体外实验模型细胞，满足大鼠施旺细胞实验的要求。

Description

一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法
技术领域
本发明属于现代生物技术之细胞培养技术领域，具体涉及一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法。
背景技术
施旺细胞(Schwann cells SCs)是周围神经系统特有的、最主要的胶质细胞，在周围神经的发生及损伤后的再生中起着重要的作用。它是周围神经纤维的鞘细胞，排列成串，包裹着周围神经纤维的轴突，反复包卷形成的同心圆板层，形成髓鞘。施旺细胞可分泌细胞粘附分子、多种神经营养因子(NTFs)和细胞外基质，促进和引导周围神经轴突的再生。
施旺细胞能大量持续分泌生长因子VEGF、TGF、PDGF等各种生物活性物质以及分泌基质。以往研究表明神经和血管相伴行，近来进一步的研究探讨了其中的分子机制。Mukouyama等研究发现小鼠小动脉特异性地与外周感觉神经伴行，外周感觉神经或施旺氏细胞的缺失可以导致小动脉生成障碍。施旺氏细胞在血管的动脉样分化和成熟中具有重要作用。近来发现，VEGF不仅在血管新生中发生着重要作用，还可以减小施旺细胞培养时的应急反应，增加在心肌内的生存率，从而改善心梗后心功能。目前国内外对于大鼠施旺细胞的分离与培养的研究较少，分离方法不成熟，获得的细胞纯度低，数量少。本发明旨在提供一种操作简单、高效的获得生长状态好、纯度高的大鼠施旺细胞的方法，建立一套完善可靠的大鼠施旺细胞体外培养技术。
发明内容
根据上述问题，本发明提供了一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法，该方法操作简单，细胞产量和成活率高，是一种较为理想的大鼠施旺细胞原代培养方法，可以满足多种生理生化实验的要求。
本发明采用的的技术方案如下：
(1)将组织处理器械浸泡于浓度75％乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在无菌操作台里晾干；
(2)选取2～3周的雄性SD大鼠，颈椎脱臼法处死，将处死后的大鼠用75％乙醇浸泡10s；
(3)将大鼠腹面向上固定于板上，局部常规消毒，用眼科剪剪去大鼠腿部被毛，分离腿部肌肉截取坐骨神经，将组织放入预冷无菌含双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)PBS液(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)中洗涤除去血渍，去除外膜；
(4)无菌条件下，在预冷的PBS(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)中用眼科剪将神经组织剪成1mm×1mm的碎块；
(5)用37℃预热的II型胶原酶结合IV型胶原酶混合消化；
(6)用10ml含10％大鼠血清、双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)、4～6μg/ml胰岛素的DMEM/F12(1∶1)混合培养基(简称混合培养基)终止消化，所得滤液100～200g离心10min，去掉上清液，保留沉淀；
(7)组织块贴壁法接种细胞至铺多聚赖氨酸包被的的6孔培养板中；
(8)倒置在37℃孵箱中孵育1～2h，沿孔边缓慢加入混合培养基，置于37℃、5％CO2环境中培养；
(9)24h小时后加入1ml的3～5μg/ml的阿糖胞苷处置48h，以除去成纤维 细胞；
(10)接种72h初次换液，换液后同时加入1ml的20～30ng/ml的成纤维细胞生长因子(bFGF)纯化细胞和1ml的4～6μM的福司柯林促进施旺细胞增殖；
本发明在步骤(10)之后还包括以下步骤：
(11)细胞传代纯化细胞：培养7～9天，细胞增殖达到70～80％时进行传代，用PBS(浓度为0.01M，PH为7.2～7.4)清洗2～3次，用0.25％的胰酶消化2～3分钟，用含大鼠血清的DMEM/F12(1∶1)培养基终止消化，350g离心去上清，加入10ml含10％大鼠血清、双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)、5μg/ml胰岛素、pH为7.4的DMEM/F12(1∶1)混合培养基重悬细胞沉淀，按照1∶2比例进行传代培养，记为P1，每个孔板的培养基中加入1ml的20～30ng/ml的成纤维细胞生长因子(bFGF)以除去成纤维细胞；
