CN105087476B

CN105087476B - 3t3-l1前脂肪细胞系的诱导分化方法

Info

Publication number: CN105087476B
Application number: CN201510548003.3A
Authority: CN
Inventors: 刘新农; 张锦航; 李天佳; 王占启; 刘昌伟
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2015-08-31
Publication date: 2018-12-07
Anticipated expiration: 2035-08-31
Also published as: CN105087476A

Abstract

本发明涉及脂肪细胞诱导领域，特别涉及3T3‑L1前脂肪细胞系的诱导分化方法：3T3‑L1前脂肪细胞系经复苏，培养，传代后，至长满培养基，继续培养36‑48小时后加入含有诱导剂的含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液进行诱导分化72‑96小时；诱导剂中地塞米松0.9‑1.1μM，IBMX 1.0mM，胰岛素1.8‑2.0μM；加入含有胰岛素和胎牛血清的高糖DMEM培养液继续诱导48‑96小时；之后每48小时换液一次，自加入诱导剂起第8‑10天成熟脂肪细胞可用。该诱导分化方法缩短整个3T3‑L1前脂肪细胞系的诱导过程，且脂肪细胞转化率稳定，不受细胞代数及细胞培养皿类型的影响，转化率误差在5％以内。

Description

3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化方法

技术领域

本发明涉及脂肪细胞诱导领域，具体而言，涉及3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化方法。

背景技术

随着人们生活水平的提高，肥胖及其相关疾病的发病率日益增加，由此而造成的家庭及社会经济负担不断加重。脂肪细胞代谢及功能紊乱是导致肥胖的核心机制之一，有关脂肪细胞的研究已成为目前研究热点。在体外研究中，脂肪细胞模型是研究脂肪代谢及其功能的重要工具。

3T3-L1前脂肪细胞系源于小鼠胎盘的成纤维细胞群，细胞形态上类似成纤维细胞，呈长梭形。研究发现它是一种能够增殖并在一定条件下向脂肪细胞分化的前体细胞。目前，现已成为诱导分化为脂肪细胞最为常用的细胞系。

对3T3-L1前脂肪细胞系而言，传统诱导方法是在3T3-L1前脂肪细胞融合2天后，用加入含IBMX、地塞米松、胰岛素的培养基培养2天，后续再用含胰岛素的培养基培养2天，之后采用普通高糖DMEM培养基培养，此种方法既往称之为“鸡尾酒”诱导法。随着研究的深入，发现传统“鸡尾酒”诱导法存在诱导周期长、脂肪细胞转化率低且不均匀等缺点。此外，该诱导法还会受细胞的代数以及细胞培养皿类型的影响。如此以来，难以为研究者提供数量一致、分化稳定的脂肪细胞。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化方法，脂肪细胞转化率稳定，不受细胞代数及细胞培养皿类型的影响。其中，在在不同类型细胞培养器皿中诱导的脂肪细胞的转化率误差在5％以内。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化方法，包括以下步骤：

(a)、3T3-L1前脂肪细胞系经复苏，培养，传代后，至长满培养基，继续培养36-48小时后进行诱导分化；

(b)、所述诱导分化为：加入含有诱导剂的含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液，培养72-96小时；其中，所述诱导剂各成分在所述高糖DMEM培养液中的终浓度为：地塞米松0.9-1.1μM，IBMX 1.0mM，胰岛素1.8-2.0μM；

(c)、加入含有1.8-2.0μM胰岛素和10％胎牛血清的高糖DMEM培养液继续诱导48-96小时；之后每48小时换液一次，换液为含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，自加入诱导剂起第8-10天成熟脂肪细胞可用。

本发明提供的3T3-L1前脂肪细胞系诱导分化方法，参照传统“鸡尾酒”诱导法，通过延长诱导剂作用时间发现，该法可缩短整个3T3-L1前脂肪细胞系的诱导过程，且脂肪细胞转化率稳定，不受细胞代数及细胞培养皿类型的影响。其中，在不同类型细胞培养皿诱导的脂肪细胞的转化率误差在5％以内。

