CN110093310A - 一种将成纤维细胞转化为永生化细胞的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导成纤维细胞转化为永生化细胞的方法及其应用。所述方法包括以下步骤：将成纤维细胞培养在培养基中，在培养基中加入Myosin抑制剂，继续培养，直至得到永生化细胞。本发明还涉及诱导成纤维细胞转化为永生化细胞的培养基。本发明的方法只需单个小分子或单因素处理，操作简单，重复性好，并且在体内体外均可高效进行，不涉及转基因操作，获得的永生化细胞安全性好，适用于了解细胞生长规律、探索细胞衰老原因、解决器官移植问题，还能够为治疗肿瘤、控制肿瘤细胞的增殖奠定一定的基础，具有重要的意义。

Description

一种将成纤维细胞转化为永生化细胞的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种将成纤维细胞转化为永生化细胞的方法及其应用。
背景技术
正常组织来源的体细胞在通常的体外培养条件下可生长和分裂，但经过有限次的细胞传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡，这就限制了细胞培养技术的应用。细胞永生化(cell immortalization)是指细胞在体外培养过程中，由于自身基因变化或者各种外界刺激因素，从增殖衰老的危机中逃离，避免了正常细胞的衰老死亡过程，可以长期传代培养、无限分裂增殖。
对于细胞永生化的机制和方法已经进行了大量的研究，已经证实，放射性因素、端粒酶激活、病毒基因转染、原癌基因与抑癌基因等均可以导致细胞的无限增殖分裂。但经过多年的研究发现，虽然永生化的机制有相似之处，但同样的永生化方法并非适用于所有细胞。例如，肝细胞永生化的方法有抑癌基因敲除、质粒转导和病毒转染、可恢复性永生化等，上皮细胞永生化的方法有DNA致瘤病毒转染等，心肌细胞永生化的方法有P16慢病毒载体和可逆SV40病毒转导途径成功的案例。
成纤维细胞(fibroblast)是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。
目前，现有技术已经披露了一些诱导成纤维细胞转化为永生化细胞的方法。王新文等(“皮肤成纤维细胞永生化的研究进展”，中国生物工程杂质，第22卷第4期，2002年8月)披露了皮肤成纤维细胞永生化的方法，除了以上常用的方法外，总的概括起来还有以下几种方法：HPV、四硝基喹啉一氧化物、黄曲霉素等。
针对性发展对特定细胞的永生化技术可以实现具有传代次数少、增殖分裂慢的正常体细胞的长期传代、无限分裂增殖，增加细胞周期寿命。这不仅有助于了解细胞生长规律、探索细胞衰老原因，还对解决器官移植问题有着重要的临床意义。
另外，资料显示，细胞永生化是转化为肿瘤细胞的前提，是由正常细胞转化为肿瘤细胞所必经的阶段，研究细胞的永生化可以为治疗肿瘤、控制肿瘤细胞的增殖奠定坚实的基础。
因此，针对成纤维细胞转化为永生化细胞的研究有着广阔的应用前景。
发明内容
本发明人经过不断的探索，意外地发现可以通过Myosin抑制剂(-)-Blebbistatin实现上述目的。
因此，本发明涉及Myosin抑制剂在诱导细胞永生化中的应用。
优选地，所述永生化为诱导成纤维细胞转化为永生化细胞。
优选地，所述Myosin抑制剂为(-)-Blebbistatin。
本发明还涉及一种诱导成纤维细胞转化为永生化细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将成纤维细胞培养在培养基中，在培养基中加入Myosin抑制剂，继续培养，直至得到永生化细胞。
优选地，所述培养基包括基础培养液、胎牛血清和永生化诱导培养液中的任一种或几种。
本发明还涉及一种诱导成纤维细胞转化为永生化细胞的培养基，其特征在于，其包括Myosin抑制剂、基础培养液、胎牛血清和永生化诱导培养液。
优选地，所述基础培养液包括高糖DMEM和双抗，和/或，所述永生化诱导培养液包括N2B27培养液：(DMEM/F12、Neurobasal的1:1混合物)、N2添加剂、B27添加剂、2％牛血清白蛋白、β-巯基乙醇、GlutaMAX、胰岛素和双抗。
优选地，所述永生化诱导培养液进一步包括KOSR、CHIR99021和A83-01中的一种或几种。
本发明还涉及通过所述的方法获得的永生化细胞，或者包含所述永生化细胞的试剂或研究工具或诊断工具。
本发明还涉及基因在制备诱导增殖或衰老的制剂中的应用，其特征在于，所述基因包括Sox2、Srrt、Yap、β-catenin、Mki67、Pcna、P19、P16ink4a、P15ink4b、Morf4l1、Elf5中的一种或几种。
优选地，增殖相关基因包括Sox2、Srrt、Yap、β-catenin、Mki67、Pcna中的一种或几种。优选地，衰老相关基因包括P19、P16ink4a、P15ink4b、Morf4l1、Elf5中的一种或几种。
本文中的术语的含义如下：
