JP7407469B2 - 細胞誘導の方法 - Google Patents
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- C12N2510/00—Genetically modified cells
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Description
この培地は、基礎培地と、誘導小分子の組み合わせとを含み、前記誘導小分子の組み合わせはSGまたは6TFであり、SはSB431542、GはGSK126、6はE61541、Tはトラニルシプロミン、Fはフォルスコリンである。しかしながら、線維芽細胞の脂肪細胞への分化転換を誘導して疾患の研究、治療、およびより広範な適用に使用するために、より多くの小分子化合物を探索する必要がある。
究とアプリケーションをサポートすることに寄与する。
n阻害剤の使用に係る。
合以外に、特許請求の範囲では「または」という用語を使用して「および/または」を表すが、本開示内容は代替案のみを指すこと及び「および/または」の定義をサポートしている。本文で使用されているように、「もう一つの/別の」は、少なくとも2つめの、またはそれ以上を意味することができる。
BMP4:骨形成タンパク質4(bone morphogenetic protein,bmp4)。
高グルコースDMEM:高グルコースDMEM培地(dulbecco‘s modified eagle medium,DMEM)、すなわち、MEM培地をベースにして開発された、様々なグルコースとアミノ酸を含む市販の培地。
N2B27:DMEM/F12基礎培地とneurobasal基礎培地を1:1で混合した、N2添加剤とB27添加剤を含む成分がはっきりしている細胞培養液である。マウス胚性幹細胞の神経系への分化に寄与すると報告されている。
DMEM/F12:クローン密度の培養に適した、DMEM培地とF12培地を1:1で混合した市販の基礎培養液。
Neurobasal:神経細胞培養に寄与する市販の基礎培地。
GlutaMAX:細胞培地中のL-グルタミンを直接に置き換えることができる細胞培養添加剤。
二重抗生:ペニシリンとストレプトマイシンは、細胞培養中に細菌の混入を防ぐために細胞培養で一般的に使用される2つの抗生物質である。
N2添加剤:市販の無血清細胞培養添加剤。
B27添加剤:市販の無血清細胞培養添加剤。
KOSR:市販の血清の代替物(Knockout serum replacement,KOSR)。
CHIR99021:Wntシグナル伝達経路の活性化剤としてよく使用されるGSK-3α/β阻害剤。
A83-01:ALK4、ALK5、及びALK7の活性を顕著に阻害できる選択的TGF-β阻害剤。
線維芽細胞の脂肪細胞への転換
12ウェルプレートを例にして(corning,3335)、各ウェルに1×DMEMで調製した20μg/mlマトリゲル溶液(BD,354277)を、12時間コーティングした後、コーティング溶液を除去して1×PBSフラッシング溶液で一回洗浄した。
Fixativeを加えて10~15分間固定した後、固定液を除去して、流動する空気中に10~15分間放置した。この時、ORO Stain A:ORO Stain
B=3:2の比率でORO Stainを配置し、混合した後10分間静置してからウェルに加え、15分間染色した後、染色液を除去し、60%イソプロパノールを加えて20~30秒間すすぎ、蒸留水で3回洗浄して光学顕微鏡下で写真を撮った。中性脂肪は橙赤色または赤橙色を呈し、リン脂質はピンク色を呈した。ヒト包皮線維芽細胞を誘導して得られた脂肪細胞のオイルレッドO染色は図1Bに示す。
O染色を図1Eに示し、脂肪滴面積の統計を図1Fに示す。
インビボ実験:同じバッチの6~8週間のICRメスマウスを選択し、ランダムに二つの群に分け、各群で5匹ずつとした。一つの群に対して、小分子(-)-Blebbistatinまたは(S)-(-)-Blebbistatin O-Benzoate(0.5mg/kg、10%DMSO+2%Tween80+生理食塩水に溶解)をマウスの腹側に注入し、もう一つの群に対し、小分子群と同じ量のDMSOを、実験群と同じ注射方法で注射した。1日1回注射し、19日間注射した後、薬剤を32日間停止し、マウスを頸椎脱臼により殺処分して腹側脂肪の含有量を観察した。その結果は図2に示す。小分子処理群は腹側脂肪の含有量を有意に増加することができる。詳細は図2A、図2Bに示す。また、(-)-Blebbistatinの代わりに(S)-(-)-Blebbistatin O-Benzoateで処理すると、腹側脂肪の含有量を増加することができる。実験の結果では、最適化していない場合には、腹側脂肪の含有量が約50%増加したことは示されている。
線維芽細胞の不死化細胞への転換
12ウェルプレートを例にして(corning,3335)、各ウェルに1×DMEMで調製した20μg/mlマトリゲル溶液(BD,354277)を、12時間コーティングした後、コーティング溶液を除去して1×PBSフラッシング溶液で一回洗浄した。