优选地，所述复苏为：

从液氮中取出细胞株，立即置于37±2℃水浴中，至细胞液完全溶解时取出，于室温1000-1200rpm离心3-5min，弃去上清，加入培养液，吹打重悬，将细胞悬液加入培养器皿中，然后将所述培养器皿置于5％±1％CO₂的37±2℃恒温培养箱中培养。

该复苏方法得到的细胞受伤害少，成活率高，减少了细胞的死亡率，也尽量避免了死细胞对活细胞生长的影响。

进一步地，所述培养液为含10％±2％小牛血清和1％±0.1％青链霉素的高糖DMEM培养液。该培养液进行培养细胞，不易被杂菌污染，并且细胞处于较低营养成分的生长环境中；后续通过营养成分更多的胎牛血清诱导，诱导效果更好。

为了利于细胞生长，更进一步地，所述细胞悬液的细胞浓度为1×10⁵-6×10⁵个/ml。

为了保持细胞良好的生长状态，优选地，所述培养为：每36-48小时更换1次培养液。

进一步地，更换培养液时，沿壁加入培养液。以使培养液充分滋养细胞，防止培养液对细胞造成损害。

优选地，细胞密度为75％-85％时进行所述传代。该细胞密度的细胞生长旺盛，传代效果好。

进一步地，所述传代具体为：移去培养液，用PBS溶液洗2-3次，加入胰蛋白酶消化28-35s，终止消化，吹打后，1000-1200rpm离心3-5min，去上清，加入培养液，吹打使细胞分散；取含有细胞的培养液加入孔板，置于5％±1％CO₂的37±2℃恒温培养箱中培养。

控制孔板中的细胞数目，来进一步控制细胞的生长状态，以提升转化率。进一步地，孔板中的细胞浓度为3×10⁵-5×10⁵个/ml。

为了便于培养，为后续的试验提供转化率稳定的成熟的脂肪细胞，进一步地，所述诱导分化在6-10cm培养皿或6-64孔板中的任一种中进行。如可以为6cm培养皿、10cm培养皿、6孔板、12孔板、24孔板、48孔板、64孔板等等。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化方法，通过延长诱导剂作用时间，缩短整个分化过程，该法脂肪细胞转化率稳定，数量一致，可为研究者提供稳定的脂肪细胞模型。

(2)本发明通过首先采用含小牛血清培养3T3-L1前脂肪细胞控制细胞的生长状态，后续的诱导剂则采用含胎牛血清的培养基培养，可有效促进脂肪细胞转化。

(3)本发明提供的3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化方法，其诱导分化不受细胞代数及细胞培养皿类型的影响，其中，不同类型细胞培养器皿中脂肪细胞的转化率误差在5％以内。

(4)本发明，整个诱导过程耗时8-10天即可将3T3-L1前脂肪细胞成功诱导为成熟脂肪细胞，而传统“鸡尾酒”法则需要12-14天时间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1提供的诱导剂作用时间为2天得到的成熟的3T3-L1脂肪细胞的油红O染色结果图；

图2为为本发明实施例1提供的诱导剂作用时间为3天得到的成熟的3T3-L1脂肪细胞的油红O染色结果图；

图3为为本发明实施例1提供的诱导剂作用时间为4天得到的成熟的3T3-L1脂肪细胞的油红O染色结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。

配置以下溶液：

1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液(IBMX)配制。分子量222，几乎不溶于水，现配现用，0.22μm过滤除菌；母液(50mmol/L)：11.5mg IBMX+940μl超纯水+60μl 1mol/L KOH。用法：每1ml完全培养基中加入10ul母液，终浓度为1.0mM/L。

2、胰岛素溶液配制。比较难溶，-20℃保存1个月，使用pH 2～3的稀盐酸溶液助溶，0.22μm过滤除菌。母液(1mg/ml)：10mg INS+10ml 0.01mol/L HCl。

3、地塞米松溶液配制。分子量516.41，0.22μm过滤除菌，-20℃保存1个月。使用无水乙醇溶解，母液(1mmol/L)：1mg溶于25ml无水乙醇。

4、Oil red工作液：将0.5g油红O加入100ml异丙醇，得到母液，4℃避光保存；使用时以母液与蒸馏水以体积比为3:2进行混合，用滤纸过滤后即为Oil red工作液。

