CN108103030B - 一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法，包括以下步骤：1）转瓶细胞消化，2）细胞过滤，3）细胞接毒上罐培养，4）24h换液，5）收获一收抗原，6）再次消化细胞上罐，7）收获二收抗原并换液培养，8）收获三收抗原，9）将一收抗原、二收抗原和三收抗原融化，分别过滤去除微载体，得到抗原液并进行效价检测。本发明方法能够提高细胞贴壁效率，减少细胞团块，提高细胞密度，并且能够提高单批抗原收获量，提高抗原效价，降低生产成本。

Description

一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法。
背景技术
猪圆环病毒2型的培养方法一般为转瓶培养与微载体生物反应器培养。
转瓶培养过程一般为：使用转瓶培养细胞，在转瓶细胞培养一段时间后用酶消化液消化传代放大培养，同时进行同步接毒，猪圆环病毒2型种毒按一定的接毒量接入转瓶中培养，培养一段时间后换液，继续培养至72-96h收获病毒液。
该方法存在以下不足：由于转瓶培养细胞的表面积有限，所以培养细胞时，细胞密度低，接毒后培养的病毒效价也相对低。
微载体生物反应器培养过程一般为：1.消化转瓶细胞上罐：用胰酶消化液消化转瓶细胞，并摇匀消化后的细胞，将消化后的细胞取样进行细胞计数，按规定细胞密度把所需细胞量加入反应器罐中，同时按一定的接毒量接入猪圆环病毒2型种毒，调节生物反应器各项培养参数进行培养。2.换液培养及收获：反应器中的细胞培养一段时间后更换维持液，继续培养到所需时间，然后收获上清液。
该方法存在以下不足：1、细胞从转瓶中消化下来细胞团块较多，细胞在微载体中贴壁不均匀，而且有很多团块贴附在微载体上，在培养的过程中团块细胞容易死亡或提前脱落，造成细胞密度不足，收获的抗原效价不高。2、圆环病毒培养一般为同步接毒，接毒后的细胞培养至48h后细胞开始大量脱落，48h后由于细胞脱落较多，病毒繁殖不足，最终收获的抗原效价不高。3、收获抗原时只收获上清，由于在收获时，载体上还是有部分带毒细胞无法脱落，损失一部分病毒，造成收获的抗原效价不高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法，该方法采用改进微载体生物反应器培养工艺，能够提高抗原效价，提高单批抗原收获量，降低生产成本。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法，包括以下步骤：
1)转瓶细胞消化：选择细胞状态良好的转瓶PK-15细胞，使用胰酶消化液消化细胞，将消化后的细胞充分摇匀；
2)细胞过滤：使用10-20微米的细胞过滤器过滤细胞，得到细胞液，过滤后的细胞呈大部分单个，少部分2-3个的细胞状态，取少量过滤后的细胞液用维持液进行4-6倍稀释，然后取少量稀释后细胞液加至细胞计数板进行细胞计数，计算出过滤后细胞液的细胞密度；
3)细胞接毒上罐培养：将微载体按3-5g/升加入生物反应器中，同时加入7-9倍微载体体积的含血清的营养液，将猪圆环病毒2型毒种按培养体积的1-5％的量加入细胞液中，然后将细胞液加入生物反应器中，所述细胞液的加入量根据细胞液密度按每个微载体30-50个细胞计算，调节生物反应器中的细胞培养参数，其中，温度为
36.5-37.5℃，DO为50-60％，PH为7.2-7.4，搅拌转速为40-60r/min，开启自动通气系统进行细胞培养；
4)24h换液：当生物反应器中细胞培养至24h后，停止加热和搅拌，关闭自动通气系统，静置3-5分钟，通过管道系统排出细胞培养液，然后通过管道系统加入等量的细胞维持液，开启通气系统，继续在加热和搅拌条件下培养细胞；5)收获一收抗原：当生物反应器中细胞培养至48-52h后，停止搅拌，关闭温度及自动通气系统，静置3-5分钟，通过管道系统收获上清液，为一收抗原，开启自动通气系统，继续在加热和搅拌条件下培养细胞，将一收抗原置于-15℃下冷冻保存；
