CN107338214A - 成纤维细胞及其制备方法和应用、细胞分泌液及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人胚胎干细胞来源的成纤维细胞及其制备方法和应用、细胞分泌液及其应用。该成纤维细胞可分泌多种与创伤愈合有关的细胞生长因子，可应用在制备创伤愈合药物中。该成纤维细胞的细胞分泌液中含有碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和转化生长因子‑β1中的一种或多种与创伤愈合有关的细胞生长因子。动物试验表明，该成纤维细胞的细胞分泌液能够促进创伤愈合，具有良好的治疗效果。该成纤维细胞及其细胞分泌液可应用在创伤愈合药物中。

Description

成纤维细胞及其制备方法和应用、细胞分泌液及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种成纤维细胞及其制备方法和应用、细胞分泌液及其应用。
背景技术
皮肤是身体在面对外在威胁性伤害、微生物等的第一道防御关卡，在生理上具有重要功能。皮肤创伤可能会对皮肤造成严重损害，影响其皮膜屏障的初级免疫功能，严重时可能会全身性的感染危险。
皮肤创伤后的创伤修复和愈合过程基本分成以下五个步骤：一、凝血、止血和炎症细胞进入；二、细胞增殖、修补缺损；三、结缔组织生成；四、创伤修复组织和部位收缩；五、组织重建其完整性。
然而，传统的方法一般采用化学合成类药物来治疗皮肤创伤，较少采用生物类制剂治疗皮肤创伤。
发明内容
基于此，有必要提供一种可用于制备创伤愈合药物的成纤维细胞、以及一种制备成纤维细胞的方法、一种成纤维细胞的细胞分泌液及其应用。
一种成纤维细胞，保藏号为CCTCC NO:C201684。
上述成纤维细胞在制备创伤愈合药物中的应用。
一种成纤维细胞的细胞分泌液，所述细胞分泌液通过以下制备方法获得：
用细胞培养基培养一种成纤维细胞，得到细胞培养液；以及
收集所述细胞培养液中的上清，得到所述细胞分泌液。
在一个实施方式中，所述细胞分泌液中包括碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和转化生长因子-β1中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述细胞培养基包括基础培养基和细胞生长激素，所述基础培养基为DMEM/F12培养基，所述细胞生长激素包括胎牛血清、腺嘌呤和胰岛素；所述胎牛血清在所述细胞培养基中的体积百分含量为5％～10％，所述腺嘌呤在所述细胞培养基中的浓度为0.1mM～0.2mM，所述胰岛素在所述细胞培养基中的浓度为2μg/mL～8μg/mL。
上述细胞分泌液在制备创伤愈合药物中的应用。
一种成纤维细胞的制备方法，包括如下步骤：
提供饲养层细胞；
将未分化的胚胎干细胞移植至所述饲养层细胞上；以及
将所述胚胎干细胞和所述饲养层细胞置于诱导培养基中培养，诱导所述胚胎干细胞分化得到所述成纤维细胞。
在一个实施方式中，所述未分化的胚胎干细胞为未分化的人类胚胎干细胞，所述饲养层细胞为有丝分裂灭活的小鼠成纤维细胞。
在一个实施方式中，诱导所述胚胎干细胞分化得到所述成纤维细胞的操作具体为：将所述胚胎干细胞和所述饲养层细胞置于诱导培养基中培养21天～28天，培养的第4天～7天，在诱导培养基中额外加入人源骨形成蛋白-4，继续培养后得到所述成纤维细胞；其中，所述诱导培养基包括基础培养基和细胞生长激素，所述基础培养基为DMEM/F12培养基，所述细胞生长激素包括胎牛血清、腺嘌呤、胰岛素和氢化可的松。
在一个实施方式中，所述胎牛血清在所述诱导培养基中的体积百分含量为5％～10％，所述腺嘌呤在所述诱导培养基中的浓度为0.1mmol/L～0.2mmol/L，所述胰岛素在所述诱导培养基中的浓度为2μg/mL～8μg/mL，所述氢化可的松在所述诱导培养基中的浓度为0.3μg/mL～0.7μg/mL，所述人源骨形成蛋白-4在所述诱导培养基中的浓度为0.3nmol/L～0.7nmol/L。