下面以6孔板、10cm培养皿和6cm培养皿进为例行详细说明，但并不限于这些孔的培养板，如还可以为12孔板、24孔板、48孔板、64孔板以及更多孔的板等等。

实施例1

3T3-L1前脂肪细胞系的复苏：从液氮中取出细胞株，立即置于37±2℃水浴箱中，至细胞液完全溶解时取出，于室温1000rpm离心5min，弃去上清，加入培养液，吹打重悬，将重悬的细胞及培养液吸入培养皿中，显微镜下观察细胞形态及数量，使细胞悬液以3×10⁵个/ml加入培养器皿中，然后将所述培养器皿置于5％±1％CO₂的37±2℃恒温培养箱中培养；其中，培养液为含10％小牛血清和1％青链霉素的高糖DMEM培养液；

3T3-L1前脂肪细胞系的培养：显微镜下见细胞贴壁，呈梭行，透亮，细胞每3天更换1次培养液，倾斜培养皿，将培养液用移液管移去，沿壁加入培养液；

3T3-L1前脂肪细胞系的传代：显微镜下见细胞贴壁，呈梭形或多角形，细胞密度约80％，倾斜培养皿，将培养液用移液器移去，沿壁加入温热的PBS溶液6ml，晃动培养皿后，用移液器移去，重复一次，加入Trypsin进行消化，显微镜下见细胞由不规则多角形或梭形收缩成圆形，过程约30秒，加入培养液终止消化，用移液器吹打，使细胞脱离培养皿底，吸入离心管中，1000rpm离心4min，倾去上清，加入培养液，吹打使细胞分散，细胞浓度达到10⁵；取含有细胞的培养液分别加入到3个6孔板中，分别置于5％±1％CO₂的37±2℃恒温培养箱中培养，长满培养基，继续培养3天后均进行诱导分化；

3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化：加入含有诱导剂的10％胎牛血清的高糖DMEM培养液，三个6孔板分别培养2天、3天和4天；其中，诱导剂各成分在高糖DMEM培养液中的终浓度为：地塞米松1.0μM，IBMX 1.0mM，胰岛素1.9μM；显微镜下见少数细胞呈圆形，并有脂滴出现；

继续诱导：加入含有1.9μM胰岛素和10％体积百分数胎牛血清的高糖DMEM培养液继续诱导3天；之后每48小时换液一次，换液为普通高糖DMEM培养基。

将培养好的不同诱导分化时间的细胞用显微镜观察其生长状态，显微镜下见细胞基本呈圆形，细胞内含有多个较大的脂滴，即分化为成熟的脂肪细胞。

将培养好的不同诱导分化时间的细胞用油红染色，油红染色步骤如下：

(1)移去培养液，沿壁缓慢加入PBS 2ml，冲洗后移去，重复2次；

(2)用10％甲醛固定液固定细胞1小时；

(3)PBS 2ml冲洗3次，移去PBS；

(5)加入油红O染液，使染料全部覆盖细胞表面，放置10min；

(8)倒置显微镜下观察结果，取不同诱导天数的6孔板中的处于中间诱导转化率的细胞拍摄照片。

诱导分化2天的细胞倒置显微镜下观察的结果如图1所示；诱导分化3天的细胞倒置显微镜下观察的结果如图2所示；诱导分化4天的细胞倒置显微镜下观察的结果如图3所示。从图1-3可以明显地看出，诱导3-4天的细胞的诱导转化率明显高于诱导2天的细胞；并且统计诱导分化天数不同的6孔板中所有的孔中的细胞的诱导转化率，结果如表1所示。

表1 6孔板中不同孔中的细胞的诱导转化率

6孔板编号

诱导分化2天

诱导分化3天

诱导分化4天

	诱导转化率	诱导转化率	诱导转化率
				1	62％	84％	86％
2	60％	87％	87％
				3	78％	89％	85％
4	65％	85％	88％
				5	78％	88％	89％
6	88％	86％	90％

从表1可以看出，本发明提供的3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化方法，前脂肪细胞系转化率高且稳定，在6孔板中诱导的脂肪细胞的转化率误差在5％以内。

