CN116926020A - 一种疱疹病毒载体细胞高密度培养方法 - Google Patents

一种疱疹病毒载体细胞高密度培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种疱疹病毒载体细胞高密度培养方法,属于生物医药技术领域,包括以下步骤:S1.改性多孔微载体的预处理;S2.细胞复苏和传代;S3.细胞的培养;S4.病毒接种、培养;S5.病毒收获及纯化;S1中预处理包括以重组人血清白蛋白包被改性多孔微载体。解决了疱疹病毒载体细胞培养密度低问题,增加了疱疹病毒载体细胞接种率,降低生产成本,实现了疱疹病毒载体细胞的高产量培养。

Description

一种疱疹病毒载体细胞高密度培养方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种疱疹病毒载体细胞高密度培养方法。
背景技术
疱疹病毒载体细胞高密度培养是指在人工条件下模拟体内生长环境,在细胞生物反应器中高密度生长,用于高效生产细胞培养相关生物制品的技术。在过去几十年里,细胞高密度培养技术不断更新发展,从使用转瓶、CellCube等贴壁细胞培养,发展为利用生物反应器结合微载体,高密度细胞培养技术。
目前,最常规的载体细胞体外培养的方法就是将载体细胞加入添加有胎牛血清的培养基中进行培养。然而,采用这种培养基培养的载体细胞,所含营养成分、促生长成分不足或浓度设置不合理,导致细胞生长比较缓慢,而且传递次数超过5代之后其分化成功能细胞的潜能大大降低;另一方面,牛血清相对于人是异源性的东西,从而限制了其在临床上的应用。
因此,探索如何快速扩增载体细胞、增强细胞活力而又不影响其潜能、避免细胞老化的培养基及培养方法是非常重要的研究内容。
发明内容
为此,本发明提供一种疱疹病毒载体细胞高密度培养方法,以解决现有技术中由于疱疹病毒载体细胞培养密度低,载体细胞生长缓慢而导致的疱疹病毒载体细胞培养密度低,生产成本高的问题。
为了实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
根据本发明的第一方面,提供了一种疱疹病毒载体细胞高密度培养方法,包括以下步骤:
S1.改性多孔微载体的预处理;
S2.细胞复苏和传代;
S3.细胞的培养;
S4.病毒接种、培养;
S5.病毒收获及纯化。
进一步地,S1中所述预处理包括以重组人血清白蛋白包被改性多孔微载体。
进一步地,所述S2是将BHK-21细胞加入细胞培养液后放入到湿度95%、5%CO2的培养箱中培养,细胞长成单层后,加入适量预温EDTA-Trypsin消化液消化传代,并制成均匀的细胞悬液,分种于培养瓶中,加入细胞培养液继续培养,传代比例为1:3-1:4,2-3天换细胞培养液一次;细胞这样传代2-3次后,消化收集培养瓶中的细胞,并接种于HYPERStack培养室中,补加细胞培养液继续培养。
进一步地,所述S3具体为在温度36.5-37℃、气体压力10psi、pH6.8-7.5、DO30-60%条件下进行细胞的扩增培养,培养过程中保持葡萄糖含量为2-3g/L,培养过程中检测细胞密度、葡萄糖浓度Sglc各参数,维持葡萄糖浓度Sglc不低于2g/L,细胞生长密度达到1.5×106个/mL以上时,开始灌注。
进一步地,将HYPERStack培养室细胞消化收集至接种瓶,并将瓶中细胞接种于生物反应器中,接种初始细胞密度为1-5×105个/mL,细胞培养初始设定搅拌转速为40-70rpm,随着细胞生长和DO控制,逐渐加大搅拌转速至80-120rpm,所述细胞培养液是10%血清DMEM培养液。
进一步地,所述S4具体为通过蠕动泵将疱疹病毒注入细胞罐中,然后将感染后的病毒稀释液排出回收并重新连续注入所述细胞罐内进行持续灌注感染,多次回收病毒稀释液,病毒稀释液会被重新回收并再次在细胞罐中感染细胞,循环3次后加入无血清DMEM培养液继续培养至CPE达到85%以上时收获病毒液,获得疱疹病毒培养物。
进一步地,所述S5具体为将含有改性多孔微载体和疱疹病毒培养物经过细胞破碎、澄清、超滤浓缩、核酸酶处理、层析和超滤洗滤等工序获得原液。
进一步地,所述多孔微载体为PBLG多孔微载体,改性方式为通过偶联剂溶液浸润改性。
进一步地,所述偶联剂溶液制备方法为分别取1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基咪唑盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺置入NaCl溶液中,控制pH为5.4,制备得到偶联剂溶液。