高糖DMEM：一种高糖型DMEM培养基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)，即一种含各种葡萄糖和氨基酸的商品化的培养基，在MEM培养基的基础上研制的。
N2B27：一种以DMEM/F12基础培养基和neurobasal基础培养基以1:1混合而成，包含N2添加剂和B27添加剂的成分明确的细胞培养液，报道有利于小鼠胚胎干细胞向神经方向分化。
DMEM/F12：一种以DMEM培养基和F12培养基1:1混合而成的商品化的基础培养液，适于克隆密度的培养。
Neurobasal：有利于神经细胞培养的商品化基础培养基。
GlutaMAX：一种细胞培养添加剂，可直接替代细胞培养基中的L-谷氨酰胺。
双抗：青霉素和链霉素是细胞培养常用的两种抗生素，防止细胞培养过程中的细菌污染。
N2添加剂：一种商品化无血清的细胞培养添加剂。
B27添加剂：一种商品化无血清的细胞培养添加剂。
KOSR：商品化血清替代物(Knockout serum replacement，KOSR)。
CHIR99021：一种GSK-3α/β抑制剂，常用作Wnt信号通路激活剂。
A83-01：一种具有选择性的TGF-β抑制剂，能够显著抑制ALK4，ALK5和ALK7的活性。
本发明的方法只需单个小分子或单因素处理，操作简单，重复性好，并且在体内体外均可高效进行，不涉及转基因操作，获得的永生化细胞安全性好，适用于了解细胞生长规律、探索细胞衰老原因、解决器官移植问题，还能够为治疗肿瘤、控制肿瘤细胞的增殖奠定一定的基础，具有重要的意义。本发明还发现了增殖相关基因和衰老相关基因，为诱导细胞的增殖和衰老提供了一种全新的选择。
附图说明
图1A为实施例的实验流程。
图1B显示了荧光显微镜观察的结果。
图1C和图1D显示了绘制的细胞生长曲线和计算出的细胞周期。
图1E和图1F显示了细胞周期组成分析的结果。
图1G和图1H显示了增殖和衰老基因的检测结果。
具体实施方式
以下通过具体实施例来详细阐述和说明本发明的实施方式，但以下内容不应理解为对本发明作任何限制。
实施例一：由成纤维细胞向永生化细胞的转化
以12孔板为例(corning，3335)每孔用20μg/mL基质胶溶液(BD，354277)1×DMEM配制，包被12小时，去掉包被液用1×PBS冲液洗一遍。
将小鼠胚胎成纤维细胞(C57，E13.5制备)或尾尖成纤维细胞(出生后一周或成年小鼠制备)均匀种于每一个孔，每孔2×104个细胞，用基础培养液(高糖DMEM(Gibco，C12430500BT)，双抗)加10％胎牛血清(Gibco，16000-044)培养24小时。去除培养液，PBS洗一遍。
将经上述处理后的成纤维细胞加入永生化诱导培养液：(N2B27培养液：DMEM/F12(gibco，10565018)与Neurobasal(Gibco，21103-049)1比1混合，加入N2添加剂(100×，Gibco，17502048)，B27添加剂(50×，Gibco，17504044)，2％牛血清白蛋白(1000×，sigma，A8022)，β-巯基乙醇(1000×，Gibco，21985023)，GlutaMAX(100×，Gibco，35050-061)，1μg/ml胰岛素(Roche，11376497001)，双抗)。加入10％KOSR(gibco，12618013)、3μM的CHIR99021(stemgent，04-0004-10)、10μM的A83-01(stemgent，04-0014)和25μM的Myosin抑制剂(-)-Blebbistatin(MCE，HY-13441)。培养21～28天后鉴定，实验流程见图1A。
永生化细胞SMPC的鉴定主要包括以下几个方面：
干细胞标志物染色。实验方法如下：首先用PBS 1:40稀释Stem Cell CDy1Dye，制成CDy1稀释缓冲液，然后用培养液1:100稀释CDy1稀释缓冲液制成CDy1染色液。去掉培养液后加入CDy1染色液，在37℃CO2培养箱中染色1小时，用PBS洗涤三次后，加入培养液在在37℃CO2培养箱中褪色3小时。用荧光显微镜观察，结果见图1B，其中Merge表示重合图。未处理的小鼠成纤维细胞不能被CDy1着色；经永生化诱导培养液处理的细胞，我们称之为SMPC，能够被CDy1着色，标志其获得了“干性”。
细胞生长曲线绘制。实验方法如下：将永生化细胞SMPC(第二代和第四代的小鼠胚胎成纤维细胞做对照)按照每孔2×104个细胞均匀接种于12孔板中。每隔24小时用血球计数板计数，绘制细胞生长曲线，并计算出细胞周期。结果见图1C和图1D。SMPC在起始细胞量相同的情况下，能够迅速增殖，在24、48、72、96小时，细胞量显著高于对照(P＜0.001)。经计算得到的细胞周期可见，SMPC的细胞周期长度为16小时，较第二代和第四代的小鼠胚胎成纤维细胞细胞周期长度：36小时和45小时显著缩短(P＜0.001)。
细胞周期组成分析。实验方法如下：将永生化细胞(小鼠胚胎成纤维细胞和小鼠胚胎干细胞做对照)用0.25％胰酶消化后，用DMEM+10％FBS终止后离心，弃上清，用培养液重悬后过400目细胞筛，经MoFlo XDP高速多色流式细胞分选仪分析细胞周期。结果见图1E和图1F。永生化细胞SMPC均一性增强，与小鼠胚胎干细胞相似。且永生化细胞SMPC较小鼠胚胎成纤维细胞G0/G1期缩短，S期增长，与小鼠胚胎干细胞相似。