(12)细胞形态学观察与鉴定：施旺细胞爬片的制作，细胞免疫荧光鉴定。
其中，步骤(2)所选的大鼠体重100±10g，2～3周雄性SD大鼠。
其中，步骤(3)(4)所述的PBS已4℃预冷，PBS浓度为0.01M，PH为7.2～7.4，培养皿置于冰上，是为了使组织处于无菌、低温的环境。
其中，步骤(5)所述消化环境为37℃CO2培养箱，消化时间20min，消化酶混合液由0.1％～0.2％的II型胶原酶和0.1％～0.2％的IV型胶原酶混匀制得，所述两种酶混合比例1∶1～1∶1.5。
其中，步骤(6)所述培养基为DMEM/F12(1∶1)培养基，含10％大鼠血清，含100u/ml的青霉素、100u/ml的链霉素的双抗，5μg/ml的胰岛素。
其中，步骤(7)所述组织块贴壁法是将组织均匀铺在培养皿中。
其中，步骤(8)所述加入培养基过程应缓慢，勿使组织块漂起。
其中，步骤(9)所述阿糖胞苷浓度为5μg/ml。
其中，步骤(10)(11)所述的成纤维细胞生长因子浓度为25ng/ml，福司柯林浓度为5μM。
有益效果
本发明建立了一种简单、高效的分离培养大鼠施旺细胞的方法，所得原代细胞经细胞形态学观察与鉴定：数量多、纯度高、活性好，细胞成活率达95％以上，细胞纯度达96％以上，通过免疫细胞化学等方法检测细胞标记物。
本发明采用SD大鼠为材料，来源广泛。采用酶消化法和组织块贴壁法相结合的分离方法，与单独的组织块贴壁法相比，其细胞迁出的速度更快，与单独的酶消化法细胞，其细胞纯度更高。
本发明采用阿糖胞苷、成纤维细胞生长因子、福司柯林等，可以在提高细胞CAMP水平的同时达到抑制成纤维细胞的效果。相对于磁珠分离法等其它方法，其技术更简单易掌握，代价更低。
本发明采用多聚赖氨酸包被培养板，细胞生长状态好，可满足施旺细胞实验的要求，多聚赖氨酸包被比APES包被制作更简单，更易保存；本方法经济实用，简便易行，有利于建立体外实验模型细胞，研究施旺细胞的特性，为后续的实验提供可靠的细胞资源。
附图说明
图1培养4d的大鼠施旺细胞图片(100×)
图2培养7d大鼠脑施旺细胞免疫荧光图片(100×)
图3培养7d大鼠脑施旺细胞核免疫荧光图片(100×)
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合附图和实例对本发明进行详细说明，本发明的保护内容不限于下述实施例。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
本实验所用的实验仪器与试剂如下：
外科手术器械一套，倒置显微镜(XDS-1A，上海)，荧光显微镜(Leica，美国)，恒温孵育箱(Heraeus，美国)，低温离心机(TD24B-WS，上海)，超低温冰箱(中科美菱)，移液枪(Eppendorf，美国)，电子分析天平(Sartorius，美国)，超净工作台(HJ-CJ-1D，上海)，CO2细胞培养箱(SANYO MCO-17AI，日本)。
DMEM/F12(1∶1)购于Corning公司，青霉素-链霉素双抗于Gibco购买，大鼠血清购买于Bioind公司，多聚赖氨酸共买于美国Gibco公司，Nephrin抗体、阿糖胞苷购买于美国Sigma，成纤维细胞生长因子(bFGF)购买于美国Peprotech，福司柯林购买于美国Sigma，PBS自制(8.0gNal、0.2g KCl、0.2g KH2PO4、1.44g Na2HPO4溶于1000ml去离子水中，调整PH为7.2～7.4，非特殊指出，本专利所用的PBS皆为此配方)，胰酶购买于Bioind公司，II型胶原酶和IV型胶原酶购买于德国Serva公司，细胞培养瓶、离心管购于美国Corning公司。
本发明提供的技术方案包括如下步骤：
(1)将组织处理器械浸泡于浓度75％乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在无菌操作台晾干，选取2～3周的体重100±10g雄性SD大鼠，颈椎脱臼法处死，将处死后的大鼠用75％乙醇浸泡10s；