後、CDyl染色液を加え、37℃ CO2インキュベーターで1時間染色し、PBSで3回洗浄した後、培養液を加えて37℃ CO2インキュベーターで3時間退色した。蛍光顕微鏡下で観察し、その結果を図3Bに示す。その中で、Mergeは重ねた図を表す。未処理のマウス繊維芽細胞はCDylで着色できなかった。SMPCと呼ばれる、不死化誘導培養液で処理された細胞は、CDylで着色でき、「幹細胞性」を得たことは示される。
増殖および老化遺伝子の検出
実験方法は次の通りである。不死化細胞SMPC(マウス胚性線維芽細胞を対照として使用)を収集した。(a)キット法を用いてRNAを抽出した。細胞ペレットに適量のTRIzоlを加えて細胞を溶解し、1/5容量のクロロホルムを加え、ボルテックスして均一に混合した後、氷上に3分間静置し、10000g、4℃で15分間遠心分離した。上層の水相を新しい遠心チューブに移し、等容量の75%エタノールを加えて一緒に吸着カラムに移し、10000gで15秒間遠心分離し、コレクションチューブ内の液体を捨てた。Wash Buffer Iで1回洗浄した、10μL DNase I+70μL Buffer RDDを吸着膜に添加し、室温で15分間インキュベーションしてDNAを消化してから、350μL Wash Buffer Iで1回洗浄し、500μL Wash Buffer IIで1回洗浄し、RNase-Free WaterでRNAを溶出した。紫外/可視光分光光度計で濃度を測定した。(b)RNAをcDNAに逆転写した。2μgのRNAサンプルにランダムプライマー、dNTPを加えた後、65℃で5分間加熱してRNAの高次構造を除去し、そして氷上で3分間クエンチしてRNAテンプレートとランダムプライマーを結合させた。逆転写酵素とRNA酵素阻害剤を加え、42℃で1時間逆転写してcDNAを取得した。(c)増殖および老化関連遺伝子をリアルタイム蛍光定量PCRにより検出した。
Time PCR Master Mix、2μL Plus solution、0.5μLプライマー(上流および下流プライマーを混合)、0.5μL cDNA、4.5μL再蒸留水。PCR反応プロセスは次の通りである。増幅曲線:95℃、2分間、95℃で15秒間変性し、62℃で15秒間アニーリングし、72℃で45秒間延伸し、延伸が完了した後に蛍光シグナルを検出した。融解曲線:95℃で1分間変性し、57℃で
30秒間アニーリングし、95℃にゆっくりとアニーリングさせて30秒間維持した。この実験は、Agilent社MX3005P蛍光リアルタイム定量PCR装置上で行われ、Actbを内部参照遺伝子とし、結果はΔΔCt法で処理された。結果を図1Gと図1Hに示す。不死化細胞SMPC増殖の関連遺伝子:Sox2、Srrt、Yap、β-catenin、Mki67、Pcnaの発現量は、マウス胚性線維芽細胞の発現量より高かったが、老化関連遺伝子:P19、P16ink4a、P15ink4b、Morf4l1、Elf5は、マウス胚性線維芽細胞の発現量より低かった。
成体マウス初代肝細胞の分離とインビトロでの増殖
Alb-CreマウスはBRL MEDICINEから導入され、Creリコンビナーゼは、アルブミンを発現する成熟肝細胞でのみ発現された。Rosa26/mTmGマウスはCharles riverから導入され、Rosa26部位で赤緑蛍光レポーターシステムが組み込まれたマウスであり、通常の状況下では、細胞はTomato赤色蛍光タンパク質を発現し、cre組換えのある場合には、緑色GPF蛍光を発現する。Alb-Cre成体マウスとRosa26/mTmGマウスを交配して生まれたAlb-Cre×Rosa26/mTmGマウスの成熟肝細胞を緑色にマークし、他の組織細胞は赤色を発現した。
殖に対して類似した効果を持っており、処理された肝細胞がインビトロで20世代以上継代できることは示された。
インビトロでのヒト胚性肝細胞の増殖
1、実験手順
(1)プレートのコーティング マウス尾コラーゲン(Thermo scientific,A1048301、3mg/mL)でコーティングされた培養プレートの濃度は5μg/cm2であり、24ウェルプレートを例にすると、各ウェルの底面積は1.9cm2であるので、各ウェルに9.5μg(約3.2μl)が必要である。3.2μlのマウス尾コラーゲンを取り、500μlの20mM氷酢酸に溶解し、ウェルに加え、37℃の細胞インキュベーターで1時間インキュベーションし、吸い取って廃棄した後、PBSで3回洗浄した。
播種密度で、細胞をそれぞれマウス尾コラーゲンでコーティングした24ウェルプレートに播種した(上述のように)。対照群の初代継代培養の72時間後にほとんどの細胞が死亡し、少数の細胞しか残っていなかったため、これらの細胞はすべて播種された。2日ごとに培養液を交換し、144時間(6日)培養を続けた後、細胞を消化してカウントし、この時の細胞数と播種時の細胞数との比は、二世代の継代の増殖倍数となる。各ウェルの細胞培養上澄を取ってヒトアルブミンの濃度を検出し、一部の細胞(細胞数の2/5)をRNAの抽出及びヒト肝細胞関連遺伝子の発現の検出に使用した。
