CN109097323A - 一种用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法。该方法为：将第2‑10代小鼠胚胎成纤维细胞接种到细胞培养瓶内，待细胞细胞贴壁生长至细胞密度为80%时，用胰酶消化，稀释，铺板。在37℃，5% CO₂的细胞培养箱中孵育24h后，向不同的孔中加入不同浓度的油酸进行诱导，在37℃，5% CO₂孵育24h后，诱导完成，进行油红O染色观察。本发明用不同浓度OA直接在体外诱导分化出脂肪细胞，成功率高，而且诱导周期短只需要24h，大大缩短了传统方法的诱导周期，而且该方法操作简单，诱导出的脂肪细胞形态均一，大小可控，为体外构建脂肪细胞模型提供了一个简单高效的方法。

Description

一种用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的 方法

技术领域

本发明涉及脂肪细胞诱导领域,尤其涉及一种用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法。

背景技术

由于人们生活水平的提高，肥胖人群和肥胖病的发病率也越来越多。世界卫生组织将肥胖定义为一种危及人体健康的体内堆积脂肪过多或分布异常的疾病。肥胖是一种慢性的持续状态, 以身体脂肪过多为特点.它是慢性疾病发生的主要诱因，可以诱发与心血管疾病相关的多种代谢功能异常，会增加2 型糖尿病、冠心病、中风、等的发病率和死亡率。所以目前对于肥胖的研究和治疗，也是越来越迫切。

肥胖问题的根本原因就是体内脂质代谢异常，摄入的能量大于消耗的能量，导致脂质在体内过度积累。脂肪组织作为主要的储脂组织，已有大量的研究关注于脂肪组织的脂代谢对于全身代谢的影响，越来越多的学者认为脂肪组织在代谢中占据着中心的位置。而脂肪细胞的脂质代谢异常和功能紊乱就是肥胖的核心机制之一，所以构建脂肪细胞模型是研究肥胖问题的一个关键途径。

由于从脂肪组织中分离高纯度且处于同一时期的脂肪细胞难度较大，因此人们对于脂肪细胞增殖分化及调控方面的了解主要来源于体外细胞培养模型。前体脂肪细胞系是目前应用最为广泛的模型，主要包括从小鼠胚胎中分离出来的3T3-L1、3T3-F442A和NIH3T3前体脂肪细胞系。3T3-L1由于它显示出强烈的接触抑制作用，细胞趋于同步化，所以能明确地识别已发生转化的细胞，且前体脂肪细胞分化过程与脂肪组织中前体脂肪细胞增生分化相似，因此脂肪前体细胞常用来体外研究脂肪细胞终末分化和脂肪形成。

对于3T3-L1前脂肪细胞系而言,传统诱导方法称之为“鸡尾酒”诱导法，即在3T3-L1前脂肪细胞完全汇合后开始，接触抑制2天后,用加入含有IBMX、地塞米松、胰岛素的培养基Ⅰ培养2天,后续再用含胰岛素的培养基Ⅱ培养2天,之后采用普通高糖培养基培养，2天换一次液，再培养4天。还有学者在此基础上加以改进，例如在培养基Ⅰ的基础上再加入吲哚美辛以增加诱导的成功率和分化效率，但总的诱导周期也并没有缩短。不难看出，传统诱导方法总的诱导时长至少需要8-10天，而且随着研究的深入,发现传统“鸡尾酒”诱导法不仅诱导周期长、而且脂肪细胞转化率低且诱导不均匀。此外,该诱导法对实验操作要求很高，在诱导过程中稍有不慎就会破坏细胞，导致无法诱导成功，还会受细胞的代数以及细胞培养皿类型的影响。如此一来,难以为研究者提供数量一致、分化稳定的脂肪细胞。

所以，一个操作简单、诱导率高、分化均一的体外诱导分化为脂肪细胞的方法对于目前构建脂肪细胞模型尤为迫切。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法。目的之二是提供这种构建脂肪细胞模型的方法在肥胖研究中的应用。