(2)将大鼠腹面向上固定于板上，局部常规消毒，用眼科剪剪去大鼠腿部被毛，分离腿部肌肉截取坐骨神经，将组织放入预冷无菌含双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)PBS液(浓度为0.01M，PH为7.2～7.4)中洗涤除去血渍，剥离外膜；
(3)在另一个60mm培养皿中加入预冷的PBS(浓度为0.01M，PH为7.2～7.4)，无菌条件下，用眼科剪将神经组织剪成1mm×1mm的碎块；
(4)用37℃预热的II型胶原酶结合IV型胶原酶混合消化，37℃CO2培养箱消化20min，所述混合消化酶溶液由0.15g/l的II型胶原酶和0.15g/l的IV型胶原酶(1∶1.2)混合并且搅匀后制得；
(5)加入10ml含10％大鼠血清、双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)、5μg/ml胰岛素、pH为7.4的DMEM/F12(1∶1)混合培养基(简称混合培养基)终止消化，所得滤液150g离心10min，去掉上清液，保留沉淀；
(6)组织块贴壁法将沉淀细胞接种至铺多聚赖氨酸包被的的6孔培养板中：将组织均匀贴于培养板底部；
(7)倒置在37℃孵箱中孵育1.5h，轻轻翻转培养板，沿孔边缓慢加入DMEM/F12(1∶1)混合培养基，置于37℃、5％CO2环境中培养；
(8)培养24h小时后可以看见少量细胞已从一些组织周围迁出，并随着时间增加逐渐增多，主要有两种细胞：一种为成纤维细胞，呈圆形或不规则形状，边界不清；一种为施旺细胞，呈梭形或纺锤形，边界清晰，有两极，加入1ml的4μg/ml的阿糖胞苷处置48h，以除去成纤维细胞；
(9)接种72h初次换液，换液后同时加入1ml的25ng/ml的成纤维细胞生长因子(bFGF)除去成纤维细胞和1ml的5μM的福司柯林促进增殖，7～9天后融合成网状，仍有少量成纤维细胞；
(10)细胞传代纯化：培养7～9天，细胞增殖达到70～80％时进行传代，用PBS(浓度为0.01M，PH为7.2～7.4)清洗2～3次，用0.25％的胰酶消化2～3分钟，用含大鼠血清的DMEM/F12(1∶1)培养基终止消化，350g离心去上清，加入10ml含10％大鼠血清、双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)、5μg/ml胰岛素、pH为7.4的DMEM/F12(1∶1)混合培养基重悬细胞沉淀，按照1∶2比例进行传代培养，记为P1，每个孔板的培养基中加入1ml的25ng/ml的成纤维细胞生长因子(bFGF)以除去成纤维细胞；
(11)细胞爬片的制作：a.取P1代细胞，PBS液洗涤1～2次；b.用0.25％胰蛋白酶消化3～5min，用DMEM/F12(1∶1)混合培养基终止消化，离心收集沉淀；c.用DMEM/F12(1∶1)混合培养基重悬，在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片，用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止，置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数(四大格细胞总数/4×104)，对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。计数完成后再加入培养基将调整细胞浓度为1×106/ml；d.培养皿内放入多聚赖氨酸处理后的玻璃爬片，加入细胞悬液，37℃CO2培养箱培养；
(12)施旺细胞免疫荧光鉴定：a.细胞爬片用PBS液冲洗3次，每次3min，4％多聚甲醛固定20～30min，PBS洗3次，每次10min；b.0.2％渗透液Triton-100室温(15-25℃)下孵育10min，PBS洗3次，每次10分钟；c.5％BSA室温封闭1h，吸去封闭液。加入Nephrin抗体(用1％BSA稀释)于冰箱4℃过夜孵育；d.PBS洗3次，滴加羊抗鼠PE荧光二抗IgG(用1％BSA稀释)，在室温下置于湿盒内孵育45min，PBS洗3次，自然晾干后在显微镜下观察。荧光拍照，计数阳性细胞。