经ELISA试验(enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定试验)证明，这种成纤维细胞的细胞分泌液中含有碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和转化生长因子-β1中的一种或多种与创伤愈合有关的细胞生长因子。动物试验表明，该成纤维细胞的细胞分泌液能够促进创伤愈合，具有良好的治疗效果。
附图说明
图1为一实施方式的成纤维细胞的制备方法的流程图；
图2为胚胎干细胞诱导培养得到的成纤维细胞在光学显微镜下的图片；
图3为流式细胞仪中加入CD90抗体，分化培养后的成纤维细胞经过流式细胞仪的检测结果图；
图4为流式细胞仪中加入CD90抗体，分化培养后的成纤维细胞经过流式细胞仪的检测结果图；
图5为一实施方式的成纤维细胞的细胞分泌液的制备方法的流程图；
图6a为用药组的SD大鼠创伤时的照片；
图6b为用药组的SD大鼠用药4天后的照片；
图6c为用药组的SD的大鼠用药8天后的照片；
图6d为用药组的SD大鼠用药12天后的照片；
图7a为实验对照组的大鼠创伤时的照片；
图7b为实验对照组的SD大鼠用药4天后的照片；
图7c为实验对照组的SD大鼠用药8天后的照片；
图7d为实验对照组的SD大鼠用药12天后的照片；
图8为用药组和实验对照组的SD大鼠创面面积随时间变化的结果图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对成纤维细胞、成纤维细胞的细胞分泌液及其在创伤愈合药物中应用作进一步的说明。
一实施方式的成纤维细胞于2016年4月27日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No：C201684，分类命名：人成纤维细胞HF-1。该成纤维细胞来源于人胚胎干细胞。
该成纤维细胞可分泌出碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor，简称bFGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，简称：VEGF)和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，简称TGF-β1)中的一种或多种与皮肤创伤愈合相关的细胞生长因子。该成纤维细胞可用于制备创伤愈合药物。
一实施方式的成纤维细胞的制备方法获得，如图1所示，该方法包括以下步骤S110～S130。细胞属于仅用结构和/或组成特征不能清楚表征的产品，并且用制备方法之外的其他特征不能充分表征。根据审查指南第二部分第十章第4.3节的规定，该类产品的权利要求，允许采用制备方法来表征。
S110、提供饲养层细胞。
饲养层细胞是指一些特定细胞，经有丝分裂阻断剂处理后所得的细胞单层。可作为饲养层细胞的有颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等。经有丝分裂阻断剂处理后，饲养层细胞不分裂不增殖，但仍保持代谢活性。有丝分裂阻断剂可以为丝裂霉素。饲养层细胞可以分泌一些促进干细胞维持的因子，为干细胞生长提供有利的条件。
具体的，饲养层细胞可以为小鼠成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，mEFs)，还可以为人的成纤维细胞(human embryonic fibroblasts，hEFs)。本实施方式中，饲养层细胞为小鼠成纤维细胞。
本实施方式中，将小鼠成纤维细胞复苏培养后，使用丝裂霉素C在37℃，5％的CO2的温箱中孵育2小时。用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗去多余的丝裂霉素C，然后用0.05％的胰酶消化。小鼠成纤维细胞脱壁后加入培养基中和，之后将小鼠成纤维细胞细胞以2×105个/孔～4×105个/孔的密度接种于六孔板中(六孔板的单孔面积大约为10cm2)，小鼠成纤维细胞细胞的密度大约为2×104个/cm2～4×104个/cm2。37℃，5％的CO2的温箱中孵育24小时后用于接种胚胎干细胞。
