CN117070474B - 一种三维多孔微载体悬浮培养细胞生产病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三维多孔微载体悬浮培养细胞生产病毒的方法，所述方法包括细胞高密度培养和病毒培养，所述细胞高密度培养包括以下步骤：步骤a，细胞接种；步骤b，细胞培养；或者，所述细胞高密度培养包括以下步骤：步骤A，细胞接种；步骤B，细胞培养；步骤C，细胞传代；所述病毒培养包括病毒接种、收集、检测：生物反应器内细胞生长至细胞密度不低于2×106cells/mL时进行接种病毒，并持续收毒1‑5天。本方法在较低载体用量下细胞可达到较高密度，且病毒效价远高于普通二维，收毒时间短，大大提高了生产效率，节约了能耗。
Description
技术领域
本发明涉及病毒技术领域，特别是涉及一种三维多孔微载体悬浮培养细胞生产病毒的方法。
背景技术
目前，随着疫苗市场的迅速发展，疫苗生产工艺正经历着深刻的技术革新，传统费时、费力的二维细胞培养制备疫苗的工艺正向着应用生物反应器技术进行细胞培养进而制备疫苗的工艺进行转变。病毒的大规模生产可能成为病毒疫苗工业化的限制因素。因此，建立用于疫苗的细胞培养工艺已变得非常紧迫。用生物反应器大规模培养疫苗用细胞，是使生物技术转化为产品的关键，在疫苗生产过程中的作用日益明显。
微载体培养是目前公认最具发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，且容易放大。该技术已广泛用于培养各类型细胞，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、人二倍体细胞。目前市面常用微载体包括实心球结构和多孔微粒结构，例如，本发明专利中使用三维多孔可降解微载体。虽然市面上有许多实心球培养细胞生产病毒的相关内容，但是现有培养技术存在周期过长的问题，如专利CN115287269A中公开的方法其细胞培养6天收毒需要15天。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的培养周期过长的问题，而提供一种三维多孔微载体悬浮培养细胞生产病毒的方法。
本发明的另一目的，提供一种所述方法生产的病毒。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：
一种三维多孔微载体悬浮培养细胞生产病毒的方法，包括细胞高密度培养和病毒培养，所述细胞高密度培养包括以下步骤：
步骤a，细胞接种：三维多孔微载体密度按照2-10g/L进行配制、灭菌并置换PBS，采用间歇接种的方法接种载体细胞；
步骤b，细胞培养：载体细胞在生物反应器中与三维多孔微载体混匀悬浮培养，并每天取样计数，观测细胞增殖情况，并根据葡萄糖含量及时进行换液；
或者，所述细胞高密度培养包括以下步骤：
步骤A，细胞接种：三维多孔微载体密度按照2-10g/L进行配制、灭菌并置换PBS，采用间歇接种的方法接种载体细胞；
步骤B，细胞培养：载体细胞在生物反应器中与三维多孔微载体混匀悬浮培养，并每天取样计数，观测细胞增殖情况，并根据葡萄糖含量及时进行换液；
步骤C，细胞传代，待步骤B培养的载体细胞扩增至一定数量后进行三维传代或连续传代，细胞密度不低于2×106cells/mL时消化三维细胞，接种下一级生物反应器并进行培养，所述下一级生物反应器可以是同级反应器、放大反应器或缩小反应器；
所述病毒培养包括以下步骤：
病毒接种、收集、检测：待步骤b或步骤C培养的载体细胞的细胞密度不低于2×106cells/mL时进行接种病毒，并持续收毒1-5天。
在上述技术方案中，所述步骤C细胞传代包括以下步骤：
步骤C1，清洗微载体：静止待微载体沉降后，弃除上清，加入剩余微组织3倍体积的PBS，搅拌充分清洗，静置后弃上清，重复清洗1次以上以去除血清残留；
