CN105816872A - 水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗制备方法及用其制备的疫苗 - Google Patents

水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗制备方法及用其制备的疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及兽用生物制品领域，具体而言，涉及一种水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，包括：将制苗用敏感细胞接种于生物反应器中并用微载体进行培养；待所述敏感细胞培养至80％以上长成致密单层后向所述生物反应器中接种水貂细小病毒进行增殖培养；收获病毒培养液及微载体，冻融后去除微载体及细胞碎片得到病毒液，将所述病毒液灭活并配制后得到疫苗。通过完善各步骤的反应条件，优化生产流程，本发明达到了生产周期短、病毒滴度高、产品质量稳定、生产效率提高、副反应小的技术效果。

Description

水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗制备方法及用其制备的疫苗
技术领域
本发明涉及兽用生物制品领域，具体而言，涉及水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗制备方法及用其制备的疫苗。
背景技术
水貂细小病毒性肠炎是毛皮动物常见的一种急性、烈性和高度接触性传染病，以剧烈腹泻、呕吐出血为主要特征，不同年龄和品种的水貂对病毒均易感，幼貂发病率为70％以上，死亡率高达90％；成年貂发病率30％左右，死亡率约为30％，每年都给我国水貂养殖业造成巨大经济损失。
由于缺乏行之有效的治疗方法，疫苗免疫接种是目前预防和控制水貂细小病毒性肠炎的最主要手段。现有的水貂细小病毒性肠炎疫苗都是通过传统转瓶培养工艺生产。传统转瓶工艺存在诸多缺点如：自动化程度低、劳动强度大；培养细胞的环境不可控，容易被环境污染；耗时长、效率低、生产成本高，难以扩大生产；不同批次间质量差异大；涉及生物安全和公共卫生问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种悬浮培养敏感细胞生产水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的方法，所述的方法与传统细小病毒性肠炎灭活疫苗生产工艺相比，生产周期短、病毒滴度高，使用该方法生产的产品质量稳定、生产效率提高、副反应小。
一种水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1)、将制苗用敏感细胞接种于生物反应器中并用微载体进行培养；
2)、待所述敏感细胞培养至80％以上长成致密单层后向所述生物反应器中接种水貂细小病毒进行增殖培养；
3)、收获病毒培养液及微载体，冻融后去除微载体及细胞碎片得到病毒液，将所述病毒液灭活并配制后得到疫苗。
细胞微载体悬浮培养更容易更换培养液，且提供了更大的供细胞贴壁生长的表面积，因而使得细胞达到更高的培养密度；本申请所用的生物反应器具体为搅拌反应器(微载体培养用)，配合微载体悬浮培养技术，可达到占地空间少、细胞产量高(进而病毒滴度高)、生产成本低的技术效果。在本领域中，应用悬浮培养法生产水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗尚属首次，本发明通过完善各步骤的反应条件，优化生产流程，达到了生产周期短、产品质量稳定、生产效率提高、副反应小的技术效果。
优选的，如上所述的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法：
所述制苗用敏感细胞为F81或CRFK细胞；
所述水貂细小病毒的毒株为MEVB株。
优选的，如上所述的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法：
所接种的制苗用敏感细胞的细胞密度为25～40个细胞/球；
用于培养的微载体为Cytodex微载体，其使用密度为3～10g/L。
微载体培养(microcarrierculture)是一种用于高产量培养贴壁细胞的实用技术。Cytodex专用于培养各类动物细胞，其培养体积可以从数毫升到6000升以上。应用Cytodex微载体技术，可以实现简单的贴壁细胞悬浮化培养，每毫升培养液可得到数百万细胞。微载体适于摇瓶、转瓶、搅拌罐以及WAVE生物反应器等各种培养系统。本发明所用微载体具体可为Cytodex-1、2、3，优选为Cytodex-1，购自GE(通用电气)公司。
25～40个细胞/球的含义为，每个Cytodex微载体上含量25～40个细胞。