S120、将未分化的胚胎干细胞移植至饲养层细胞上。
在本说明书中“胚胎干细胞”(embryonic stem cell，ESCs，简称ES、EK或ESC细胞)可以包含哺乳动物来源的所有胚胎干细胞，包括人体胚胎干细胞。人体胚胎干细胞可以使用例如chHES-253等，但并不限定于此。并且，胚胎干细胞可被公众所获得。
一般的，预先用固定剂将饲养层细胞固定，固定剂可以为4％的多聚甲醛等。然后将未分化的胚胎干细胞移植至饲养层细胞上。本实施方式中，未分化的胚胎干细胞的植入密度为3个克隆/cm2～5个克隆/cm2。相当于大约以30个克隆/孔～50个克隆/孔的密度接种于六孔板中。
S130、将胚胎干细胞和饲养层细胞置于诱导培养基中培养，诱导胚胎干细胞分化得到成纤维细胞。
将胚胎干细胞移植至饲养层细胞上后，胚胎干细胞和饲养层细胞置于诱导培养基中培养。胚胎干细胞是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。经过一段时间的培养后，胚胎干细胞可在诱导培养基分化得到成纤维细胞。
具体的，诱导所述胚胎干细胞分化得到成纤维细胞的操作具体为：将胚胎干细胞和饲养层细胞置于诱导培养基中培养21天～28天，培养第4天～7天，在诱导培养基中额外加入人源骨形成蛋白-4(Human Bone morphogenetic protein 4，简称BMP-4)，继续培养后得到成纤维细胞。其中，诱导培养基包括基础培养基和细胞生长激素，基础培养基为DMEM/F12培养基，细胞生长激素包括胎牛血清、腺嘌呤、胰岛素和氢化可的松。
具体的，DMEM/F12培养基可以从Life techenology公司、Sigma公司等地方购买。胎牛血清在诱导培养基中的体积百分含量为5％～10％，所述腺嘌呤在所述细胞培养基中的浓度为0.1mmol/L～0.2mmol/L，胰岛素在诱导培养基中的浓度为2μg/mL～8μg/mL，氢化可的松在诱导培养基中的浓度为0.3μg/mL～0.7μg/mL，人源骨形成蛋白-4在诱导培养基中的浓度为0.3nmol/L～0.7nmol/L。这种培养基可有效诱导胚胎干细胞分化成成纤维细胞。
本实施方式中，诱导培养基包括基础培养基和细胞生长激素，基础培养基为DMEM/F12培养基，胎牛血清在诱导培养基中的体积百分含量为10％，腺嘌呤在细胞培养基中的浓度为0.15mmol/L，胰岛素在诱导培养基中的浓度为5μg/mL，氢化可的松在诱导培养基中的浓度为0.5μg/mL。将胚胎干细胞和饲养层细胞置于诱导培养基中培养3天后，第4天～7天再额外加入BMP-4，BMP-4的加入量为0.5nmol/L。
光学显微镜下观察胚胎干细胞诱导培养得到的成纤维细胞如图2所示。通过光学显微镜看到细胞的形态，从而判断胚胎干细胞是否分化。从图2可以看出，绝大部分的细胞均为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，表明经过诱导培养后，未分化的胚胎干细胞已经分化成成纤维细胞。
进一步的，还可通过流式细胞仪检测胚胎干细胞是否分化成成纤维细胞。成纤维细胞上可特异性标记CD90抗原和CD73抗原，通过流式细胞仪检测未分化的胚胎干细胞和分化培养后的细胞中成纤维细胞的含量。流式细胞仪中加入CD90抗体，分化培养后的成纤维细胞经过流式细胞仪的检测结果如图3所示，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数目。流式细胞仪中加入CD73抗体，分化培养后的成纤维细胞经过流式细胞仪的检测结果如图4所示，横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数目。通过图3和图4可以得出，CD90和CD73阳性细胞比例分别高达99.2％±0.4％和98.3％±0.9％。说明本申请的方法可有效的诱导胚胎干细胞分化为成纤维细胞。