步骤C2，使用胰蛋白酶消化细胞：使用终浓度为50%的重组胰酶进行消化，在37℃45-60rpm搅拌25min-45min，用3倍浓度的AM/PI染剂染色后在显微镜下观察，待细胞80%以上脱落后结束消化，加入3倍胰酶体积的完全培养基终止消化；
步骤C3，细胞接种培养：根据计数结果接种步骤C2得到的相应体积微组织及细胞悬液接种至反应器，加入完全培养基至最终培养体积之后重复步骤B进行细胞培养。
在上述技术方案中，所述载体细胞为Vero细胞、MDCK细胞或人二倍体细胞。
在上述技术方案中，所述病毒为PEDV病毒或oHSVⅡ病毒。
在上述技术方案中，PEDV病毒接毒120h后，病毒滴度大于108TCID50/mL 。
在上述技术方案中，oHSVⅡ病毒接毒72h后，病毒滴度大于107TCID50/mL 。
在上述技术方案中，所述间歇接种的条件为40rpm搅拌5min，然后0rpm放置25min，往复循环，根据细胞贴附能力循环8-20次后调节为45-60rpm搅拌，所述接种载体细胞的接种细胞密度为2-10×105cells/mL，所述步骤b、步骤B或步骤C培养的载体细胞的培养时间为3-5天。
在上述技术方案中，所述步骤b或步骤B细胞培养的培养体系中含有M199培养基和质量分数3%的NBS、DAM-SR减血清培养基、DMEM培养基或无血清培养基。
在上述技术方案中，所述病毒培养包括以下步骤：
步骤1，清洗微载体：载体细胞处于对数生长期时，静置待微载体沉降后弃去培养基，用PBS清洗3次；
步骤2，接毒：病毒以感染复数MOI为0.01~0.5感染载体细胞；
步骤3，收毒：接毒后每6-24h进行取样收毒，持续收毒至感染的细胞全部病变。
本发明的另一方面，提供一种通过所述方法生产的病毒。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.本发明的方法利用三维多孔微载体在生物反应器中悬浮培养的方式分别培养三种动物细胞、生产两种病毒、并检测其效价，证明本方法具有普适性。本方法在较低载体用量下细胞可达到较高密度，且病毒效价远高于普通二维，收毒时间短，大大提高了生产效率，节约了能耗。并且本发明首次证明：通过与生物反应器相结合实现细胞悬浮培养，三维多孔可降解微载体比表面积更大，单位体积内细胞密度得到大幅度提高，进而提高细胞分泌产物如病毒的产量，同时可降解特性可实现细胞无损收获，收获效率更高。
2.本发明的方法通过使用多孔微载体对疫苗用细胞进行悬浮贴壁培养，在较低载体用量下可达到高细胞密度及较高病毒滴度，滴度可比传统二维提高1-2个数量级。Vero细胞可经球转球逐级放大到下一级，易于扩大生产，同时可以通过完全降解载体的方式收获细胞，进行放大生产的前期育种工作；MDCK微载体悬浮培养达到与全悬浮培养相似的细胞密度，相较于全悬浮培养能在感染病毒时减少细胞损失；应用微载体对MRC-5细胞进行大规模生产，突破目前技术挑战的限制。
3.本发明的方法可以简化操作、降低成本并提高最终细胞及病毒产量，实现了工艺创新。
附图说明
图1所示为2g/L载体密度下Vero细胞增殖情况。
图2所示为3g/L载体密度下Vero细胞增殖情况。
图3所示为4g/L载体密度下Vero细胞增殖情况。
图4所示为6g/L载体密度下Vero细胞增殖情况。
图5所示为不同血清浓度的M199培养基中Vero细胞增殖情况。
图6所示为不同血清浓度的SFM培养基中Vero细胞增殖情况。
图7所示为Vero细胞连续传代的增殖情况。
图8所示为MDCK细胞增殖曲线。
图9所示为人二倍体细胞增殖曲线。
图10所示为实施例4中Vero细胞增殖曲线。
图11所示为实施例4中接毒前和收毒时Vero细胞状态。
图12所示为实施例4中本发明方法与传统2D法生产的猪腹泻病毒滴度。
图13所示为实施例4中Vero细胞三维传代增殖曲线和猪腹泻病毒滴度。
图14所示为实施例4中本发明方法与传统2D法生产的猪腹泻病毒总产量。
图15所示为实施例5中Vero细胞增殖曲线。
图16所示为实施例5中接毒前和收毒时Vero细胞状态。