另外，改变诱导剂各成分的含量按照上述方法分别进行诱导培养不同的天数，如诱导剂各成分在高糖DMEM培养液中的终浓度为：地塞米松0.9μM，IBMX 1.0mM，胰岛素1.8μM；或诱导剂各成分在高糖DMEM培养液中的终浓度为：地塞米松1.1μM，IBMX 1.0mM，胰岛素2.0μM；得到的各6孔板的数据与上述结果一致。

实施例2

3T3-L1前脂肪细胞系的复苏：从液氮中取出细胞株，立即置于37±2℃水浴箱中，至细胞液完全溶解时取出，于室温1200rpm离心3min，弃去上清，加入培养液，吹打重悬，将重悬的细胞及培养液吸入培养皿中，显微镜下观察细胞形态及数量，使细胞悬液以6×10⁵个/ml加入培养器皿中，然后将所述培养器皿置于5％±1％CO₂的37±2℃恒温培养箱中培养；其中，培养液为含10％小牛血清和1.1％青链霉素的高糖DMEM培养液；

3T3-L1前脂肪细胞系的培养：显微镜下见细胞贴壁，呈梭行，透亮，细胞每2天更换1次培养液，倾斜培养皿，将培养液用移液管移去，沿壁加入培养液；

3T3-L1前脂肪细胞系的传代：显微镜下见细胞贴壁，呈梭形或多角形，细胞密度85％，倾斜培养皿，将培养液用移液器移去，沿壁加入温热的PBS溶液6ml，晃动培养皿后，用移液器移去，重复2次，加入Trypsin进行消化，显微镜下见细胞由不规则多角形或梭形收缩成圆形，过程28-35s，加入培养液终止消化，用移液器吹打，使细胞脱离培养皿底，吸入离心管中，1200rpm离心3min，倾去上清，加入培养液，吹打使细胞分散，细胞浓度达到5×10⁵个/ml；取含有细胞的培养液分别加入到10cm培养皿中，培养皿共分3组，每组20个，分别置于5％±1％CO₂的37±2℃恒温培养箱中培养，长满培养基，继续培养2天后均进行诱导分化；

3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化：加入含有诱导剂的10％胎牛血清的高糖DMEM培养液，3组分别对应培养2天、3天和4天；其中，诱导剂各成分在高糖DMEM培养液中的终浓度为：地塞米松1.1μM，IBMX 1.0mM，胰岛素1.8μM；显微镜下见少数细胞呈圆形，并有脂滴出现；

继续诱导：加入含有1.8μM胰岛素和10％胎牛血清的高糖DMEM培养液继续诱导2天即可。

采用实施例1中的油红染色方法进行染色，显微镜下观察后统计诱导分化天数不同的相同规格的培养皿中的细胞的诱导转化率，结果如表2所示。

表2 不同培养皿中的细胞的诱导转化率

从表2可以看出，本发明提供的3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化方法，前脂肪细胞系在相同规格的不同培养皿中转化率高且稳定，脂肪细胞的转化率误差在5％以内。

另外，改变诱导剂各成分的含量按照上述方法分别进行诱导培养不同的天数，如诱导剂各成分在高糖DMEM培养液中的终浓度为：地塞米松0.9μM，IBMX 1.0mM，胰岛素2.0μM；或诱导剂各成分在高糖DMEM培养液中的终浓度为：地塞米松1.0μM，IBMX 1.0mM，胰岛素1.9μM；得到的各培养皿的数据与上述结果一致。

实施例3

3T3-L1前脂肪细胞系的复苏：从液氮中取出细胞株，立即置于37±2℃水浴箱中，至细胞液完全溶解时取出，于室温1000rpm离心5min，弃去上清，加入培养液，吹打重悬，将重悬的细胞及培养液吸入培养皿中，显微镜下观察细胞形态及数量，使细胞悬液以1×10⁵个/ml加入培养器皿中，然后将所述培养器皿置于5％±1％CO₂的37±2℃恒温培养箱中培养；其中，培养液为含10％小牛血清和0.9％青链霉素的高糖DMEM培养液；