本申请中，通过将未分化的胚胎干细胞移植至饲养层细胞上，并将胚胎干细胞和饲养层细胞置于诱导培养基中培养，诱导胚胎干细胞分化得到成纤维细胞。获得的胚胎干细胞来源的成纤维细胞可在细胞培养基中长期稳定培养，并分泌出bFGF、VEGF和TGF-β1中的一种或多种与创伤愈合有关的细胞生长因子。
本实施方式中，可通过培养这种胚胎干细胞来源的成纤维细胞，成纤维细胞的细胞分泌的bFGF、VEGF和TGF-β1等细胞生长因子会扩散在细胞培养液中，取细胞培养液中的上清即可获得成纤维细胞的细胞分泌液。这种细胞分泌液可用于制备创伤愈合的药物。细胞分泌液获取简单，存储方便。当然，在其他实施方式中，这种胚胎干细胞来源的成纤维细胞本身可用作制备创伤愈合的药物，例如将成纤维细胞收集后干燥得到含细胞的冻干粉。
一种成纤维细胞的细胞分泌液，成纤维细胞的细胞分泌液通过以下制备方法获得。如图5所示，该方法包括以下步骤S210和S220。细胞分泌液属于仅用结构和/或组成特征不能清楚表征的产品，并且用制备方法之外的其他特征不能充分表征。根据审查指南第二部分第十章第4.3节的规定，该类产品的权利要求，允许采用制备方法来表征。
S210、用细胞培养基培养成纤维细胞，得到细胞培养液。
用于培养成纤维细胞的细胞培养基包括基础培养基和细胞生长激素，基础培养基为DMEM/F12培养基，细胞生长激素包括胎牛血清、腺嘌呤和胰岛素。
具体的，成纤维细胞与保藏号为CCTCC No：C201684的细胞相同。
具体的，DMEM/F12培养基可以从Life technology公司，Sigma公司等地方购买。胎牛血清在细胞培养基中的体积百分含量为5％～10％，腺嘌呤在细胞培养基中的浓度为0.1mmol/L～0.2mmol/L，胰岛素在细胞培养基中的浓度为2μg/mL～8μg/mL。其他的培养条件采用本领域常规的方法培养即可。
本实施方式中，细胞培养基包括基础培养基和细胞生长激素，基础培养基为DMEM/F12培养基，胎牛血清在细胞培养基中的体积百分含量为10％，腺嘌呤在细胞培养基中的浓度为0.15mmol/L，胰岛素的在细胞培养基中的浓度为5μg/mL。
本实施方式中，将成纤维细胞用胰酶消化传代至预先I型胶原蛋白铺皿的培养板上，继续扩增传代。I型胶原蛋白可促进细胞贴壁。
S220、收集细胞培养液中的上清，得到细胞分泌液。
成纤维细胞分泌的bFGF、VEGF和TGF-β1等细胞生长因子会扩散在细胞培养液中。由于成纤维细胞为贴壁生长的细胞，收集细胞培养液，离心去除培养液中的细胞碎片沉渣，收集培养液上清，即获得细胞分泌液。
具体的，在培养过程中每隔20小时～28小时左右换液一次，收集换下的培养液，离心去除细胞碎片沉渣，收集培养液上清，并用ELISA试验检测培养液上清中的bFGF、VEGF和TGF-β1的分泌量。
本实施方式中，每隔24小时换液一次，收集换下的培养液，离心去除细胞碎片沉渣，收集培养液上清，并用ELISA试验检测培养液上清中的bFGF、VEGF和TGF-β1的分泌量。
实验表明，成纤维细胞的细胞分泌液中包括bFGF、VEGF和TGF-β1中的一种或多种。培养第三天可检测到bFGF，浓度最高可达到30pg/mL。培养第二天可检测到VEGF，浓度最高可达到1653pg/mL。培养第一天可检测到TGF-β1，浓度最高可达到1455pg/mL。并且bFGF、VEGF和TGF-β1在低温条件下存储30天后含量没有明显的变化，表明这些生长因子的稳定性好，可长时间储存。
动物实验表明，该成纤维细胞的细胞分泌液可有效治疗创伤。可应用于创伤愈合的药物中。
以下为具体实施例。
以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。所用实验材料DMEM/F12培养基购自Life techenologies公司，货号为10565018。胎牛血清购自GIBCO公司，货号为10099141。腺嘌呤购自Sigma公司,货号为A2786。胰岛素购自sigma公司，货号为A8626。氢化可的松购自sigma公司，货号为D4902。BMP-4购自R&D Systems公司,货号为314-BP。
实施例1
成纤维细胞的制备