本发明技术方案如下。

一种用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，包括如下步骤：

步骤一、将第2-10代小鼠胚胎成纤维细胞（3T3-L1）接种到细胞培养瓶内，待细胞细胞贴壁生长至细胞密度为80%时，用胰酶消化下来，离心和重悬，进行传代；

步骤二、将消化下来的细胞悬液，再稀释成相应的细胞浓度，在不同孔径大小的细胞板中进行铺板，在37℃，5% CO₂的细胞培养箱中孵育24h至细胞完全贴壁；

步骤三、向不同的孔中加入不同浓度的油酸（Oleic acid ，OA）进行诱导，在37℃，5%CO₂的细胞培养箱中孵育24h，完成诱导；

步骤四、将诱导成功的脂肪细胞，进行油红O染色，在显微镜下观察。

上述方法中，步骤一中，3T3-L1细胞接种的细胞培养瓶为T25。

上述方法中，步骤一中，所述消化的步骤为：将T25细胞培养瓶中的上清液吸出，加入1-2ml PBS，轻轻摇晃，再将PBS吸出，加入1-2ml 0.25% Trypsin-EDTA ，消化2-5 min，待细胞变圆不再贴壁，加入2-4ml含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基终止消化。

上述方法中，步骤一中，所述离心和重悬的步骤为：将消化后的细胞从细胞培养瓶中吸出，收集到15ml 离心管中，在1000-1500 r/min下离心五分钟，然后去除上清液，加入3-5ml含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基进行重悬。

上述方法中，步骤一中，所述传代为：将重悬的细胞吸取1-2ml加入T25细胞培养瓶中，继续培养。

上述方法中，步骤二铺板的具体操作如下：将细胞悬液轻轻吹打，使其均匀分散，吸出10ul加入细胞计数板中，计算出总的细胞密度，将细胞密度稀释至1×10⁵-2×10⁵个/ml，12孔板中，每孔加入1ml；6孔板中，每孔加入2ml，将板轻轻晃动，使细胞均匀平铺，在37℃，5% CO₂的细胞培养箱中孵育24h至细胞完全贴壁。

上述方法中，步骤三中添加的油酸浓度分别为：20-1000μM，用含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基进行配制，将细胞板中上清液去除，加入配制好的不同浓度的油酸，12孔板中，每孔加入1ml；6孔板中，每孔加入2ml。

上述方法中，步骤四中油红O染色的方法为：步骤一、去除上清液，用PBS洗1-2遍，加入4%多聚甲醛固定15-30min；

步骤二、去除固定液，用PBS洗1-2遍，加入油红O染色30-60min；其中油红O染料是由油红O：去离子水=3：2配制而成；

步骤三、去除油红O染料，加60%异丙醇洗1-2次；

步骤四、去除异丙醇，用PBS洗1-2遍，最后用PBS浸润，在显微镜下观察。

本发明体外诱导脂肪细胞的方法，操作简单。而且诱导出的脂肪细胞形态均一，大小可控，为体外构建脂肪细胞模型提供了一个简单高效的方法。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

1、传统的“鸡尾酒”诱导法来体外诱导成熟的脂肪细胞，诱导周期较长，需要8-10天；而油酸法诱导成熟脂肪细胞，只需要1-2天，大大缩短了周期。

2、传统的“鸡尾酒”诱导法，由于操作复杂，对操作者的技术手法要求较高，不然很容易造成细胞的死亡，导致失败；而油酸法诱导成熟脂肪细胞，操作简单，对技术要求不好，细胞不会那么容易死亡。说明这个方法简单易行，可操作性强。

3、传统的“鸡尾酒”诱导法在体外诱导的转化率低，且诱导分化程度不均一，这样很难为实验提供可控的细胞模型；而油酸法诱导的成熟脂肪细胞，转化率高，而且可以通过调节油酸的浓度来诱导出不同分化程度的细胞模型，而且分化程度均一。

附图说明

图1a~图1e为油酸法诱导成熟脂肪细胞油红o染色图；

图2为传统“鸡尾酒”法诱导成熟脂肪细胞油红o染色图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步地具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。