进一步优选的，如上所述的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，在步骤1)中：
在培养所述制苗用敏感细胞时所用的细胞培养液为：含4％～10％的小牛血清的DMEM培养液；所述DMEM培养液的质量分数为98％以上；
用微载体培养时的培养条件为：温度36～38℃、CO2含量4.8～5.2％、搅拌速度为40～70rpm、溶氧为50～60％、pH7.0～7.4、反应器自动控制培养。
优选的，如上所述的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，在步骤1)中，在生物反应器中培养所述敏感细胞时包括单级培养或放大培养；
所述单级培养为5～14L生物反应器单级培养模式；
所述放大培养为40～140L放大培养模式；放大培养的操作为：
将单级培养后的微载体上生长的细胞作为初始细胞在密闭容器中用胰酶消化，通过90～120μm的滤网过滤，将细胞悬液接入下一级更大的生物反应器中继续培养，将培育得到细胞作为下一次放大培养操作的初始细胞并重复上述放大培养的操作，逐次放大到40～140L的生产规模。
本发明消化放大模式采用了自制的消化装置(即所述密闭容器)消化细胞，避免了大规模生产时消化细胞工艺的繁琐操作，且细胞不易受到污染。使用90～120μm的不锈钢网过滤将消化细胞与原培养载体分离，避免了在培养过程中细胞在新旧球贴附不均的现象。
所述自制的消化装置可以放入水浴中加热，容器主体部顶端含有三通孔，其中一端连有装有37℃预热的浓度为0.25％胰酶-0.02％EDTA的胰酶消化液，另一端连接排液瓶。
进一步优选的，如上所述的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，步骤2)中的操作具体包括：
待所述敏感细胞培养至100～130个细胞/球时，停止搅拌，待微载体沉淀到罐底后排出所有细胞培养液；接种水貂细小病毒并在病毒生长液中进行增殖培养，接种量按MOI为0.001～0.1进行。MOI即病毒感染复数(MultiplicityofInfection)的英文缩写，直观地讲就是总病毒数与总细胞数的比值，通过取样计数接种病毒前细胞浓度来确定病毒的接种量。
100～130个细胞/球的含义是每个Cytodex微载体上含有100～130个细胞。
进一步优选的，如上所述的悬浮培养敏感细胞生产水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的方法：
所述病毒生长液的配方为：含1％～2％的小牛血清的DMEM培养液；所述DMEM培养液的质量分数为98％以上；
所述增殖培养的条件为：温度36～38℃、CO2含量4.8～5.2％、搅拌速度为40～70rpm、溶氧为50～60％、pH7.0～7.4、反应器自动控制培养。
优选的，如上所述的悬浮培养敏感细胞生产水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的方法：
在步骤1)中，所述制苗用敏感细胞接种于生物反应器中并用微载体进行培养的培养方式为批培养或连续灌注培养；
在步骤2)中，所述增殖培养的培养方式为批培养。
分批式培养是指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，同时产物也不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养。
在灌注培养中，细胞保留在反应器系统中，收获培养液的同时不断地加入新鲜的培养基。灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分，并可带走代谢产物；同时，细胞保留在反应器系统中，可以达到很高的细胞密度。同其他方法相比，灌注培养的产率可以提高一个数量级，并可大大降低劳动力消耗。
优选的，如上所述的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，在步骤3)中，所述收获病毒培养液及微载体的时机为：
80％以上的敏感细胞出现典型的致细胞病变效应。
在具体操作时，DO(溶解氧含量)值明显上升也是收获病毒培养液及微载体的一个指示信号，可与致细胞病变效应(CPE)结合起来达到更准确的估计。CPE是指病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。
用如上所述的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法制备的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、利用生物反应器微载体细胞培养技术替代传统转瓶细胞培养技术生产水貂细小病毒性肠炎疫苗，可以解决目前生产效率低，产品质量不稳定、病毒效价低等问题；通过生产技术和生产工艺的优化，细小病毒单位培养效价可进一步提高，全面提升疫苗质量和产量，提高疫苗的安全性。