将未分化的人胚胎干细胞(hESCs)种植在预先4％多聚甲醛固定后的小鼠成纤维细胞(MEF)上，将胚胎干细胞和饲养层细胞置于诱导培养基中培养。其中诱导培养基包括基础培养基和细胞生长激素，基础培养基为DMEM/F12培养基，胎牛血清在诱导培养基中的体积百分含量为5％，腺嘌呤在诱导培养基中的浓度为0.15mmol/L，胰岛素在诱导培养基中的浓度为5μg/mL，氢化可的松在诱导培养基中的浓度为0.5μg/mL。每隔24h更换诱导培养基。诱导培养的第4天～7天，诱导培养基中额外加入BMP-4，BMP-4的加入量为0.5nmol/L。诱导分化后得到胚胎干细胞来源的成纤维细胞。可将得到的成纤维细胞扩增后保存，以备下次使用。该成纤维细胞的保藏号为CCTCC No：C201684。
实施例2
成纤维细胞的细胞分泌液的制备
采用实施例1的方法制备得到成纤维细胞，扩增后用胰酶消化传代至预先I型胶原蛋白铺皿的培养板上，继续扩增传代。培养成纤维细胞的细胞培养基包括基础培养基和细胞生长激素，基础培养基为DMEM/F12培养基，胎牛血清在细胞培养基中的体积百分含量为10％，腺嘌呤在诱导培养基中的浓度为0.15mmol/L，胰岛素在细胞培养基中的浓度为5μg/mL。每隔24小时换液一次，收集换下的培养液，离心去除培养液中的细胞碎片沉渣，上清即为成纤维细胞的细胞分泌液。用ELISA试验检测细胞分泌液中的bFGF、VEGF和TGF-β1的含量。
实施例3
成纤维细胞的细胞分泌液中bFGF、VEGF和TGF-β1含量的测定
采用实施例2的方法制备得到成纤维细胞的细胞分泌液，每隔24小时收集一次成纤维细胞的细胞分泌液。采用ELISA试验检测bFGF、VEGF和TGF-β1的含量，结果如表1所示。
表1细胞分泌液中bFGF、VEGF和TGF-β1含量
从表1可以看出，成纤维细胞的细胞分泌液中包括bFGF、VEGF和TGF-β1中的一种或多种与创伤愈合有关的生长因子。培养第三天可检测到bFGF，浓度最高可达到30pg/mL。培养第二天可检测到VEGF，浓度最高可达到1653pg/mL。培养第一天可检测到TGF-β1，浓度最高可达到1455pg/mL。
实施例4
bFGF、VEGF和TGF-β1的稳定性测定
采用实施例2的方法制备得到的细胞分泌液，分别测定新鲜的细胞分泌液中bFGF、VEGF和TGF-β1的含量。然后将细胞分泌液存储在-20℃条件下30天，再次测定新鲜的细胞分泌液中bFGF、VEGF和TGF-β1的含量，结果如2所示。
表2 bFGF、VEGF和TGF-β1在低温条件下的稳定性结果
从表2可以看出，且bFGF、VEGF和TGF-β1在-20℃条件下存储30天后含量没有明显的变化，表明这些生长因子的稳定性好，可长时间储存。
实施例5
成纤维细胞的细胞分泌液的对大鼠创伤愈合的作用
1、SD大鼠烫伤模型的制作
SD大鼠为大鼠的一个品系，其毛色白化，广泛用于药理、毒理及药效实验中，SD大鼠可购自中南大学实验动物学部。烫伤前将实验用大鼠行腹腔注射戊巴比妥钠(60mg/kg体重)麻醉，背部皮肤用8％的Na2S脱毛。用截面积为2.5×2.5厘米的小锁在100℃中煮沸后，在大鼠背部烫伤12秒钟，得到SD大鼠烫伤模型。
2、烫伤的SD大鼠的治疗
分别对烫伤的SD大鼠模型治疗。实验分为用药组、实验对照组和空白对照组。
用药组：采用实施例2的方法制备得到的成纤维细胞的细胞分泌液涂覆在烫伤的SD大鼠上，每天3次，每次1mL。每隔四天对SD大鼠拍摄，计算伤口面积。图6a为用药组的SD大鼠创伤时的照片，图6b为用药组的SD大鼠用药4天后的照片，图6c为用药组的SD的大鼠用药8天后的照片，图6d为用药组的SD大鼠用药12天后的照片。从图6a～图6d可以看出用药组的SD大鼠创伤面积逐渐缩小，说明成纤维细胞的细胞分泌液可有效治愈创伤。
实验对照组：采用含庆大霉素的无菌生理盐水涂覆在烫伤的SD大鼠上，庆大霉素的浓度为2万单位/mL，每天3次，每次1mL。每隔四天对SD大鼠拍摄，计算伤口面积。图7a为实验对照组的大鼠创伤时的照片，图7b为实验对照组的SD大鼠用药4天后的照片，图7c为实验对照组的SD大鼠用药8天后的照片，图7d为实验对照组的SD大鼠用药12天后的照片。从图7a～图7d可以看出实验对照组的SD大鼠创伤面积逐渐缩小。