实施例1

体外诱导脂肪细胞模型

1、将第2代小鼠胚胎成纤维细胞（3T3-L1）接种到细胞培养瓶内，待细胞细胞贴壁生长至细胞密度为80%时，用胰酶消化下来，进行传代。将T25细胞培养瓶中的上清液吸出，加入1ml PBS，轻轻摇晃，再将PBS吸出，加入1ml 0.25% Trypsin-EDTA ，消化2 min，待细胞变圆不再贴壁，加入2ml含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基终止消化。

2、将消化后的细胞从细胞培养瓶中吸出，收集到15ml 离心管中，在1000 r/min下离心5分钟，然后去除上清液，加入3ml含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基进行重悬。

3、重悬的细胞吸取1ml加入T25细胞培养瓶中，继续培养；剩余的细胞悬液将稀释成所需浓度，具体操作如下：将细胞悬液轻轻吹打，使其均匀分散，吸出10ul加入细胞计数板中，计算出总的细胞密度。将细胞密度稀释至1×10⁵个/ml，12孔板中，每孔加入1ml；6孔板中，每孔加入2ml，将板轻轻晃动，使细胞均匀平铺。在37℃，5% CO₂的细胞培养箱中孵育24h至细胞完全贴壁。

4、将细胞板中上清液去除，加入配制好的不同浓度的油酸，12孔板中，每孔加入1ml；6孔板中，每孔加入2ml。向不同的孔中加入不同浓度的油酸进行诱导，添加的油酸浓度分别为：40μM、80μM、160μM、320μM，用含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基进行配制。在37℃，5% CO₂的细胞培养箱中孵育24h，完成诱导。

5、将诱导成功的脂肪细胞，进行油红O染色，在显微镜下观察。油红O染色方法为：

步骤一、去除上清液，用PBS洗一遍，加入4%多聚甲醛固定15min；

步骤二、去除固定液，用PBS洗一遍，加入油红O染色30min；其中油红O染料是由油红O：去离子水=3：2配制而成；

步骤三、去除油红O染料，加60%异丙醇洗1次。

如图1a~图1e所示，为加入不同浓度油酸诱导后的油红O染色图，其中图1a为Control组，油酸浓度为0μM，图1b~图1e浓度分别为40μM、80μM、160μM、320μM。由图可知，脂肪细胞体外的分化程度与油酸浓度呈正相关，油酸浓度越大其分化程度越大，而且细胞分化均一稳定，适合用作实验模型，而且实验过程中可以根据自己的实验需求，选择合适的油酸浓度进行诱导。

如图2a和图2b所示，为“鸡尾酒”法诱导前后的油红O染色图（其中图2a为诱导前的染色图，图2b为诱导后的染色图）。由图可知，脂肪细胞分化程度低，只有少部分细胞才分化，而且分化不均一，这不适合用作实验模型。

实施例2

体外诱导脂肪细胞模型

1、将第2代小鼠胚胎成纤维细胞（3T3-L1）接种到细胞培养瓶内，待细胞细胞贴壁生长至细胞密度为80%时，用胰酶消化下来，进行传代。将T25细胞培养瓶中的上清液吸出，加入1ml PBS，轻轻摇晃，再将PBS吸出，加入1ml 0.25% Trypsin-EDTA ，消化2min，待细胞变圆不再贴壁，加入2ml含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基终止消化。

2、将消化后的细胞从细胞培养瓶中吸出，收集到15ml 离心管中，在1000 r/min下离心5分钟，然后去除上清液，加入3ml含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基进行重悬。

3、重悬的细胞吸取1ml加入T25细胞培养瓶中，继续培养；剩余的细胞悬液将稀释成所需浓度，具体操作如下：将细胞悬液轻轻吹打，使其均匀分散，吸出10ul加入细胞计数板中，计算出总的细胞密度。将细胞密度稀释至1×10⁵个/ml，12孔板中，每孔加入1ml；6孔板中，每孔加入2ml，将板轻轻晃动，使细胞均匀平铺。在37℃，5% CO₂的细胞培养箱中孵育24h至细胞完全贴壁。