2)、本发明通过完善各步骤的反应条件，优化生产流程，可达到缩短生产周期、提供病毒滴度、生产效率提高、副反应小的技术效果。
3)、应用生物反应器生产疫苗，具有自动化程度高、生产工艺简单稳定，易操作，产量大占地小，易于快速扩大生产规模；批次间质量均衡稳定。
4)、本发明消化放大模式采用了自制的消化装置用以消化细胞，避免了大规模生产时消化细胞工艺的繁琐操作，且细胞不易受到污染。使用100μm的不锈钢网过滤将消化细胞与原培养载体分离，避免了在培养过程中细胞在新旧球贴附不均的现象。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明的工艺流程图；
图2为实施例3步骤302中F81细胞接种后24h的微载体细胞图片；
图3为实施例3步骤302中F81细胞接种后48微载体细胞图片；
图4为实施例3步骤302中F81细胞接种后72微载体细胞图片；
图5为实施例3步骤302中F81细胞增殖曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
在本发明的实施例1中提供了一种水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤101：将制苗用敏感细胞CRFK按照25个细胞/球的密度接种于5L的生物反应器中并用微载体进行培养；用于培养的微载体为Cytodex微载体，其使用密度为3g/L；在培养所述制苗用敏感细胞时所用的细胞培养液为：含4％的小牛血清的DMEM培养液；所述DMEM培养液的质量分数为98％以上；用微载体培养时的培养条件为：温度36℃、CO2含量4.8％、搅拌速度为40rpm、溶氧为50％、pH7.0、反应器自动控制培养；
步骤102：待所述敏感细胞培养至100个细胞/球后向所述生物反应器中按照MOI为0.001接种水貂细小病毒MEVB株进行增殖培养；增殖培养所用的病毒生长液的配方为：含1％的小牛血清的DMEM培养液；所述DMEM培养液的质量分数为98％以上；增殖培养的条件为：温度36℃、CO2含量4.8％、搅拌速度为40rpm、溶氧为50％、pH7.0、反应器自动控制培养；
步骤103：待增殖培养的细胞中，80％以上的敏感细胞出现典型的致细胞病变效应时收获病毒培养液及微载体，冻融后去除微载体及细胞碎片得到病毒液，利用其进行疫苗灭活及配制。
实施例2
在本发明的实施例2中提供了一种水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤201：将制苗用敏感细胞F81按照40个细胞/球的密度接种于14L的生物反应器中并用微载体进行培养；用于培养的微载体为Cytodex微载体，其使用密度为10g/L；在培养所述制苗用敏感细胞时所用的细胞培养液为：含10％的小牛血清的DMEM培养液；所述DMEM培养液的质量分数为98％以上；用微载体培养时的培养条件为：温度38℃、CO2含量5.2％、搅拌速度为70rpm、溶氧为60％、pH7.4、反应器自动控制培养；培养细胞的方式为分批培养；
步骤202：微载体的放大培养
停止生物反应器的搅拌，使微载体自然沉降，排出上清培养液，用pH7.2的PBS缓冲液洗涤2遍，将长满细胞的微载体收集到一种的自制的密闭容器(消化装置)中。自制的消化装置可以放入水浴中加热，容器主体部顶端含有三通孔，其中一端连有装有37℃预热的浓度为0.25％胰酶-0.02％EDTA的胰酶消化液，另一端连接排液瓶。
打入胰酶消化液后，待微载体自然沉降，排出含有PBS清洗液及胰酶消化液的上清液，消化5～10min后加入细胞生长液终止消化，将细胞与微载体的混合液打入14L生物反应器中，开启搅拌。无菌连接14L生物反应器管路与40L生物反应器管路，将细胞悬液通过90～120μm的不锈钢网过滤，将细胞悬液打入40L生物反应器，并按5g/ml的微载体量加入新载体，参数设定培养工艺条件同5L生物反应器，每天取样计细胞数和测定葡萄糖含量，观察细胞生长情况，判断是否需要换液，培养3～4天。
步骤203：待步骤202中所述敏感细胞培养至130个细胞/球后向所述生物反应器中按照MOI为0.1接种量接种水貂细小病毒MEVB株进行增殖培养；增殖培养所用的病毒生长液的配方为：含2％的小牛血清的DMEM培养液；所述DMEM培养液的质量分数为98％以上；增殖培养的条件为：温度38℃、CO2含量5.2％、搅拌速度为70rpm、溶氧为60％、pH7.4、反应器自动控制培养；增殖培养的方式为分批培养或连续灌注培养；
步骤204：待增殖培养的细胞中，80％以上的敏感细胞出现典型的致细胞病变效应时收获病毒培养液及微载体，冻融后去除微载体及细胞碎片得到病毒液，利用其进行疫苗的灭活及配制。
实施例3