ヒト胚性肝細胞を液体窒素で3年半凍結保存した後の回復率は約5.8%であった。図5Aと図5Bに示すように、小分子培地で12日間継代(合計3世代)培養した後、10μMの小分子培地は約22.1倍(SD=4.2)で増幅させることができ、20μMの小分子培地は約13.0倍(SD=3.39)で増幅させることができた。この時、細胞形態は依然として典型的な肝細胞形態であり、不規則な多角形を呈した。しかし、対照群の培地で継代培養した後、初代継代培養後にほとんどの細胞が死亡したため、残った小部分の細胞は培養されて12日に増幅倍数が58.3倍になった(SD=13.9)が、この時の細胞は、細長い扁平な典型的な肝細胞形態を呈した。図5Cに示すようにヒト肝細胞特異的遺伝子であるアルブミン(ALBUMIN)とアルファフェトプロテイン(Alpha fetoprotein)をリアルタイムPCRで検出した。その結果、ヒト肝細胞は10μMと20μM小分子培地で12日間継代培養した後、依然としてヒト肝細胞特異的遺伝子を発現し、これに対して、対照群の培地で12日間継代して得られた細胞から、非常に低いアルブミン発現が検出され、アルファフェトプロテイン遺伝子の発現が検出できず、この時の細胞がもはや肝細胞ではないことは示されている。これは、図5Aと図5Cの結果と一致している。
ヒト成体肝細胞の小分子増幅
1、実験手順
(1)プレートのコーティング方法は上記の通りである。
Male human、BioreclamationIVT)を取り出してすぐに37℃の水浴ナベに入れ、溶解した後すぐに37℃に予熱した5mL肝細胞播種培地(InVitroGRO CP Medium)に加え、カウントした後、9×104/ウェルで24ウェルプレートに播種し、肝細胞が壁に2~4時間付着した後、肝細胞播種培地を吸引して捨て、それぞれ肝臓細胞培養対照培地、10μm小分子培地、および20μm小分子培地を加えた。2日ごとに培養液を交換した。2日目に写真から細胞数を推算した。4日後に20μm小分子培地群を10μm小分子培地に変更して培養した。共培養の6日目に細胞をカウントした。一部の細胞を取り、RNAの抽出及びヒト肝細胞特異的遺伝子の発現の検出に使用した。
、48時間後に細胞を収集してCYP1A2遺伝子の発現を検出した。
成人肝細胞の播種後5時間の壁への付着率はほぼ同じであり、2日後には、対照群、10μm小分子群、および20μm小分子群の細胞はいずれも大量に死亡した。写真を撮って細胞の壁への付着率を推算した(2.53×104、SD=0.09)。4日目に、小分子群の細胞には増幅クローンが現れたが、対照群には有意な増幅はなかった。この時、20μm培地群は10μm小分子培地に変更された(protocol#と命名され、すなわち、20μmで4日間培養し、10μmで2日間培養した)。引き続き2日間培養した後、小分子群の細胞クローンはさらに増幅したが、対照群には明らかな変化はなかった(図6A)。6日間培養した後、細胞数はそれぞれ、対照群では1.59×104(SD=0.28)、10μm群では6.47×104(SD=1.24)、#群では9.47×104(SD=0.98)であった(図6B)。6日目の細胞数と2日目の細胞数との比は、細胞増幅倍数となる。その結果、小分子が成人肝細胞に対して有意な増幅効果を有することは示された(図6Aと図6B)。小分子群の増殖細胞核抗原遺伝子(PCNA)の発現は、対照群より有意に高く、小分子が細胞増殖に影響を与えることはさらに証明された(図6C)。小分子によって増幅された成人肝細胞は、依然としてヒト肝細胞特異的遺伝子であるアルブミン(ALBUMIN)、アルファフェトプロテイン(AFP)、CYP1A2、CYP3A4を発現した(図6D)。10μm小分子培地はヒト肝細胞を継代培養できたが、対照群培地は成人肝細胞を継代培養できなかった(図6E)。継代培養された成人肝細胞をオメプラゾールによって誘導した後、CYP1A2遺伝子の発現を増加させることができる。これは、小分子によって増幅された肝細胞が依然として機能を有することを示唆している(図6F)。
Claims (4)
- インビトロでの肝細胞増殖の誘導における(-)-Blebbistatinまたは(-)-Blebbistatin O-Benzoateの使用。
- (-)-Blebbistatinまたは(-)-Blebbistatin O-Benzoateによって増殖を誘導された肝細胞のバイオ人工肝臓の構築における使用。
- (-)-Blebbistatinまたは(-)-Blebbistatin O-Benzoateによって増殖を誘導された肝細胞の、該肝細胞により得られる肝臓疾患モデルの構築における使用。
- 肝細胞を培地で培養し、(-)-Blebbistatinまたは(-)-Blebbistatin O-Benzoateを培地に加え、インビトロでの肝細胞増殖を誘導するように培養を続けるステップを含む、インビトロでの肝細胞増殖を誘導する方法。
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