6)再次消化细胞上罐：当接毒后细胞在生物反应器中培养至48-52h后，部分细胞开始脱落，再次选择细胞状态良好的转瓶PK-15细胞，按照步骤1)和2)进行转瓶细胞消化和细胞过滤，得到细胞过滤液，然后将细胞过滤液加入生物反应器中培养，所述细胞过滤液的加入量满足10-20个细胞/个微载体，调节生物反应器中的细胞培养参数，其中，温度为36.5-37.5℃，DO为50-60％，PH为7.2-7.4，搅拌转数为40-50r/min，开启自动通气系统进行细胞培养，8-10h后将搅拌转数调为50-60r/min；
7)收获二收抗原并换液培养：当生物反应器中细胞培养至96h后，停止搅拌，关闭温度及自动通气系统，静置3-5分钟，通过管道系统再次收获上清液，为二收抗原，将二收抗原置于-15℃下冷冻保存，重新加入等量的细胞维持液继续培养，调节生物反应期内细胞培养参数，其中，温度为36.5-37.5℃，DO为50-60％，PH为7.2-7.4，搅拌转数为50-60r/min，开启自动通气系统，继续在加热和搅拌条件下培养细胞；
8)收获三收抗原：当反应器中细胞培养至120-144h后，调节搅拌转数为100-150r/min，搅拌3-5分钟，停止加热，关闭通气系统，再次通过管道系统收获上清液，为三收抗原，将三收抗原置于-15℃下冷冻保存；
9)冻融、过滤收获抗原液：将一收抗原、二收抗原和三收抗原融化，分别过滤去除微载体，得到抗原液并进行效价检测。
步骤1)，所述胰酶消化液中胰酶的质量分数为0.25％。
步骤3)，根据反应器中微载体的数量、上罐时计划每个微载体所需细胞数、转瓶细胞消化过滤后细胞密度计算出所需的细胞液的量，上罐时每个微载体细胞数应控制在30-50个细胞之间。
步骤4)，所述细胞维持液为含3mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的细胞维持液
步骤6)，当接毒细胞培养至72h时添加D-氨基葡萄糖盐酸，使D-氨基葡萄糖盐酸在细胞维持液中的浓度为3mmol/L；
步骤9)，所述过滤采用孔径80-120微米的过滤网。
所述通气系统模式为Air/O2/CO2模式。
本发明采用以上技术方案，具有如下有益效果：1、PK-15细胞消化容易产生团块，造成贴壁不均，本发明选择合适大小的细胞过滤筛网，将过滤后去除团块的细胞加入生物反应器，使其贴壁均匀。2、在细胞同步接毒培养48-52h后，细胞染毒逐渐开始脱落，此时收获病毒液，增加抗原收获量。3、于接毒细胞培养48-52h时再一次消化转瓶细胞，经过过滤后再将细胞加入反应器中，细胞再次贴在具有贴壁空间的微载体上，从而增加细胞密度。4、培养至96h换液，再次收获换出的病毒液抗原，继续培养至120-144h再次收获病毒液抗原，共收获3收抗原。本发明采用改进的微载体生物反应器培养工艺，能够提高细胞贴壁效率，减少细胞团块，增加贴壁后细胞密度，并且能够提高单批抗原收获量，提高抗原效价，降低生产成本。
具体实施方式
一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法，包括以下步骤：
1)转瓶细胞消化：选择细胞状态良好的转瓶PK-15细胞，使用质量分数为0.25％的胰酶消化液消化细胞，将消化后的细胞充分摇匀；
2)细胞过滤：使用10-20微米的细胞过滤器过滤细胞，得到细胞液，过滤后的细胞呈大部分单个，少部分2-3个的细胞状态，取少量过滤后的细胞液用维持液进行4-6倍稀释，然后取少量稀释后细胞液加至细胞计数板进行细胞计数，计算出过滤后细胞液的细胞密度；
