CN110093309B - 一种诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞的方法，包括以下步骤：将成纤维细胞培养在培养基中，在培养基中加入Myosin抑制剂和BMP4，继续培养，直至得到脂肪细胞。本发明还涉及诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞的培养基和应用。本发明的方法只需单个小分子或单因素处理，操作简单，重复性好，并且在体内体外均可高效进行，不涉及转基因操作，获得的脂肪细胞安全性好，适用于在组织再生、修复等领域和产业中应用。

Description

一种诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及细胞诱导技术领域，更具体涉及一种诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞的方法。
背景技术
转分化(transdifferentiation，也称为分化转移)是指一种类型的分化细胞转变成另一种类型的分化细胞的现象。目前已经可以实现多种类型的细胞的转分化，例如：将胚胎成纤维细胞、成软骨细胞和视网膜上皮细胞转分化为肌细胞，将B淋巴细胞转分化为巨噬细胞，将小鼠成纤维细胞转分化为功能性的神经细胞等等。
脂肪细胞(adipocyte)在成人体内大量存在，其组织又称脂肪组织，常呈白色，在幼儿期大量增殖，到青春期数量达到巅峰，此后数量一般不再增加。在正常动物和人类的体内，脂肪组织主要存在于腹腔内和腹部的皮下内，但肥胖患者的机体各个部位均会出现脂肪组织，如肾脏、肠系膜、皮下、腹腔等部位的周围，这表明可能分化为脂肪细胞的细胞不仅有脂肪前体细胞，在一些特定条件下，一些非脂肪前体细胞也能够分化为脂肪细胞，这颠覆了脂肪细胞是由脂肪前体细胞分化而来的传统观念。通过将非脂肪前体细胞转分化为脂肪细胞，也可以更清楚地了解脂肪细胞的转化机制，进而指导抑制肥胖药物的开发。
成纤维细胞(fibroblast)是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。将成纤维细胞转分化为脂肪细胞在诸多领域具有重要的应用，例如，将疤痕伤口中发现的最常见类型的肌成纤维细胞转分化为脂肪细胞可能在未来实现伤口不留疤痕，并且在皱纹皮肤中再生脂肪细胞，有可能衍生出新型抗衰老治疗策略。由此可见，实现非脂肪前体细胞尤其是成纤维细胞转分化为脂肪细胞具有重要的意义。
目前，现有技术已经公开了一些诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞的方法。CN104342401B公开了利用确定的细胞因子组合促进成纤维细胞转分化为脂肪细胞的方法，组合物的起效因子为表皮生长因子、肝细胞生长因子、地塞米松、胰岛素和PPARγ激动剂。CN104372024A公开了一种诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法，包括克隆牛转录因子CCAAT 增强子结合蛋白C/EBPβ基因，构建C/EBPβ基因过表达载体并包装获得重组腺病毒，腺病毒侵染牛成纤维细胞、成肌细胞实现上述细胞快速转分化为脂肪细胞。上述方法采用大量大分子物质或重编程过程，效率较低，安全性也存在一定的影响。
现已证实，小分子化合物也可以诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞，这能够提高转分化的速度、存活率和能力。例如，CN105754935A公开了一种诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞的诱导培养基，所述培养基包含基础培养基和诱导小分子组合，所述诱导小分子组合为SG或6TF，其中S为 SB431542、G为GSK126、6为E61541、T为苯环丙胺、F为毛喉素。但仍然需要探索更多的小分子化合物来诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞以用于疾病的研究、治疗和更广泛的应用。
发明内容
本发明人经过不断的探索，意外地发现可以通过Myosin抑制剂 (-)-Blebbistatin实现上述目的。
因此，本发明涉及Myosin抑制剂在诱导细胞转分化中的应用。