为了能更详细地描述本申请的技术方案，本发明还在实施例1和2的基础上，通过对各操作的进一步细化与限定得到实施例3。实施例3包括以下步骤，请参考图1：
所用设备及试剂：
生物反应器：齐志生物工程设备有限公司7L生物反应器；
微载体：GE公司Cytodex-1；
制苗用水貂细小病毒：MEVB株；
敏感细胞：F81细胞；
DMEM培养基(干粉)：GIBCO公司；
小牛血清：内蒙古金源康生物工程有限公司；
胰蛋白酶(干粉)：GIBCO公司。
步骤:301：生物反应器、微载体准备
根据培养体积选择合适的生物反应器，连接好各种管道、补料和辅助罐、换液的接口，接上T(温度)、pH、DO(溶氧)电极，并进行电极校正；
按照6g/L的密度称取Cytodex-1微载体，于玻璃瓶(已硅化处理)中，加入50倍微载体质量的PBS缓冲液浸泡30min，更换新鲜的PBS缓冲液继续浸泡2h；更换10倍体积的PBS缓冲液于待灭菌的生物反应器中准备灭菌；
灭菌前认真检查各管道和接头确保连接完好后进行气密性测试，测试合格后方可准备进行灭菌；根据生物反应器的规模，20L以下采用离线灭菌，在高压锅中121℃高压30～50min，灭菌结束后取出自然冷却；20L以上的生物反应器采用在位灭菌的方式。
步骤302：敏感细胞的制备
从液氮中取出所需种子细胞(F81细胞)，水浴(37±1℃)快速解冻至T225细胞培养瓶，37℃，5％CO2培养箱培养72h(图2～4分别为培养24h、48h、72h的镜下观察图，图5为F81细胞悬浮培养增殖曲线)，按照1:3～1:4比例进行细胞扩大传代培养；形成良好细胞单层时，用于继续传代、接种病毒或生物反应器微载体悬浮培养。
步骤303：水貂细小病毒的制备
用病毒生长液稀释水貂细小病毒基础毒种(MEVB)，按照6％的比例接种步骤302中生长良好的单层敏感细胞中，继续培养，培养温度为37℃。至细胞80％以上病变时收获病毒液，测定病毒的TCID50稳定且达到7.0～7.5或血凝价(HA≥10)时，停止复壮，将该病毒作为生产用毒种。
步骤304：生物反应器微载体培养
取步骤302中生长良好的敏感细胞，经EDTA-胰酶消化制备敏感细胞细胞悬液，调整细胞混悬液至30个细胞/球的细胞密度后接种生物反应器；细胞培养液为：含7％的小牛血清的DMEM培养液；所述DMEM培养液的质量分数为98％以上；设定生物反应器参数：温度37℃、CO2含量5％、搅拌速度为55rpm、溶氧为55％、pH7.2、反应器自动控制培养；细胞培养的24h、48h、72h取样计细胞数并测定葡萄糖含量，低于500mg/L或殆尽后及时更换细胞生长液。培养时采用分批培养的培养方式。
步骤305：生物反应器病毒液的增殖培养
当步骤304中微载体上培养的80％以上敏感细胞长成致密单层、细胞状态良好、空球率低于5％，且细胞计数结果达到115个细胞/球时以上时进行接毒操作。按照MOI为0.001接入步骤303制备的水貂细小病毒生产毒种，培养基为含1.5％的小牛血清的DMEM培养液；所述DMEM培养液的质量分数为98％以上；培养条件为温度37℃、CO2含量5.0％、搅拌速度为55rpm、溶氧为55％、pH7.2、反应器自动控制培养。培养时采用分批培养或连续灌注培养的培养方式均可。
步骤306：收获病毒培养液及微载体
接毒每隔4h取反应器中微载体观察细胞病变，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品的TCID50；待微载体上80％以上的敏感细胞出现典型的致细胞病变效应(脱离微载体)，且DO值明显呈明显上升趋势，结束培养。连续高速搅拌10～15min，收获病毒培养液及微载体，置-20℃反复冻融2～3次，经离心或过滤去除微载体及细胞碎片，收获病毒液，标明名称、收获日期、批号、-20℃保存，用于病毒含量测定。
步骤307：病毒液灭活
向病毒液中加入2％的BEI溶液，使其终浓度为0.2％，37℃灭活48h，期间每隔4～8h混匀1次。灭活完全，像病毒液中添加50％硫代硫酸钠，使其终浓度为0.4％，加入后搅拌1h。
步骤308：各步骤质检标准
1)、收获病毒液毒价的测定：根据国家标准病毒含量应≥105.5TCID50/mL。
2)、半成品检验：
①无菌检验：按照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录301页进行，无菌生长。
②灭活检验：将灭活病毒液与MEM按照1：5比例混合后接种已长成80％单层F81细胞4瓶，每瓶接种1mL，置于37℃下吸附30min后，换维持液继续观察培养4d，应无细胞病变；再盲传1代，应无细胞病变。取培养液做血凝试验，应为阴性。
3)、成品检验：疫苗制造和成品检验按照《水貂病毒性肠炎灭活疫苗制造及检验规程》要求进行，符合要求。
实验例
将实施例3与传统转瓶法进行比较，比较结果如表1所示：
表1实施例3与传统转瓶法生产水貂细小病毒性肠炎疫苗比较