实施例二：增殖和衰老基因的检测
实验方法如下：收集永生化细胞SMPC(小鼠胚胎成纤维细胞作对照)。(a)用试剂盒法提取RNA。向细胞沉淀中加入适量TRIzol裂解细胞，加入1/5体积的三氯甲烷，涡旋混匀后冰上静置3分钟，10000g，4℃离心15分钟。将上层水相转移到新的离心管中，加入等体积75％乙醇后一并转移到吸附柱中，10000g离心15秒，弃收集管中液体，Wash Buffer I洗一次后，在吸附膜上添加10μL DNase I+70μL Buffer RDD，室温孵育15分钟以消化DNA，随后用350μL Wash Buffer I洗一次，500μL Wash Buffer II洗一次，用RNase-Free Water洗脱RNA。用紫外/可见光分光光度计测定浓度。(b)将RNA反转录为cDNA。在2μg的RNA样品中加入随机引物、dNTP后于65℃加热5分钟以去除RNA高级结构，随后于冰上淬火3分钟使RNA模板和随机引物结合。加入反转录酶、RNA酶抑制剂，于42℃反转录1小时得到cDNA。(c)进行实时荧光定量PCR检测增殖和衰老相关基因。
PCR反应体系如下：7.5μL SYBR Green Real Time PCR Master Mix，2μL Plussolution，0.5μL引物(上下游混合)，0.5μL cDNA，4.5μL双蒸水。PCR反应程序如下：扩增曲线：95℃，2min，95℃变性15秒，62℃退火15秒，72℃延伸45秒，并在在延伸结束后检测荧光信号。熔解曲线：95℃变性1分钟，57℃退火30秒，缓慢复性至95℃维持30秒。该实验在Agilent公司MX3005P荧光实时定量PCR仪上完成，以Actb作为内参基因，结果用△△Ct法处理。结果见图1G和图1H。永生化细胞SMPC增殖相关基因：Sox2，Srrt，Yap，β-catenin，Mki67，Pcna较小鼠胚胎成纤维细胞表达量升高，而衰老相关基因：P19，P16ink4a，P15ink4b，Morf4l1，Elf5较小鼠胚胎成纤维细胞表达量降低。
前面仅仅示出了本发明的原理，应理解，本发明的范围不预期限制在本文所述的示例性方面，而应包括所有当前已知的和未来开发的等同物。另外，应当指出，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以作出若干改进和修改，这些改进和修改也应被视为本发明的范围。

Claims (10)

1.Myosin抑制剂在诱导细胞永生化中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述永生化为诱导成纤维细胞转化为永生化细胞。
3.一种诱导成纤维细胞转化为永生化细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将成纤维细胞培养在培养基中，在培养基中加入Myosin抑制剂，继续培养，直至得到永生化细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养基包括基础培养液、胎牛血清和永生化诱导培养液中的任一种或几种。
5.一种诱导成纤维细胞转化为永生化细胞的培养基，其特征在于，其包括Myosin抑制剂、基础培养液、胎牛血清和永生化诱导培养液。
6.如权利要求1所述的应用、权利要求3所述的方法或如权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述Myosin抑制剂为(-)-Blebbistatin。
7.如权利要求4所述的方法或如权利要求5-6中任一项所述的培养基，其特征在于，所述基础培养液包括高糖DMEM和双抗，和/或，所述永生化诱导培养液包括N2B27培养液(DMEM/F12、Neurobasal的1:1混合物)、N2添加剂、B27添加剂、2％牛血清白蛋白、β-巯基乙醇、GlutaMAX、胰岛素和双抗。
8.如权利要求4或7所述的方法或如权利要求5-7中任一项所述的培养基，其特征在于，所述永生化诱导培养液进一步包括KOSR、CHIR99021和A83-01中的一种或几种。
9.通过权利要求3-4、6-8中任一项所述的方法获得的永生化细胞，或者包含所述永生化细胞的试剂或研究工具或诊断工具。
10.基因在制备诱导增殖或衰老的制剂中的应用，其特征在于，所述基因包括Sox2、Srrt、Yap、β-catenin、Mki67、Pcna、P19、P16ink4a、P15ink4b、Morf4l1、Elf5中的一种或几种；优选地，增殖相关基因包括Sox2、Srrt、Yap、β-catenin、Mki67、Pcna中的一种或几种；优选地，衰老相关基因包括P19、P16ink4a、P15ink4b、Morf4l1、Elf5中的一种或几种。
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