4、将细胞板中上清液去除，加入配制好的不同浓度的油酸，12孔板中，每孔加入1ml；6孔板中，每孔加入2ml。向不同的孔中加入不同浓度的油酸进行诱导，添加的油酸浓度分别为：31.25μM、62.5μM、125μM、250μM、500μM，用含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基进行配制。在37℃，5% CO₂的细胞培养箱中孵育24h，完成诱导。

5、将诱导成功的脂肪细胞，进行油红O染色，在显微镜下观察。油红O染色方法为：

步骤一、去除上清液，用PBS洗一遍，加入4%多聚甲醛固定15min；

步骤二、去除固定液，用PBS洗一遍，加入油红O染色30min；其中油红O染料是由油红O：去离子水=3：2配制而成；

步骤三、去除油红O染料，加60%异丙醇洗1次。

本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、将第2-10代小鼠胚胎成纤维细胞（3T3-L1）接种到细胞培养瓶内，待细胞细胞贴壁生长至细胞密度为80%时，用胰酶消化下来，离心和重悬，进行传代；

步骤二、将消化下来的细胞悬液，再稀释成相应的细胞浓度，在不同孔径大小的细胞板中进行铺板，在37℃，5% CO₂的细胞培养箱中孵育24h至细胞完全贴壁；

步骤三、向不同的孔中加入不同浓度的油酸（Oleic acid ，OA）进行诱导，在37℃，5%CO₂的细胞培养箱中孵育24h，完成诱导；

步骤四、将诱导成功的脂肪细胞，进行油红O染色，在显微镜下观察。

2.如权利要求1所述用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，步骤一中，3T3-L1细胞接种的细胞培养瓶为T25。

3.如权利要求1所述用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，步骤一中，所述消化的步骤为：将T25细胞培养瓶中的上清液吸出，加入1-2mlPBS，轻轻摇晃，再将PBS吸出，加入1-2ml 0.25% Trypsin-EDTA ，消化2-5 min，待细胞变圆不再贴壁，加入2-4ml含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基终止消化。

4.如权利要求1所述用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，步骤一中，所述离心和重悬的步骤为：将消化后的细胞从细胞培养瓶中吸出，收集到15ml 离心管中，在1000-1500 r/min下离心五分钟，然后去除上清液，加入3-5ml含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基进行重悬。

5.如权利要求1所述用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，步骤一中，所述传代为：将重悬的细胞吸取1-2ml加入T25细胞培养瓶中，继续培养。

6.如权利要求1所述用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，步骤二铺板的具体操作如下：将细胞悬液轻轻吹打，使其均匀分散，吸出10ul加入细胞计数板中，计算出总的细胞密度，将细胞密度稀释至1×10⁵-2×10⁵个/ml，12孔板中，每孔加入1ml；6孔板中，每孔加入2ml，将板轻轻晃动，使细胞均匀平铺，在37℃，5% CO₂的细胞培养箱中孵育24h至细胞完全贴壁。

7.如权利要求1所述用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，步骤三中添加的油酸浓度分别为：20-1000μM，用含有10%FBS、1%青链霉素的DMEM培养基进行配制，将细胞板中上清液去除，加入配制好的不同浓度的油酸，12孔板中，每孔加入1ml；6孔板中，每孔加入2ml。

8.如权利要求1所述用油酸体外诱导小鼠胚胎成纤维细胞分化为脂肪细胞的方法，其特征在于，步骤四中油红O染色的方法为：步骤一、去除上清液，用PBS洗1-2遍，加入4%多聚甲醛固定15-30min；

步骤二、去除固定液，用PBS洗1-2遍，加入油红O染色30-60min；其中油红O染料是由油红O：去离子水=3：2配制而成；

步骤三、去除油红O染料，加60%异丙醇洗1-2次；

步骤四、去除异丙醇，用PBS洗1-2遍，最后用PBS浸润，在显微镜下观察。