综上所述，为了克服现有水貂细小病毒性肠炎疫苗的生产技术所存在的缺陷，实现简单、快捷、高效的生产水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗，本发明提供了一种利用微载体悬浮培养敏感细胞生产水貂细小病毒性肠炎疫苗的方法。该方法：
1)、可以为细胞生产提供更大的表面积、帮助提高细胞单位体积内的细胞密度；
2)、可以实现整个培养过程全自动控制培养环境参数、使得细胞生长和病毒繁殖处于较优越的环境中，保证细胞和病毒良好状态，提高病毒滴度，提高疫苗质量、减少疫苗批间差异；
3)、可以显著降低生产成本、缩短生产周期，占地面积小，易于快速扩大生产规模，自动化程度高，可显著提升水貂细小病毒性肠炎病毒的单位效价和疫苗产量和质量。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)、将制苗用敏感细胞接种于生物反应器中并用微载体进行培养；
2)、待所述敏感细胞培养至80％以上长成致密单层后向所述生物反应器中接种水貂细小病毒进行增殖培养；
3)、收获病毒培养液及微载体，冻融后去除微载体及细胞碎片得到病毒液，将所述病毒液灭活并配制后得到疫苗。
2.根据权利要求1所述的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于：
所述制苗用敏感细胞为F81或CRFK细胞；
所述水貂细小病毒的毒株为MEVB株。
3.根据权利要求2所述的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤1)中：
所接种的制苗用敏感细胞的细胞密度为25～40个细胞/球；
用于培养的微载体为Cytodex微载体，其使用密度为3～10g/L。
4.根据权利要求3所述的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，
在培养所述制苗用敏感细胞时所用的细胞培养液为：含4％～10％的小牛血清的DMEM培养液；所述DMEM培养液的质量分数为98％以上；
用微载体培养时的培养条件为：温度36～38℃、CO2含量4.8～5.2％、搅拌速度为40～70rpm、溶氧为50～60％、pH7.0～7.4、反应器自动控制培养。
5.根据权利要求3所述的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，在生物反应器中培养所述敏感细胞时包括单级培养或放大培养；
所述单级培养为5～14L生物反应器单级培养模式；
所述放大培养为40～140L放大培养模式；放大培养的操作为：
将单级培养后的微载体上生长的细胞作为初始细胞在密闭容器中用胰酶消化，通过90～120μm的滤网过滤，将细胞悬液接入下一级更大的生物反应器中继续培养，将培育得到细胞作为下一次放大培养操作的初始细胞并重复上述放大培养的操作，逐次放大到40～140L的生产规模。
6.根据权利要求5所述的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤2)中的操作具体包括：
待所述敏感细胞培养至100～130个细胞/球时，停止搅拌，待微载体沉淀到罐底后排出所有细胞培养液；接种水貂细小病毒并在病毒生长液中进行增殖培养，接种量按MOI为0.001～0.1进行。
7.根据权利要求6所述的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于：
所述病毒生长液的配方为：含1％～2％的小牛血清的DMEM培养液；所述DMEM培养液的质量分数为98％以上；
所述增殖培养的条件为：温度36～38℃、CO2含量4.8～5.2％、搅拌速度为40～70rpm、溶氧为50～60％、pH7.0～7.4、反应器自动控制培养。
8.根据权利要求1所述的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于：
在步骤1)中，所述制苗用敏感细胞接种于生物反应器中并用微载体进行培养的培养方式为批培养或连续灌注培养；
在步骤2)中，所述增殖培养的培养方式为批培养。
9.根据权利要求1所述的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，所述收获病毒培养液及微载体的时机为：80％以上的敏感细胞出现典型的致细胞病变效应。
10.用权利要求1～9任一项所述的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗的制备方法制备的水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗。
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