进一步地,用于感染细胞的疱疹病毒的病毒滴度为4.9-5.2×105PFU/mL,感染复数(MOI)为0.004-0.008。
本发明具有如下优点:
1.本发明的改性多孔微载体是一种水凝胶体系,具有良好的生物相容性以及机械性能,为细胞提供了足够的生长空间和更大的附着面积,有利于营养成分的进入和代谢产物的排出,提高了细胞培养密度。
2.本发明采用灌流培养和微流控培养相结合的模式,使营养液与培养物充分接触,有利于营养成分和氧的传递,实现疱疹病毒与细胞快速混合和反应过程,缩短反应时间,提高反应效率和产物质量。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种疱疹病毒载体细胞高密度培养方法,包括以下步骤:
S1.改性多孔微载体的预处理:
S2.细胞复苏和传代;
S3.细胞的培养;
S4.病毒接种、培养;
S5.病毒收获及纯化。
具体的,S1中预处理包括以重组人血清白蛋白包被改性多孔微载体。
其中,S2是将BHK-21细胞加入细胞培养液后放入到湿度95%、5%CO2的培养箱中培养,细胞长成单层后,加入适量预温EDTA-Trypsin消化液消化传代,并制成均匀的细胞悬液,分种于培养瓶中,加入细胞培养液继续培养,传代比例为1:4,3天换细胞培养液一次;细胞这样传代3次后,消化收集培养瓶中的细胞,并接种于生物反应器中,接种初始细胞密度为1-5×105个/mL。
其中,S3具体为在温度37℃、气体压力10psi、pH7.2、DO60%条件下进行细胞的扩增培养,培养过程中保持葡萄糖含量为3g/L,培养过程中检测细胞密度、葡萄糖浓度Sglc各参数,维持葡萄糖浓度Sglc为3g/L。
将HYPERStack培养室细胞收集消化收集至接种瓶,并将瓶中细胞接种并接种于生物反应器中,接种初始细胞密度为1-5×105个/mL,细胞培养初始设定搅拌转速为70rpm,随着细胞生长和DO控制,逐渐加大搅拌转速至120rpm,细胞培养液是10%血清DMEM培养液。
其中,S4具体为直接将疱疹病毒接入细胞罐中,然后将感染后的病毒稀释液排出回收并重新连续注入所述细胞罐内进行持续灌注感染,多次回收病毒稀释液。病毒稀释液会被重新回收并再次在细胞罐中感染细胞,循环3次后加入无血清DMEM培养液继续培养至CPE达到85%以上时收获病毒液,获得疱疹病毒培养物。
其中,S5具体为将含有改性多孔微载体和疱疹病毒培养物经过细胞破碎、澄清、超滤浓缩、核酸酶处理、层析和超滤洗滤等工序获得原液。
具体的,多孔微载体为PBLG多孔微载体,改性方式为通过偶联剂溶液浸润改性。
其中,偶联剂溶液制备方法为分别取1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基咪唑盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺置入NaCl溶液中,控制pH为5.2,制备得到偶联剂溶液。
其中,用于感染细胞的疱疹病毒的病毒滴度为4.9-5.2×105PFU/mL,感染复数(MOI)为0.008。
实施例1:
S1.改性多孔微载体的预处理:
1.首先分别取1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基咪唑盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺置入NaCl溶液中,控制pH为5.2,制备得到偶联剂溶液;将PBLG多孔微载体浸润入偶联剂溶液内,静置5min,制得改性多孔微载体。
2.将改性后的多孔微载体以为2%的重组人血清白蛋白中4℃包被8h。
S2.细胞复苏和传代:将BHK-21细胞加入细胞培养液后放入到湿度95%、5%CO2的培养箱中培养,细胞长成单层后,加入适量预温EDTA-Trypsin消化液消化传代,并制成均匀的细胞悬液,分种于培养瓶中,加入细胞培养液继续培养,传代比例为1:3,3天换细胞培养液一次;细胞这样传代3次后,消化收集培养瓶中的细胞,并接种于HYPERStack培养室中,补加细胞培养液继续培养。
S3.细胞的培养:在温度37℃、气体压力10psi、pH7.5、DO60%条件下进行细胞的扩增培养,培养过程中保持葡萄糖含量为3g/L,培养过程中检测细胞密度、葡萄糖浓度Sglc各参数,维持葡萄糖浓度Sglc为3g/L。