3)细胞接毒上罐培养：将微载体按3-5g/升加入生物反应器中，同时加入7-9倍微载体体积的含血清的营养液，开启搅拌器，搅拌转速为40-60r/min，将猪圆环病毒2型毒种按培养体积的1-5％的量加入细胞液中，然后将细胞液加入生物反应器中，所述细胞液的加入量根据细胞液密度按每个微载体30-50个细胞计算，调节生物反应器中的细胞培养参数，其中，温度为36.5-37.5℃，DO为50-60％，PH为7.2-7.4，选择通气系统模式(Air/O2/CO2)，开启自动通气系统进行细胞培养；
4)24h换液：当生物反应器中细胞培养至24h后，停止加热和搅拌，关闭自动通气系统，静置3-5分钟，通过管道系统排出细胞培养液，然后通过管道系统加入等量的含3mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的细胞维持液，开启自动通气系统继续，在加热和搅拌条件下继续培养细胞；
5)收获一收抗原：当生物反应器中细胞培养至48-52h后，停止加热和搅拌，关闭自动通气系统，静置3-5分钟，通过管道系统收获上清液，为一收抗原，开启自动通气系统，在加热和搅拌条件下继续培养，将一收抗原置于-15℃下冷冻保存；
6)再次消化细胞上罐：当接毒后细胞在反应器中培养至48-52h后，部分细胞开始脱落，再次选择细胞状态良好的转瓶PK-15细胞，按照步骤1)和2)进行转瓶细胞消化和细胞过滤，得到细胞过滤液，然后将细胞过滤液加入生物反应器中培养，所述细胞过滤液的加入量满足10-20个细胞/个微载体，调节生物反应器中的细胞培养参数，其中，温度为36.5-37.5℃，DO为50-60％，PH为7.2-7.4，转数为40-50r/min，选择通气系统模式(Air/O2/CO2)，开启自动通气系统进行搅拌培养，8-10h后将转数调为50-60r/min；当接毒细胞培养至72h时添加D-氨基葡萄糖盐酸，使D-氨基葡萄糖盐酸在细胞维持液中的的浓度为3mmol/L；
7)收获二收抗原并换液培养：当反应器中细胞培养至96h后，停止搅拌，关闭温度及自动通气系统，静置3-5分钟，通过管道系统再次收获上清液，为二收抗原，将二收抗原置于-15℃下冷冻保存，重新加入等量的细胞维持液继续培养，开启搅拌器、温度、通气系统，调节细胞培养参数，其中，温度为36.5-37.5℃，DO为50％-60％，PH为7.2-7.4，转数为50-60r/min，开启自动通气系统，继续在加热和搅拌条件下培养细胞；
8)收获三收抗原：当反应器中细胞培养至120-144h后，调节搅拌转数为100-150r/min，搅拌3-5分钟，停止加热和搅拌，关闭自动通气系统，再次收获上清液，为三收抗原，将三收抗原置于-15℃下冷冻保存；
9)冻融、过滤收获抗原液：将一收抗原、二收抗原和三收抗原融化，分别通过孔径80-120微米的过滤网进行过滤去除微载体，得到抗原液并进行效价检测。
抗原效价检测方法是采用间接免疫荧光法测定病毒效价，步骤如下：
抗原稀释与细胞铺板：将抗原样品用消化、稀释好的细胞悬液进行10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6 3个稀释度的病毒细胞液，分别加入96孔细胞培养板中，每个稀释度加6孔，100μl/孔，同时设立阳性对照与不同密度细胞的阴性对照。置37℃含5％CO2培养箱中培养24小时，并换用含3mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM维持液，继续培养48h。
细胞固定、加一抗与二抗：将各组细胞板弃去维持液，用PBS进行洗涤3次，用冷丙酮固定细胞，每孔加入200μl，置4℃放置30分钟，然后弃去丙酮，用PBS洗涤3次；加入PCV2抗体，50μl/孔，置37℃下1小时，弃去孔内液体，用PBS洗涤3次，加入FITC标记羊抗鼠IgG，50μl/孔，37℃作用1小时，弃去孔内液体，用PBS洗涤3次，避光保存待观察。