优选地，所述转分化为诱导成纤维细胞转分化。优选地，所述转分化为诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞。
优选地，所述Myosin抑制剂为(-)-Blebbistatin。
本发明还涉及一种诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞的方法，包括以下步骤：将成纤维细胞培养在培养基中，在培养基中加入Myosin抑制剂和 BMP4，继续培养，直至得到脂肪细胞。
优选地，所述培养基包括基础培养液、胎牛血清和脂肪诱导培养液中的任一种或几种。
优选地，所述基础培养液包括高糖DMEM、胎牛血清和双抗。
优选地，所述脂肪诱导培养液包括N2B27培养液(DMEM/F12、 Neurobasal的1:1混合物)、N2添加剂、B27添加剂、2％牛血清白蛋白、β- 巯基乙醇、GlutaMAX、胰岛素和双抗，以及血清替代物。
本发明还涉及通过所述的方法获得的脂肪细胞，或者包含所述脂肪细胞的试剂或研究工具或诊断工具。
本文中的术语的含义如下：
BMP4：骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein，bmp4)。
高糖DMEM：一种高糖型DMEM培养基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)，即一种含各种葡萄糖和氨基酸的商品化的培养基，在 MEM培养基的基础上研制的。
N2B27：一种以DMEM/F12基础培养基和neurobasal基础培养基以1:1 混合而成，包含N2添加剂和B27添加剂的成分明确的细胞培养液，报道有利于小鼠胚胎干细胞向神经方向分化。
DMEM/F12：一种以DMEM培养基和F12培养基1:1混合而成的商品化的基础培养液，适于克隆密度的培养。
Neurobasal：有利于神经细胞培养的商品化基础培养基。
GlutaMAX：一种细胞培养添加剂，可直接替代细胞培养基中的L-谷氨酰胺。
双抗：青霉素和链霉素是细胞培养常用的两种抗生素，防止细胞培养过程中的细菌污染。
N2添加剂：一种商品化无血清的细胞培养添加剂。
B27添加剂：一种商品化无血清的细胞培养添加剂。
本发明的方法只需单个小分子或单因素处理，操作简单，重复性好，并且在体内体外均可高效进行，不涉及转基因操作，获得的脂肪细胞安全性好，适用于在组织再生、修复等领域和产业中应用。
附图说明
图1中的A为实施例的实验流程。
图1中的B显示了由人包皮成纤维细胞诱导得到的脂肪细胞油红O染色。
图1中的C和图1中的D分别显示了由小鼠胚胎成纤维细胞得到的脂肪细胞形态及油红O染色以及脂滴面积比例。
图1中的E和图1中的F分别显示了在原脂肪诱导培养液中添加不同物质后的油红O染色和脂滴面积统计。
图2中的A和2中的B为小分子处理的体内实验结果，显示能显著提高腹侧脂肪的含量。图中的Ble为(-)-Blebbistatin。
具体实施方式
以下通过具体实施例来详细阐述和说明本发明的实施方式，但以下内容不应理解为对本发明作任何限制。
以12孔板为例(corning，3335)，每孔用20μg/ml基质胶溶液(BD， 354277)1×DMEM配制，包被12小时，去掉包被液用1×PBS冲液洗一遍。
将小鼠胚胎成纤维细胞(C57，E13.5制备)或成人包皮成纤维细胞 (HFF20y，北京干细胞库)均匀种于每一个孔，每孔1×104个细胞，用基础培养液(高糖DMEM(Gibco，C12430500BT)，双抗)加10％胎牛血清(Gibco， 16000-044)培养24小时。去除培养液，PBS洗一遍。
将经上述处理后的成纤维细胞加入脂肪诱导培养液：(N2B27培养液： DMEM/F12(Gibco，10565018)与Neurobasal(Gibco，21103-049)1比1 混合，加入N2添加剂(100×，Gibco，17502048)，B27添加剂(50×，Gibco， 17504044)，2％牛血清白蛋白(1000×，sigma，A8022)，β-巯基乙醇(1000×，Gibco，21985023)，GlutaMAX(200×，Gibco，35050-061)，1μg/ml胰岛素 (Roche，11376497001)，双抗)，10％血清替代物(Gibco，10828-028)加入Myosin抑制剂(二甲基亚砜溶解(sigma，D2650)的100mM浓储，-20 摄氏度避光保存1月)以及10ng/mL BMP4(Peprotech，10828-028)，培养 21天后鉴定，实验流程见图1中的A。