空白对照组：采用无菌生理盐水涂覆在烫伤的SD大鼠上，每天3次，每次1mL。发现空白对照组的SD大鼠感染严重，创伤后死亡率高。
进一步对用药组和实验对照组的SD大鼠创面面积进行分析，所示。实验中每隔两天测量一次创面的大小。先使用透明纸覆盖创面，然后用记号笔沿创面边缘描绘，使用另一厚薄均匀的透明纸复制并剪取创面图案，使用万分之一的电子天平称取图案重量，以此转换创伤愈合时的不规则面积。换算公式为：
创面面积＝(创面图案重量/标准大小纸张重量)×标准面积
以创面面积为纵坐标，以时间为横坐标，用药组和实验对照组的SD大鼠创面面积随时间变化的结果如图8所示。从图8中可以看出两组的创伤面积随时间变化组件减小，并且用药组在用药11天之后创伤面积明显小于实验对照组。说明该成纤维细胞的细胞分泌液可有效治愈创伤。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种成纤维细胞，其特征在于，保藏号为CCTCC NO:C201684。
2.如权利要求1所述的成纤维细胞在制备创伤愈合药物中的应用。
3.一种成纤维细胞的细胞分泌液，其特征在于，所述细胞分泌液通过以下制备方法获得：
用细胞培养基培养如权利要求1所述的成纤维细胞，得到细胞培养液；以及
收集所述细胞培养液中的上清，得到所述细胞分泌液。
4.根据权利要求3所述的成纤维细胞的细胞分泌液，其特征在于，所述细胞分泌液中包括碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和转化生长因子-β1中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的成纤维细胞的细胞分泌液，其特征在于，所述细胞培养基包括基础培养基和细胞生长激素，所述基础培养基为DMEM/F12培养基，所述细胞生长激素包括胎牛血清、腺嘌呤和胰岛素；所述胎牛血清在所述细胞培养基中的体积百分含量为5％～10％，所述腺嘌呤在所述细胞培养基中的浓度为0.1mmol/L～0.2mmol/L，所述胰岛素在所述细胞培养基中的浓度为2μg/mL～8μg/mL。
6.如权利要求3～5中任一项所述的细胞分泌液在制备创伤愈合药物中的应用。
7.一种成纤维细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供饲养层细胞；
将未分化的胚胎干细胞移植至所述饲养层细胞上；以及
将所述胚胎干细胞和所述饲养层细胞置于诱导培养基中培养，诱导所述胚胎干细胞分化得到所述成纤维细胞。
8.根据权利要求7所述的成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述未分化的胚胎干细胞为未分化的人类胚胎干细胞，所述饲养层细胞为有丝分裂灭活的小鼠成纤维细胞。
9.根据权利要求7所述的成纤维细胞的制备方法，其特征在于，诱导所述胚胎干细胞分化得到所述成纤维细胞的操作具体为：将所述胚胎干细胞和所述饲养层细胞置于诱导培养基中培养21天～28天，培养的第4天～7天，在诱导培养基中额外添加人源骨形成蛋白-4，继续培养后得到所述成纤维细胞；其中，所述诱导培养基包括基础培养基和细胞生长激素，所述基础培养基为DMEM/F12培养基，所述细胞生长激素包括胎牛血清、腺嘌呤、胰岛素和氢化可的松。
10.根据权利要求7所述的成纤维细胞的制备方法，其特征在于，所述胎牛血清在所述诱导培养基中的体积百分含量为5％～10％，所述腺嘌呤在所述诱导培养基中的浓度为0.1mmol/L～0.2mmol/L，所述胰岛素在所述诱导培养基中的浓度为2μg/mL～8μg/mL，所述氢化可的松在所述诱导培养基中的浓度为0.3μg/mL～0.7μg/mL，所述人源骨形成蛋白-4在所述诱导培养基中的浓度为0.3nmol/L～0.7nmol/L。
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