镱检观察：将上述各组细胞板置于荧光显微镜下观察，细胞对照孔应无荧光物质着染，而有绿色荧光物质着染的细胞孔判为PCV2感染阳性。
计算病毒TCID50：统计各组每个稀释度病毒接种细胞孔中PCV2阳性孔数，根据Reed-Muench法计算病毒TCID50，即病毒效价。
实施例1
一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法，包括以下步骤：
1)转瓶细胞消化：选择细胞状态良好的转瓶PK-15细胞，使用质量分数为0.25％的胰酶消化液消化细胞，将消化后的细胞充分摇匀；
2)细胞过滤：使用15微米的细胞过滤器过滤细胞，得到细胞液，过滤后的细胞呈大部分单个，少部分2-3个的细胞状态，取少量过滤后的细胞液用维持液进行5倍稀释，然后取少量稀释后细胞液加至细胞计数板进行细胞计数，计算出过滤后细胞液的细胞密度；
3)细胞接毒上罐培养：将微载体按4g/升加入生物反应器中，同时加入8倍微载体体积的含血清的营养液，开启搅拌器，搅拌转速为50r/min，将猪圆环病毒2型毒种按培养体积的3.5％的量加入细胞液中，然后将细胞液加入生物反应器中，所述细胞液的加入量根据细胞液密度按每个微载体40个细胞计算，调节生物反应器中的细胞培养参数，其中，温度为37℃，DO为55％，PH为7.3，选择通气系统模式(Air/O2/CO2)，开启自动通气系统进行细胞培养；
4)24h换液：当生物反应器中细胞培养至24h后，停止加热和搅拌，关闭自动通气系统，静置4分钟，通过管道系统排出细胞培养液，然后通过管道系统加入等量的含3mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的细胞维持液，开启自动通气系统，在加热和搅拌条件下继续培养；
5)收获一收抗原：当生物反应器中细胞培养至50h后，停止加热和搅拌，关闭自动通气系统，静置4分钟，通过管道系统收获上清液，为一收抗原，开启自动通气系统，在加热和搅拌条件下继续培养，将一收抗原置于-15℃下冷冻保存；
6)再次消化细胞上罐：当接毒后细胞在反应器中培养至48-52h后，部分细胞开始脱落，再次选择细胞状态良好的转瓶PK-15细胞，按照步骤1)和2)进行转瓶细胞消化和细胞过滤，得到细胞过滤液，然后将细胞过滤液加入生物反应器中培养，所述细胞过滤液的加入量满足15个细胞/个微载体，调节生物反应器中的细胞培养参数，其中，温度为37℃，DO为55％，PH为7.3，转数为45r/min，选择通气系统模式
(Air/O2/CO2)，开启自动通气系统进行搅拌培养，9h后将转数调为55r/min；当接毒细胞培养至72h时添加D-氨基葡萄糖盐酸，使D-氨基葡萄糖盐酸在细胞维持液中的的浓度为3mmol/L；
7)收获二收抗原并换液培养：当反应器中细胞培养至96h后，停止加热和搅拌，关闭自动通气系统，静置4分钟，通过管道系统再次收获上清液，为二收抗原，将二收抗原置于-15℃下冷冻保存，重新加入等量的细胞维持液继续培养，开启搅拌器、温度、通气系统，调节细胞培养参数，其中，温度为37℃，DO为55％，PH为7.3，转数为55r/min，开启自动通气系统，继续在加热和搅拌条件下培养细胞；
8)收获三收抗原：当反应器中细胞培养至132h后，调节搅拌转数为125r/min，搅拌4分钟，停止加热和搅拌，关闭自动通气系统，再次收获上清液，为三收抗原，将三收抗原置于-15℃下冷冻保存；
9)冻融、过滤收获抗原液：将一收抗原、二收抗原和三收抗原融化，分别通过孔径100微米的过滤网进行过滤去除微载体，得到抗原液并进行效价检测。其中，抗原效价检测方法是采用间接免疫荧光法测定病毒效价。
实施例2
一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法，包括以下步骤：