然后,将HYPERStack培养室细胞收集消化收集至接种瓶,并将瓶中细胞接种并接种于生物反应器中,接种初始细胞密度为1-5×105个/mL,细胞培养初始设定搅拌转速为40rpm,随着细胞生长和DO控制,逐渐加大搅拌转速至80rpm,细胞培养液是10%血清DMEM培养液。
S4.病毒接种、培养:直接将疱疹病毒接入细胞罐中,加入无血清DMEM培养液继续培养至CPE达到85%以上时收获病毒液,获得疱疹病毒培养物。
S5.病毒收获及纯化:将含有改性多孔微载体和疱疹病毒培养物经过细胞破碎、澄清、超滤浓缩、核酸酶处理、层析和超滤洗滤等工序获得原液。
实施例2:
S1.改性多孔微载体的预处理:
1.首先分别取1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基咪唑盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺置入NaCl溶液中,控制pH为5.2,制备得到偶联剂溶液;将PBLG多孔微载体浸润入偶联剂溶液内,静置5min,制得改性多孔微载体。
2.将改性后的多孔微载体以为2%的重组人血清白蛋白中4℃包被8h。
S2.细胞复苏和传代:将BHK-21细胞加入细胞培养液后放入到湿度95%、5%CO2的培养箱中培养,细胞长成单层后,加入适量预温EDTA-Trypsin消化液消化传代,并制成均匀的细胞悬液,分种于培养瓶中,加入细胞培养液继续培养,传代比例为1:4,3天换细胞培养液一次;细胞这样传代3次后,消化收集培养瓶中的细胞,并接种于HYPERStack培养室中,补加细胞培养液继续培养。
S3.细胞的培养:在温度37℃、气体压力10psi、pH7.5、DO40%条件下进行细胞的扩增培养,培养过程中保持葡萄糖含量为3g/L,培养过程中检测细胞密度、葡萄糖浓度Sglc各参数,维持葡萄糖浓度Sglc为3g/L。
然后,将HYPERStack培养室细胞收集消化收集至接种瓶,并将瓶中细胞接种并接种于生物反应器中,接种初始细胞密度为1-5×105个/mL,细胞培养初始设定搅拌转速为70rpm,随着细胞生长和DO控制,逐渐加大搅拌转速至120rpm,细胞培养液是10%血清DMEM培养液。
S4.病毒接种、培养:直接将疱疹病毒接入细胞罐中,然后将感染后的病毒稀释液排出回收并重新连续注入所述细胞罐内进行持续灌注感染,多次回收病毒稀释液。病毒稀释液会被重新回收并再次在细胞罐中感染细胞,循环3次后加入无血清DMEM培养液继续培养至CPE达到85%以上时收获病毒液,获得疱疹病毒培养物。
S5.病毒收获及纯化:将含有改性多孔微载体和疱疹病毒培养物经过细胞破碎、澄清、超滤浓缩、核酸酶处理、层析和超滤洗滤等工序获得原液。
实施例3:
S1.改性多孔微载体的预处理:
1.首先分别取1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基咪唑盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺置入NaCl溶液中,控制pH为5.2,制备得到偶联剂溶液;将PBLG多孔微载体浸润入偶联剂溶液内,静置5min,制得改性多孔微载体。
2.将改性后的多孔微载体以为2%的重组人血清白蛋白中4℃包被8h。
S2.细胞复苏和传代:将BHK-21细胞加入细胞培养液后放入到湿度95%、5%CO2的培养箱中培养,细胞长成单层后,加入适量预温EDTA-Trypsin消化液消化传代,并制成均匀的细胞悬液,分种于培养瓶中,加入细胞培养液继续培养,传代比例为1:3,3天换细胞培养液一次;细胞这样传代3次后,消化收集培养瓶中的细胞,并接种于生物反应器中,接种初始细胞密度为1-5×105个/mL。
S3.细胞的培养:在温度37℃、气体压力10psi、pH6.8、DO60%条件下进行细胞的扩增培养,培养过程中保持葡萄糖含量为3g/L,培养过程中检测细胞密度、葡萄糖浓度Sglc各参数,维持葡萄糖浓度Sglc为3g/L。
然后,将HYPERStack培养室细胞收集消化收集至接种瓶,并将瓶中细胞接种并接种于生物反应器中,接种初始细胞密度为1-5×105个/mL,细胞培养初始设定搅拌转速为70rpm,随着细胞生长和DO控制,逐渐加大搅拌转速至120rpm,细胞培养液是10%血清DMEM培养液。
