CN102038946A

CN102038946A - 应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法

Info

Publication number: CN102038946A
Application number: CN 201010282142
Authority: CN
Inventors: 秦红刚; 刘汉平; 李伟; 肖敏; 王桢桢; 漆世华; 温文生
Original assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Current assignee: WUHAN CHOPPER BIOLOGY CO Ltd
Priority date: 2010-09-15
Filing date: 2010-09-15
Publication date: 2011-05-04

Abstract

本发明涉及一种应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，包括如下步骤：(1)将微载体和生物反应器经灭菌后，接种制苗用细胞，进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种伪狂犬病毒，并继续培养，使病毒繁殖；(2)待细胞病变达到80％以上时，停止培养，收获病毒液制得伪狂犬病疫苗。本发明采用生物反应器微载体培养技术进行细胞的高密度培养，生产伪狂犬病疫苗，与传统的转瓶生产工艺相比，自动化控制程度高，生产可实时监控；节省人力，降低成本；生产用地少，规模易于扩大；生产的病毒滴度高，批间差异小，产品质量稳定，副反应小。

Description

应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法。

背景技术

猪伪狂犬病(Pseudorabies，Pr)，是由疱疹病毒科猪疱疹病毒I型伪狂犬病毒引起的传染病。我国将其列为二类动物疫病。伪狂犬病已呈世界流行，在我国也广泛存在，许多规模化养猪场均使用伪狂犬病疫苗来预防和控制该病。

目前伪狂犬病疫苗的生产主要是采用传统的转瓶工艺，即伪狂犬病毒接种已形成单层的细胞，培养后一次性收获病毒液。但是每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶细胞的质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批间差异大，而且操作劳动强度大，生产效率低，隐性污染引起的高内毒素等缺点，已经越来越不适应当前疫苗大规模生产的要求。

专利公开号为CN101695573A的专利申请，公开了一种应用利用传代细胞源生产伪狂犬病活疫苗的方法，其传代细胞为ST细胞、PK-15和IBRS-2细胞，生产工艺为转瓶工艺；专利公开号为CN101695572 A的专利申请，公开了一种应用生物反应器生产伪狂犬活疫苗的方法，其生物反应器为TideCell固定床微载体生物反应器。但是利用搅拌式生物反应器，采用逐级放大的倒罐式操作技术，进行细胞的高密度培养以制备疫苗，未见报道。

发明内容

本发明的目的为了克服伪狂犬病疫苗现有生产工艺的缺陷，提供了一种应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其优点是设备占地面积小、生产规模大；培养速度快、生产效率高；生产机械化，易于自动控制；培养设备密闭，不易污染；副产物少，疫苗的副反应小；生产的病毒液效价高，与传统的转瓶工艺相比，收获的病毒液滴度提高了0.5～1.5个logTCID₅₀/ml，疫苗质量稳定。

本发明的技术方案为：

一种应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)用微载体培养制苗用细胞：将微载体和生物反应器经灭菌后，接种制苗用细胞，进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种伪狂犬病毒，并继续培养，使病毒繁殖，所述的制苗用细胞为对伪狂犬病病毒毒株敏感的细胞，且为猪睾丸细胞系(ST)、猪肾细胞系(PK-15)细胞或乳仓鼠肾细胞(BHK-21)；(2)每天按时取样观察细胞病变情况，待细胞病变达到80％以上时，停止培养，收获病毒液制得伪狂犬病活疫苗；或将收获的病毒液灭活后制成灭活疫苗。

病毒的接种量为0.001～1MOI。

所述的生物反应器设定参数为：pH 6.5～7.8、温度33～37℃、溶氧30～80％、搅拌速度30～100rpm。考虑到细胞培养的最适条件，优选的pH 7.0～7.4、细胞培养阶段温度设定37℃，病毒培养阶段温度设定35℃、溶氧50％、搅拌速度30～100rpm。

所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2～25g/L。

所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。

所述的生物反应器容积为14～150L。制苗用细胞可采用14L～40L或14L～40L～150L逐级放大的培养模式，即通过胰酶将14L生物反应器培养的细胞消化下来，作为种子细胞接种到40L的生物反应器，再将40L的反应器内培养的细胞消化下来作为种子细胞接种到150L生物反应器，如此形成生物反应器之间的逐级放大培养过程，从而避免了单纯的用转瓶培养种子细胞而容易造成污染和增加劳动强度的缺陷；或，直接用14L、40L或150L生物反应器培养病毒。

所述的生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细胞的密度以每天0.5～4个工作体积。

伪狂犬病毒可以是制苗用的强毒株，用来制备灭活苗；也可以是制苗用弱毒株，制备弱毒活疫苗。

本发明采用生物反应器微载体培养技术进行细胞的高密度培养，生产伪狂犬病疫苗，与传统的转瓶生产工艺相比，自动化控制程度高，生产可实时监控；节省人力，降低成本；生产用地少，规模易于扩大；生产的病毒滴度高，批间差异小，产品质量稳定，副反应小。

附图说明

图1a为细胞接种后3h的微载体细胞图片。

图1b为细胞接种后5d的微载体细胞图片。

图1c为细胞接毒后病变的微载体细胞图片。

图2为细胞生长曲线。

具体实施方式

以下是本发明一个具体的实施方案，以进一步的阐述本发明，但不能解释为限制本发明的范围。

实施例一：生物反应器：美国NBS公司14L和40L生物反应器，生物反应器设定参数为：pH 7.2、温度37℃、溶氧50％、搅拌速度30～100rpm；

微载体：通用电气医疗集团生命科学部Cytodex1；

伪狂犬病毒：Bartha-K61株；

细胞生长液：含体积浓度为8％小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技术有限公司)；

病毒维持液：含体积浓度为1％小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技术有限公司)；

细胞培养：分别在14L生物反应器内，按照10g/L的浓度加入Cytodex-1，水化后，用pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS淘洗几遍，灭菌，接种ST细胞，进行培养；每天定时取样观察细胞生长情况，进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，当细胞的密度达到1.5×10⁶/ml时，开始灌注，灌注的速度依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0.5～4个工作体积，以维持细胞的生长，培养4d，细胞的密度达到6×10⁶/ml。