1)转瓶细胞消化：选择细胞状态良好的转瓶PK-15细胞，使用质量分数为0.25％的胰酶消化液消化细胞，将消化后的细胞充分摇匀；
2)细胞过滤：使用10微米的细胞过滤器过滤细胞，得到细胞液，过滤后的细胞呈大部分单个，少部分2-3个的细胞状态，取少量过滤后的细胞液用维持液进行4倍稀释，然后取少量稀释后细胞液加至细胞计数板进行细胞计数，计算出过滤后细胞液的细胞密度；
3)细胞接毒上罐培养：将微载体按3g/升加入生物反应器中，同时加入7倍微载体体积的含血清的营养液，开启搅拌器，搅拌转速为40r/min，将猪圆环病毒2型毒种按培养体积的1％的量加入细胞液中，然后将细胞液加入生物反应器中，所述细胞液的加入量根据细胞液密度按每个微载体30个细胞计算，调节生物反应器中的细胞培养参数，其中，温度为36.5℃，DO为50％，PH为7.2，选择通气系统模式(Air/O2/CO2)，开启自动通气系统进行细胞培养；
4)24h换液：当生物反应器中细胞培养至24h后，停止加热和搅拌，关闭温自动通气系统，静置3-5分钟，通过管道系统排出细胞培养液，然后通过管道系统加入等量的含3mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的细胞维持液，开启自动通气系统，在加热和搅拌条件下继续培养；
5)收获一收抗原：当生物反应器中细胞培养至48h后，停止加热和搅拌，关闭自动通气系统，静置3分钟，通过管道系统收获上清液，为一收抗原，开启自动通气系统，在加热和搅拌条件下继续培养，将一收抗原置于-15℃下冷冻保存；
6)再次消化细胞上罐：当接毒后细胞在反应器中培养至48h后，部分细胞开始脱落，再次选择细胞状态良好的转瓶PK-15细胞，按照步骤1)和2)进行转瓶细胞消化和细胞过滤，得到细胞过滤液，然后将细胞过滤液加入生物反应器中培养，所述细胞过滤液的加入量满足10个细胞/个微载体，调节生物反应器中的细胞培养参数，其中，温度为36.5℃，DO为50％，PH为7.2，转数为40r/min，选择通气系统模式(Air/O2/CO2)，开启自动通气系统进行搅拌培养，8h后将转数调为50-60r/min；当接毒细胞培养至72h时添加D-氨基葡萄糖盐酸，使D-氨基葡萄糖盐酸在细胞维持液中的的浓度为3mmol/L；
7)收获二收抗原并换液培养：当反应器中细胞培养至96h后，停止搅拌，关闭温度及自动通气系统，静置3-5分钟，通过管道系统再次收获上清液，为二收抗原，将二收抗原置于-15℃下冷冻保存，重新加入等量的细胞维持液继续培养，开启搅拌器、温度、通气系统，调节细胞培养参数，其中，温度为36.5℃，DO为50％，PH为7.2，转数为50r/min，开启自动通气系统，继续在加热和搅拌条件下培养细胞；
8)收获三收抗原：当反应器中细胞培养至120h后，调节搅拌转数为100r/min，搅拌3分钟，停止加热和搅拌，关闭自动通气系统，再次收获上清液，为三收抗原，将三收抗原置于-15℃下冷冻保存；
9)冻融、过滤收获抗原液：将一收抗原、二收抗原和三收抗原融化，分别通过孔径80微米的过滤网进行过滤去除微载体，得到抗原液并进行效价检测。其中，抗原效价检测方法是采用间接免疫荧光法测定病毒效价。
实施例3
一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法，包括以下步骤：
1)转瓶细胞消化：选择细胞状态良好的转瓶PK-15细胞，使用质量分数为0.25％的胰酶消化液消化细胞，将消化后的细胞充分摇匀；
2)细胞过滤：使用20微米的细胞过滤器过滤细胞，得到细胞液，过滤后的细胞呈大部分单个，少部分2-3个的细胞状态，取少量过滤后的细胞液用维持液进行6倍稀释，然后取少量稀释后细胞液加至细胞计数板进行细胞计数，计算出过滤后细胞液的细胞密度；