脂肪细胞的鉴定采用细胞油红染色，使用油红O染色液(细胞专用， Solarbio，G1262)，具体如下：去掉培养液，加入ORO Fixative固定10-15min 后，去掉固定液，放在流动的空气中10-15分钟。此时按照ORO Stain A： ORO Stain B＝3:2的比例配置ORO Stain，混合后静置10min后加入孔中，浸染15min后去掉染色液，加入60％异丙醇漂洗20-30s，并蒸馏水清洗3次后于光学显微镜下拍照，中性脂肪呈橙红色或橘红色，磷脂呈粉红色。由人包皮成纤维细胞诱导得到的脂肪细胞油红O染色见图1中的B。
由小鼠胚胎成纤维细胞得到的脂肪细胞形态及油红O染色如图1中的C，可见橙红色脂滴的形成，标志中性脂肪的出现。脂滴面积比例近13％，显著高于对照组(P＜0.01)，统计结果见图1中的D。
在原脂肪诱导培养液中添加10μM A83-01(stemgent，04-0014)显著提高了脂肪诱导效率，高达20％(P＜0.001)；或添加10μM SB431542(stemgent， 04-0010-10)也可显著提高脂肪诱导效率，达18％(P＜0.001)。若添加BMP 的抑制剂，脂肪诱导效率恢复至对照水平。油红O染色见图1中的E，脂滴面积统计见图1中的F。
体内实验：选取同批次6-8周ICR雌性小鼠，随机分成两组，每组5只，一组小分子(-)-Blebbistatin(0.5mg/kg，溶于10％DMSO+2％Tween 80+生理盐水)注入小鼠腹侧，另一组注射与小分子组处理相同计量的DMSO，注射形式同实验组。每天注射一次，注射19天后，停药32天，颈椎脱臼处死小鼠观察腹侧脂肪含量。结果如图2所示，小分子处理组能显著提高腹侧脂肪的含量，具体见图2中的A、2中的B。
前面仅仅示出了本发明的原理，应理解，本发明的范围不预期限制在本文所述的示例性方面，而应包括所有当前已知的和未来开发的等同物。另外，应当指出，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以作出若干改进和修改，这些改进和修改也应被视为本发明的范围。

Claims (8)

1.(-)-Blebbistatin在体外诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞中的应用。
2.一种在体外诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将成纤维细胞培养在培养基中，在培养基中加入(-)-Blebbistatin和BMP4，继续培养，直至得到脂肪细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基包括基础培养液、胎牛血清和脂肪诱导培养液中的任一种或几种。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基础培养液包括高糖DMEM、胎牛血清和双抗，和/或，所述脂肪诱导培养液包括N2B27培养液、N2添加剂、B27添加剂、2％牛血清白蛋白、β-巯基乙醇、Glutamax、胰岛素和双抗，以及血清替代物。
5.如权利要求3或4中任一项所述的方法，其特征在于，所述脂肪诱导培养液进一步包括A83-01和/或SB431542。
6.一种在体外诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞的方法中所使用的培养基，其特征在于，其包括(-)-Blebbistatin、BMP4、基础培养液、胎牛血清和脂肪诱导培养液。
7.如权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述基础培养液包括高糖DMEM、胎牛血清和双抗，和/或，所述脂肪诱导培养液包括N2B27培养液、N2添加剂、B27添加剂、2％牛血清白蛋白、β-巯基乙醇、Glutamax、胰岛素和双抗，以及血清替代物。
8.如权利要求6或7中任一项所述的培养基，其特征在于，所述脂肪诱导培养液进一步包括A83-01和/或SB431542。
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