S4.病毒接种、培养:直接将疱疹病毒接入细胞罐中,然后将感染后的病毒稀释液排出回收并重新连续注入所述细胞罐内进行持续灌注感染,多次回收病毒稀释液。病毒稀释液会被重新回收并再次在细胞罐中感染细胞,循环3次后加入2%新生牛血清培养液继续培养至CPE达到85%以上时收获病毒液,获得疱疹病毒培养物。
S5.病毒收获及纯化:将含有改性多孔微载体和疱疹病毒培养物经过细胞破碎、澄清、超滤浓缩、核酸酶处理、层析和超滤洗滤等工序获得原液。
实施例4:
S1.微载体的预处理:将微载体以2%的重组人血清白蛋白中4℃包被8h。
S2.细胞复苏和传代:将BHK-21细胞加入细胞培养液后放入到湿度95%、5%CO2的培养箱中培养,细胞长成单层后,加入适量预温EDTA-Trypsin消化液消化传代,并制成均匀的细胞悬液,分种于培养瓶中,加入细胞培养液继续培养,传代比例为1:4,3天换细胞培养液一次;细胞这样传代3次后,消化收集培养瓶中的细胞,并接种于生物反应器中,接种初始细胞密度为1-5×105个/mL。
S3.细胞的培养:在温度37℃、气体压力10psi、pH7.5、DO60%条件下进行细胞的扩增培养,培养过程中保持葡萄糖含量为3g/L,培养过程中检测细胞密度、葡萄糖浓度Sglc各参数,维持葡萄糖浓度Sglc为3g/L。
然后,将HYPERStack培养室细胞收集消化收集至接种瓶,并将瓶中细胞接种并接种于生物反应器中,接种初始细胞密度为1-5×105个/mL,细胞培养初始设定搅拌转速为70rpm,随着细胞生长和DO控制,逐渐加大搅拌转速至120rpm,细胞培养液是10%血清DMEM培养液。
S4.病毒接种、培养:直接将疱疹病毒接入细胞罐中,然后将感染后的病毒稀释液排出回收并重新连续注入所述细胞罐内进行持续灌注感染,多次回收病毒稀释液。病毒稀释液会被重新回收并再次在细胞罐中感染细胞,循环3次后加入无血清DMEM培养液继续培养至CPE达到85%以上时收获病毒液,获得疱疹病毒培养物。
S5.病毒收获及纯化:将含有改性多孔微载体和疱疹病毒培养物经过细胞破碎、澄清、超滤浓缩、核酸酶处理、层析和超滤洗滤等工序获得原液。
实施例5:
S1.改性多孔微载体的预处理:
1.首先分别取1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基咪唑盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺置入NaCl溶液中,控制pH为5.2,制备得到偶联剂溶液;将PBLG多孔微载体浸润入偶联剂溶液内,静置5min,制得改性多孔微载体。
2.将改性后的多孔微载体以为2%的重组人血清白蛋白中4℃包被8h。
S2.细胞复苏和传代:将BHK-21细胞加入细胞培养液后放入到湿度95%、5%CO2的培养箱中培养,细胞长成单层后,加入适量预温EDTA-Trypsin消化液消化传代,并制成均匀的细胞悬液,分种于培养瓶中,加入细胞培养液继续培养,传代比例为1:4,3天换细胞培养液一次;细胞这样传代3次后,消化收集培养瓶中的细胞,并接种于细胞工厂中,并加入细胞培养液继续培养。
S3.细胞的培养:在温度37℃、气体压力10psi、pH6.8、DO40%条件下进行细胞的扩增培养,培养过程中保持葡萄糖含量为3g/L,培养过程中检测细胞密度、葡萄糖浓度Sglc各参数,维持葡萄糖浓度Sglc为3g/L。
然后,将细胞工厂中培养的细胞收集消化收集至接种瓶,并将瓶中细胞接种并接种于生物反应器中,接种初始细胞密度为1-5×105个/mL,细胞培养初始设定搅拌转速为70rpm,随着细胞生长和DO控制,逐渐加大搅拌转速至120rpm,细胞培养液是10%血清DMEM培养液。
S4.病毒接种、培养:直接将疱疹病毒接入细胞罐中,然后将感染后的病毒稀释液排出回收并重新连续注入所述细胞罐内进行持续灌注感染,多次回收病毒稀释液。病毒稀释液会被重新回收并再次在细胞罐中感染细胞,循环3次后加入无血清DMEM培养液继续培养至CPE达到85%以上时收获病毒液,获得疱疹病毒培养物。
S5.病毒收获及纯化:将含有改性多孔微载体和疱疹病毒培养物经过细胞破碎、澄清、超滤浓缩、核酸酶处理、层析和超滤洗滤等工序获得原液。
实施例6:
在实施例1的基础上,批次培养接毒,接毒后不进行灌流以及微流控培养,其他成份及步骤与实施例1相同。
结果与分析:
对实施例1-6收获的疱疹病毒原液,按照2022版《药典三部》,进行原液的全面检定,病毒滴度采用蚀斑检测法(以Reed公式计算),紫外分光光度计法测定病毒颗粒数,实施例以及对比例各项检定结果见表1。
表1:实施例以及对比例各项检定结果
由表1中的数据可以得出的结论是:
1.相比实施例1中灌流与微流控培养结合的形式,实施例2中采用单纯灌流的方式减少了疱疹病毒与细胞的接触面积和接触时间,降低了病毒接种时细胞密度和单细胞产量,从而影响了总病毒量,导致实施例2得到的总病毒量相对于实施例1有所减少。微流控培养的方式可以实现对细胞培养的精确控制和操作,包括流速、温度、压力、浓度等参数的精确调节和控制,实现疱疹病毒与细胞快速混合和反应过程,缩短反应时间,提高反应效率和产物质量。
2.实施例1中采用疱疹病毒接种后采用无血清培养基,无血清培养基相比实施例3中2%新生牛血清培养液与BHK-21细胞适配性更高,效果更好,并且实施例3中2%新生牛血清培养液可能存在一定的病毒和传染性疾病的风险。而无血清培养基则通过无血清的方式来避免这些潜在的风险,特别适用于一些对病毒敏感的实验和应用。
3.实施例1中采用改性多孔微载体相比实施例4中采用的普通微载体,改性多孔微载体细胞的通过偶联剂的改性增加了微载体的粘附度,从而实施例1的病毒滴度和总病毒量均高于实施例4中得到的病毒滴度和总病毒量,并且其多孔结构为细胞提供了足够的生长空间和更大的附着面积,有利于营养成分的进入和代谢产物的排出,提高了细胞培养密度。
4.本实施例1中采用的HYPERStack培养室培养面积均为6000cm2,与实施例5中采用的细胞工厂培养面积相同,由数据可得,相同培养面积情况下采用HYPERStack培养室培养的细胞数量远高于细胞工厂培养的产量,因此HYPERStack培养室的使用更有利于提升病毒产量。
5.实施例6中采用批次培养获得的细胞密度远低于实施例1中灌流以及微流控培养结合的方式所获得的细胞浓度,连续灌流系统,使细胞稳定的处在较好的的营养环境中,有害代谢废物浓度积累较低;并且灌流的方式使营养液与细胞充分接触,有利于营养成分和氧的传递。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种疱疹病毒载体细胞高密度培养方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.改性多孔微载体的预处理;
S2.细胞复苏和传代;
S3.细胞的培养;
S4.病毒接种、培养;
S5.病毒收获及纯化;
所述预处理包括以重组人血清白蛋白包被改性多孔微载体;
所述S2是将BHK-21细胞加入细胞培养液后放入到湿度95%、5%CO2的培养箱中培养,细胞长成单层后,加入适量预温EDTA-Trypsin消化液消化传代,并制成均匀的细胞悬液,分种于培养瓶中,加入细胞培养液继续培养,传代比例为1:3-1:4,2-3天换细胞培养液一次;细胞这样传代2-3次后,消化收集培养瓶中的细胞,并接种于HYPERStack培养室中,补加细胞培养液继续培养;
所述S3具体为在温度36.5-37℃、气体压力10psi、pH6.8-7.5、DO30-60%条件下进行细胞的扩增培养,培养过程中保持葡萄糖含量为2-3g/L,培养过程中检测细胞密度、葡萄糖浓度Sglc各参数,维持葡萄糖浓度Sglc不低于2g/L,细胞生长密度达到1.5×106个/mL以上时,开始灌注;
所述S4具体为通过蠕动泵将疱疹病毒注入细胞罐中,然后将感染后的病毒稀释液排出回收并重新连续注入所述细胞罐内进行持续灌注感染,多次回收病毒稀释液,病毒稀释液会被重新回收并再次在细胞罐中感染细胞,循环3次后加入无血清DMEM培养液继续培养至CPE达到85%以上时收获病毒液,获得疱疹病毒培养物。
2.如权利要求1所述的疱疹病毒载体细胞高密度培养方法,其特征在于,将HYPERStack培养室细胞消化收集至接种瓶,并将瓶中细胞接种于生物反应器中,接种初始细胞密度为1-5×105个/mL细胞培养初始设定搅拌转速为40-70rpm,随着细胞生长和DO控制,逐渐加大搅拌转速至80-120rpm,所述细胞培养液是10%血清DMEM培养液。
3.如权利要求1所述的疱疹病毒载体细胞高密度培养方法,其特征在于,所述S5具体为将含有改性多孔微载体和疱疹病毒培养物经过细胞破碎、澄清、超滤浓缩、核酸酶处理、层析和超滤洗滤工序获得原液。
4.如权利要求1所述的疱疹病毒载体细胞高密度培养方法,其特征在于,所述多孔微载体为PBLG多孔微载体,改性方式为通过偶联剂溶液浸润改性。
5.如权利要求4所述的疱疹病毒载体细胞高密度培养方法,其特征在于,所述偶联剂溶液制备方法为分别取1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基咪唑盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺置入NaCl溶液中,控制pH为5.4,制备得到偶联剂溶液。