施旺细胞表现为阳性，呈黄绿色荧光，计数阳性细胞与所有细胞数的比值，阳性率即细胞纯度大于96％。
本发明所得到的大鼠施旺细胞数量多，P1代细胞成活率达95％以上，细胞纯度达96％以上。
本发明分离所得施旺细胞可大量增殖，并且可以原代培养3～5代，为后续的实验提供可靠的细胞资源。
以上所述，仅为本发明较佳的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此实施实例。任何在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种大鼠施旺细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将组织处理器械浸泡于浓度75％乙醇水溶液，再置于无菌操作台紫外灭菌30min，将器械取出，在无菌操作台里晾干；
(2)选取2～3周的雄性SD大鼠，颈椎脱臼法处死，将处死后的大鼠用75％乙醇浸泡10s；
(3)将大鼠腹面向上固定于板上，局部常规消毒，用眼科剪剪去大鼠腿部被毛，分离腿部肌肉截取坐骨神经，将组织放入预冷无菌含双抗的PBS液中洗涤除去血渍，去除外膜；
(4)无菌条件下，在预冷的PBS中用眼科剪将神经组织剪成1mm×1mm的碎块；
(5)用37℃预热的II型胶原酶结合IV型胶原酶混合消化；
(6)用含大鼠血清、双抗、胰岛素的混合培养基(简称混合培养基)终止消化，所得滤液100～200g离心10min，去掉上清液，保留沉淀；
(7)组织块贴壁法接种细胞至铺多聚赖氨酸包被的的6孔培养板中；
(8)倒置在37℃孵箱中孵育1～2h，沿孔边缓慢加入混合培养基，置于37℃、5％CO2环境中培养；
(9)24h小时后加入1ml的3～5μg/ml的阿糖胞苷处置48h，以除去成纤维细胞；
(10)接种72h初次换液，换液后同时加入1ml的20～30ng/ml的成纤维细胞生长因子(bFGF)纯化细胞和1ml的4～6μM的福司柯林促进施旺细胞增殖；
(11)细胞传代纯化；
(12)细胞形态学观察与鉴定：施旺细胞爬片的制作，细胞免疫荧光鉴定。
2.根据权利要求1所述的大鼠施旺细胞的分离及培养方法，其特征在于所用预冷的PBS浓度为0.01M，PH为7.2～7.4。
3.根据权利要求1所述的大鼠施旺细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(5)所述消化时间20min，消化酶混合液由0.1％～0.2％的II型胶原酶和0.1％～0.2％的IV型胶原酶混合并且搅匀后制得，所述两种酶混合比例1∶1～1∶1.5。
4.根据权利要求3所述的大鼠施旺细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(5)所述消化时间20min，消化酶混合液由0.15g/l的II型胶原酶和0.15g/l的IV型胶原酶混合并且搅匀后制得，所述两种酶混合比例1∶1.2。
5.根据权利要求1所述的大鼠施旺细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(6)所述的培养基为含10％大鼠血清、含100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的双抗、4～6μg/ml胰岛素的DMEM/F12(1∶1)培养基，pH为7.4。
6.根据权利要求1所述的大鼠施旺细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(7)所述的培养板用3～4μg/cm2的多聚赖氨酸包被，培养条件为37℃、5％CO2培养箱。
7.根据权利要求1所述的大鼠施旺细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(9)所述的阿糖胞苷浓度为4μg/ml。
8.根据权利要求1所述的大鼠施旺细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤(10)所述加入浓度为25ng/ml成纤维细胞生长因子(bFGF)纯化细胞，浓度为5μM福司柯林促进施旺细胞增殖。
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