3T3-L1前脂肪细胞系的传代：显微镜下见细胞贴壁，呈梭形或多角形，细胞密度约75％，倾斜培养皿，将培养液用移液器移去，沿壁加入温热的PBS溶液6ml，晃动培养皿后，用移液器移去，重复3次，加入Trypsin进行消化，显微镜下见细胞由不规则多角形或梭形收缩成圆形，过程28-35s，加入培养液终止消化，用移液器吹打，使细胞脱离培养皿底，吸入离心管中，1000rpm离心5min，倾去上清，加入培养液，吹打使细胞分散，细胞浓度达到3×10⁵个/ml；取含有细胞的培养液分别加入到6cm培养皿中，培养皿共分3组，每组20个，分别置于5％±1％CO₂的37±2℃恒温培养箱中培养，长满培养基，继续培养3天后均进行诱导分化；

3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化：加入含有诱导剂的10％胎牛血清的高糖DMEM培养液，3组分别对应培养2天、3天和4天；其中，诱导剂各成分在高糖DMEM培养液中的终浓度为：地塞米松0.9μM，IBMX 1.0mM，胰岛素2.0μM；显微镜下见少数细胞呈圆形，并有脂滴出现；

继续诱导：加入含有2.0μM胰岛素和10％胎牛血清的高糖DMEM培养液继续诱导4天；之后每48小时换液一次，换液为普通高糖DMEM培养基。

采用实施例1中的油红染色方法进行染色，显微镜下观察后统计诱导分化天数不同的相同规格的培养皿中的细胞的诱导转化率，结果如表3所示。

表3 不同培养皿中的细胞的诱导转化率

从表3可以看出，本发明提供的3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化方法，前脂肪细胞系在相同规格的不同培养皿中转化率高且稳定，脂肪细胞的转化率误差在5％以内。

另外，改变诱导剂各成分的含量按照上述方法分别进行诱导培养不同的天数，如诱导剂各成分在高糖DMEM培养液中的终浓度为：地塞米松1.1μM，IBMX 1.0mM，胰岛素1.8μM；或诱导剂各成分在高糖DMEM培养液中的终浓度为：地塞米松1.0μM，IBMX 1.0mM，胰岛素1.9μM；得到的各培养皿的数据与上述结果一致。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.3T3-L1前脂肪细胞系的诱导分化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(b)、所述诱导分化为：加入含有诱导剂的含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液，培养72-96小时；其中，所述诱导剂各成分在所述高糖DMEM培养液中的终浓度为：地塞米松0.9-1.1μM，IBMX1.0mM，胰岛素1.8-2.0μM；

(c)、加入含有1.8-2.0μM胰岛素和10％胎牛血清的高糖DMEM培养液继续诱导48-96小时；之后每48小时换液一次，换液为含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，自加入诱导剂起第8-10天成熟脂肪细胞可用；

所述复苏为：

从液氮中取出细胞株，立即置于37±2℃水浴中，至细胞液完全溶解时取出，于室温1000-1200rpm离心3-5min，弃去上清，加入培养液，吹打重悬，将细胞悬液加入培养器皿中，然后将所述培养器皿置于5％±1％CO₂的37±2℃恒温培养箱中培养；

所述复苏中的培养液为含10％±2％小牛血清和1％±0.1％青链霉素的高糖DMEM培养液。

2.根据权利要求1所述的诱导分化方法，其特征在于，所述细胞悬液的细胞浓度为1×10⁵-6×10⁵个/ml。

3.根据权利要求2所述的诱导分化方法，其特征在于，细胞密度为75％-85％时进行所述传代。

4.根据权利要求3所述的诱导分化方法，其特征在于，所述传代具体为：移去培养液，用PBS溶液洗2-3次，加入胰蛋白酶消化28-35s，终止消化，吹打后，1000-1200rpm离心3-5min，去上清，加入培养液，吹打使细胞分散；取含有细胞的培养液加入孔板，置于5％±1％CO₂的37±2℃恒温培养箱中培养。

5.根据权利要求4所述的诱导分化方法，其特征在于，孔板中的细胞浓度为3×10⁵-5×10⁵个/ml。

6.根据权利要求1-5任一项所述的诱导分化方法，其特征在于，所述诱导分化在6-10cm培养皿或4-64孔板中的任一种中进行。