6.如权利要求1所述的疱疹病毒载体细胞高密度培养方法,其特征在于,用于感染细胞的疱疹病毒的病毒滴度为4.9-5.2×105PFU/mL,感染复数MOI为0.004-0.008。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060199260A1 (en) * 2002-05-01 2006-09-07 Zhiyu Zhang Microbioreactor for continuous cell culture
WO2021076993A1 (en) * 2019-10-16 2021-04-22 Orchard Therapeutics (Europe) Limited Compositions and methods for modifying eukaryotic cells
US20220204903A1 (en) * 2019-05-13 2022-06-30 Newsouth Innovations Pty Limited Microfluidic device and method of use for cell culture
CN115197966A (zh) * 2022-08-15 2022-10-18 深圳源兴基因技术有限公司 一种利用生物反应器大规模生产重组痘苗病毒载体的方法
US20230250391A1 (en) * 2020-09-15 2023-08-10 Lg Chem, Ltd. Microcarrier for cell culture, a method for producing the same, and a cell culture composition using the same

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060199260A1 (en) * 2002-05-01 2006-09-07 Zhiyu Zhang Microbioreactor for continuous cell culture
US20220204903A1 (en) * 2019-05-13 2022-06-30 Newsouth Innovations Pty Limited Microfluidic device and method of use for cell culture
WO2021076993A1 (en) * 2019-10-16 2021-04-22 Orchard Therapeutics (Europe) Limited Compositions and methods for modifying eukaryotic cells
US20230250391A1 (en) * 2020-09-15 2023-08-10 Lg Chem, Ltd. Microcarrier for cell culture, a method for producing the same, and a cell culture composition using the same
CN115197966A (zh) * 2022-08-15 2022-10-18 深圳源兴基因技术有限公司 一种利用生物反应器大规模生产重组痘苗病毒载体的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HASANNIA M 等: "Synthesis of doxorubicin-loaded peptosomes hybridized with gold nanorod for targeted drug delivery and CT imaging of metastatic breast cancer", 《J NANOBIOTECHNOLOGY》, vol. 20, no. 1, pages 1 - 27 *
闫磊 等: "微载体无血清培养水痘-带状疱疹病毒的效果", 《中国生物制品学杂志》, vol. 32, no. 12, pages 1425 - 1427 *

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