微载体培养的放大：待14L生物反应器细胞的密度达到6×10⁶/ml，将长满细胞的微载体收集到特定密闭容器中，用含质量浓度为0.02％EDTA的pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS缓冲液清洗细胞两次，加入37℃预热的含质量浓度为0.02％EDTA、质量浓度为0.25％胰酶的胰酶消化液，消化10min，排出多余的胰酶溶液，加入细胞生长液，终止残余胰酶的消化，启动容器搅拌使其充分分散消化的细胞，然后将消化分散的细胞悬液接种到40L的生物反应器，按照上述的培养方法进行培养。

病毒繁殖：当40L生物反应器细胞的密度达到7×10⁶/ml，排出细胞生长液并更换成病毒维持液，按照0.05MOI接种伪狂犬病毒；接毒后6h开始灌注培养，以维持病毒繁殖所必需的营养物质，同时收获病毒液，待细胞病变达到80％以上时，停止培养，测定病毒含量为9.4logTCID₅₀/ml，将收获的病毒液置于2～8℃中，或保存在-20℃。

制备疫苗：将上述收获的病毒液按病毒液与冻干保护剂的体积比为1∶2加入质量浓度为5％蔗糖脱脂乳冻干保护剂，制备成冻干活疫苗。

实施例二：生物反应器：美国NBS公司14L和40L生物反应器，生物反应器设定参数为：pH 7.2、温度37℃、溶氧50％、搅拌速度30～100rpm；

微载体：Cytodex1(通用电气医疗集团生命科学部)；

伪狂犬病毒：鄂A强毒株

细胞生长液：含体积浓度为8％小牛血清的DMEM/F12(北京清大天一生物技术有限公司)；

病毒维持液：含体积浓度为1％小牛血清的DMEM/F12(北京清大天一生物技术有限公司)；

细胞培养：分别在14L生物反应器内，按照10g/L的浓度加入Cytodex1，水化后，用pH7.4的磷酸盐缓冲液PBS淘洗几遍，灭菌，接种ST细胞，进行培养；每天定时取样观察细胞生长情况，进行细胞计数，测定葡萄糖的消耗，当细胞的密度达到1.5×10⁶/ml时，开始灌注，灌注的速度依据细胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0.5～4个工作体积，以维持细胞的生长，培养4d，细胞的密度达到6×10⁶/ml。

微载体培养的放大：待14L生物反应器细胞的密度达到6×10⁶/ml，将长满细胞的微载体收集到特定密闭容器中，用含质量浓度0.02％EDTA的pH7.2的磷酸盐缓冲液PBS缓冲液清洗细胞两次，加入37℃预热的含质量浓度0.02％EDTA、质量浓度0.25％胰酶的胰酶消化液，消化8min，排出多余的胰酶溶液，加入细胞生长液，终止残余胰酶的消化，启动容器搅拌使其充分分散消化的细胞，然后将消化分散的细胞悬液接种到40L的生物反应器，按照上述的培养方法进行培养。

病毒繁殖：当40L生物反应器细胞的密度达到7×10⁶/ml，排出细胞生长液并更换成病毒维持液，按照0.05MOI接种伪狂犬病毒；接毒后6h开始灌注培养，以维持病毒繁殖所必需的营养物质，同时收获病毒液，待细胞病变达到80％以上时，结束培养，测定病毒含量为9.0logTCID₅₀/ml，将收获的病毒液置于2～8℃中，或保存在-20℃。

制备疫苗：将上述收获的病毒液灭活后，按抗原和油佐剂1∶1比例加入油佐剂，乳化配制成灭活疫苗。油佐剂的配制为94％(V/V)白油、6％(V/V)的Span-80，2％(g/V)硬脂酸铝。

Claims

1.一种应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)用微载体培养制苗用细胞：将微载体和生物反应器经灭菌后，接种制苗用细胞，进行培养，待微载体上的细胞形成致密的单层，接种伪狂犬病毒，并继续培养，使病毒繁殖，所述的制苗用细胞为对伪狂犬病病毒毒株敏感的细胞，且为猪睾丸细胞系(ST)、猪肾细胞系(PK-15)或乳仓鼠肾细胞系(BHK-21)；(2)待细胞病变达到80％以上时，停止培养，收获病毒液制得伪狂犬病活疫苗；或将收获的病毒液灭活后制成灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于：病毒的接种量为0.001～1MOI。

3.根据权利要求1所述应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器设定参数为：pH 6.5～7.8、温度33～37℃、溶氧30～80％、搅拌速度30～100rpm。

4.根据权利要求1～3之一所述应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于：所述的微载体为Cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2～25g/L。

5.根据权利要求1～4之一所述应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器为搅拌式生物反应器。

6.根据权利要求1～5之一所述的应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器容积为14～150L；或，制苗用细胞经过14L～40L或14L～40L～150L逐级放大培养后，于40L或150L生物反应器培养伪狂犬病毒；或，直接用14L、40L或150L的生物反应器培养病毒。

7.根据权利要求1～6之一所述应用生物反应器工业化生产伪狂犬病疫苗的方法，其特征在于：所述的生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细胞的密度为每天0.5～4个工作体积。