3)细胞接毒上罐培养：将微载体按5g/升加入生物反应器中，同时加入9倍微载体体积的含血清的营养液，开启搅拌器，搅拌转速为60r/min，将猪圆环病毒2型毒种按培养体积的5％的量加入细胞液中，然后将细胞液加入生物反应器中，所述细胞液的加入量根据细胞液密度按每个微载体50个细胞计算，调节生物反应器中的细胞培养参数，其中，温度为37.5℃，DO为60％，PH为7.4，选择通气系统模式(Air/O2/CO2)，开启自动通气系统进行细胞培养；
4)24h换液：当生物反应器中细胞培养至24h后，停止加热和搅拌，关闭自动通气系统，静置5分钟，通过管道系统排出细胞培养液，然后通过管道系统加入等量的含3mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的细胞维持液，开启自动通气系统，在加热和搅拌条件下继续培养；
5)收获一收抗原：当生物反应器中细胞培养至52h后，停止加热和搅拌，关闭自动通气系统，静置5分钟，通过管道系统收获上清液，为一收抗原，开启自动通气系统，在加热和搅拌条件下继续培养，将一收抗原置于-15℃下冷冻保存；
6)再次消化细胞上罐：当接毒后细胞在反应器中培养至52h后，部分细胞开始脱落，再次选择细胞状态良好的转瓶PK-15细胞，按照步骤1)和2)进行转瓶细胞消化和细胞过滤，得到细胞过滤液，然后将细胞过滤液加入生物反应器中培养，所述细胞过滤液的加入量满足20个细胞/个微载体，调节生物反应器中的细胞培养参数，其中，温度为37.5℃，DO为60％，PH为7.4，转数为50r/min，选择通气系统模式(Air/O2/CO2)，开启自动通气系统进行搅拌培养，10h后将转数调为60r/min；当接毒细胞培养至72h时添加D-氨基葡萄糖盐酸，使D-氨基葡萄糖盐酸在细胞维持液中的的浓度为3mmol/L；
7)收获二收抗原并换液培养：当反应器中细胞培养至96h后，停止搅拌，关闭温度及自动通气系统，静置5分钟，通过管道系统再次收获上清液，为二收抗原，将二收抗原置于-15℃下冷冻保存，重新加入等量的细胞维持液继续培养，开启搅拌器、温度、通气系统，调节细胞培养参数，其中，温度为37.5℃，DO为60％，PH为7.4，转数为60r/min，开启自动通气系统，继续在加热和搅拌条件下培养细胞；
8)收获三收抗原：当反应器中细胞培养至144h后，调节搅拌转数为150r/min，搅拌5分钟，停止加热和搅拌，关闭自动通气系统，再次收获上清液，为三收抗原，将三收抗原置于-15℃下冷冻保存；
9)冻融、过滤收获抗原液：将一收抗原、二收抗原和三收抗原融化，分别通过孔径120微米的过滤网进行过滤去除微载体，得到抗原液并进行效价检测。其中，抗原效价检测方法是采用间接免疫荧光法测定病毒效价。
对比例
一种培养猪圆环病毒2型的方法：
1.消化转瓶细胞上罐：用0.25％的胰酶消化液消化转瓶PK-15细胞，并摇匀消化后的细胞，将消化后的细胞取样进行细胞计数，按规定细胞密度把所需细胞量加入反应器罐中，同时按一定的接毒量接入猪圆环病毒2型种毒，调节生物反应器各项培养参数进行培养。
2.换液培养及收获：反应器中的细胞培养至24h进行更换维持液，添加D-氨基葡萄糖继续培养到所需时间收获，收获时先静置一段时间让载体沉淀下来，然后收获上清液。
使用10升的微载体生物反应器培养5升的细胞及病毒，对比本发明方法与对比例两种方法的细胞贴壁率，24h的细胞团块与细胞数量，两种方法各生产5批。
表1
Figure BDA0001542105480000101
由表1可知，与传统方法相比，本发明方法可以提高细胞贴壁效率，减少细胞团块，增加贴壁后细胞密度。
使用10升的微载体生物反应器培养5升的细胞及病毒，对比本发明方法与对比例两种方法的批次抗原收获量及不同抗原效价，两种方法各生产5批。
表2
Figure BDA0001542105480000102
由表2可知，与传统方法相比，本发明方法可以增加批次抗原收获量，提高抗原效价。

Claims (4)

1.一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1）转瓶细胞消化：将转瓶PK-15细胞用胰酶消化液消化细胞，将消化后的细胞摇匀；
2）细胞过滤：使用10-20微米的细胞过滤器过滤细胞，得到细胞液，取少量过滤后的细胞液用维持液进行4-6倍稀释，然后取少量稀释后细胞液加至细胞计数板进行细胞计数，计算出过滤后细胞液的细胞密度；
3）细胞接毒上罐培养：将微载体按3-5g/升加入生物反应器中，同时加入7-9倍微载体体积的含血清的营养液，将猪圆环病毒2型毒种按培养体积的1-5%的量加入细胞液中，然后将细胞液加入生物反应器中，所述细胞液的加入量根据细胞液密度按每个微载体30-50个细胞计算，调节生物反应器中的细胞培养参数，其中，温度为36.5-37.5℃，DO为50-60%，PH为7.2-7.4，搅拌转速为40-60r/min，开启通气系统进行细胞培养；
4）24h换液：当生物反应器中细胞培养至24h后，停止加热和搅拌，关闭通气系统，静置3-5分钟，排出细胞培养液，然后加入等量的含3mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的细胞维持液，开启通气系统，继续在加热和搅拌条件下培养细胞；
5）收获一收抗原：当生物反应器中细胞培养至48-52h后，停止加热和搅拌，关闭通气系统，静置3-5分钟，收获上清液，为一收抗原，开启通气系统，继续在加热和搅拌条件下培养细胞，将一收抗原置于-15℃下冷冻保存；
6）再次消化细胞上罐：再次将转瓶PK-15细胞按照步骤1）和2）进行转瓶细胞消化和细胞过滤，得到细胞过滤液，然后将细胞过滤液加入生物反应器中培养，所述细胞过滤液的加入量满足10-20个细胞/个微载体，调节生物反应器中的细胞培养参数，其中，温度为36.5-37.5℃，DO为50-60%，PH为7.2-7.4，搅拌转数为40-50r/min，开启通气系统进行细胞培养，8-10h后将搅拌转数调为50-60 r/min；当接毒细胞培养至72h时添加D-氨基葡萄糖盐酸，使D-氨基葡萄糖盐酸在细胞维持液中的浓度为3mmol/L；
7）收获二收抗原并换液培养：当生物反应器中细胞培养至96 h后，停止加热和搅拌，关闭通气系统，静置3-5分钟，再次收获上清液，为二收抗原，将二收抗原置于-15℃下冷冻保存，重新加入等量的细胞维持液继续培养，调节生物反应器中的细胞培养参数，其中，温度为36.5-37.5℃，DO为50-60%，PH为7.2-7.4，搅拌转数为50-60r/min，开启通气系统，继续在加热和搅拌条件下培养细胞；
8）收获三收抗原：当反应器中细胞培养至120-144h后，调节搅拌转数为100-150r/min，搅拌3-5分钟，停止加热，关闭通气系统，再次收获上清液，为三收抗原，将三收抗原置于-15℃下冷冻保存；
9）冻融、过滤收获抗原液：将一收抗原、二收抗原和三收抗原融化，分别过滤去除微载体，得到抗原液并进行效价检测。
2.根据权利要求1所述的一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法，其特征在于：步骤1），所述胰酶消化液中胰酶的质量分数为0.25％。
3.根据权利要求1所述的一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法，其特征在于：步骤9)，所述过滤采用孔径80-120微米的过滤网。
4.根据权利要求1所述的一种微载体生物反应器培养猪圆环病毒2型的方法，其特征在于：所述通气系统模式为Air/O2/CO2模式。
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