图17所示为实施例5中本发明方法与传统2D法生产的oHSVⅡ滴度。
图18所示为实施例5中Vero细胞三维传代增殖曲线和oHSVⅡ滴度。
图19所示为实施例5中本发明方法与传统2D法生产的oHSVⅡ总产量。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的三维微载体为北京华龛生物科技有限公司的3DTableTrix®疫苗用微载体V01（货号V01-100-10g）。
下述实施例中所涉及的Vero细胞培养基为上海源培生物科技股份有限公司的M199培养基（货号L640KJ），不锈钢反应器培养的培养基为天信和（苏州）生物科技有限公司的SFM培养基（货号6635005），血清为兰州民海生物工程有限公司的新生牛血清（货号SC211.02）。
下述实施例中所涉及的MARC-145细胞培养基为上海源培生物科技股份有限公司的DMEM培养基（货号L120KJ），血清为维森特的胎牛血清（货号086-150）。
下述实施例中所涉及的MDCK细胞培养基为上海源培生物科技股份有限公司的DMEM培养基（货号L120KJ），血清为兰州民海生物工程有限公司的新生牛血清（货号SC211.02）。
下述实施例中所涉及的MRC-5细胞培养基为百奥特生物科技有限公司的DAM-SR减血清培养基（货号D127C），血清为兰州民海生物工程有限公司的新生牛血清（货号SC211.02），谷氨酰胺为Gibco的L-Glutamine 200mM(200X)（货号25030-081）。
下述实施例中所涉及的生物反应器为北京华龛生物科技有限公司的3D FloTrix® miniSPIN 单通道生物反应器（以下简称转瓶）（货号FTMS1-4）和3D FloTrix®vivaSPIN 自动化生物反应器（货号FTVS05）。
在本发明的具体实施方式中，重组胰蛋白酶消化液为上海源培生物科技有限公司的Trypzyme®重组胰蛋白酶消化液（货号S342KJ, S340KV）。
在本发明的具体实施方式中，胰酶消化液为维森特的TRYPSIN/EDTA（货号325-043-EL）。
在本发明的具体实施方式中，所述活死荧光染液（AM/PI）采购于北京华龛生物科技有限公司，货号CNR002-2。
下述实施例中所涉及的细胞为本领域常见细胞，均可从商业途径得到。
实施例1
Vero细胞培养优化。
1.1 载体密度、细胞接种密度优化。
步骤a，细胞接种：待细胞扩增至足够数量时在125mL转瓶中进行小体系三维培养，三维多孔微载体密度按照2-6g/L进行配制、灭菌并置换PBS，采用间歇接种的方法接种Vero细胞，所述间歇接种的条件为40rpm搅拌5min，然后0rpm放置25min，往复循环，细胞接种密度2-10×105cells/mL，根据细胞贴附能力循环8-20次后调节为45-60rpm搅拌；
步骤b，细胞培养：Vero细胞在生物反应器中与三维多孔微载体混匀悬浮培养，并每天取样计数，观测细胞增殖情况，并根据葡萄糖含量及时进行换液；
摸索不同载体密度下适宜的细胞接种密度，培养4天细胞增殖情况如图1-4所示，载体密度需与细胞接种密度相匹配，若接种密度过低则会出现空载体影响细胞增殖。载体密度2-3g/L时，细胞接种密度2-5×105cells/mL；载体密度4g/L时，细胞接种密度3-5×105cells/mL；载体密度6g/L时，细胞接种密度5-10×105cells/mL。
1.2 培养基优化。
步骤a，细胞接种：待细胞扩增至足够数量时在125mL转瓶中进行小体系三维培养，三维多孔微载体密度按照3g/L进行配制、灭菌并置换PBS，采用间歇接种的方法接种载体细胞，所述间歇接种的条件为40rpm搅拌5min，然后0rpm放置25min，往复循环，细胞接种密度3×105cells/mL，根据细胞贴附能力循环8-20次后调节为45-60rpm搅拌；
步骤b，细胞培养：载体细胞在生物反应器中与三维多孔微载体混匀悬浮培养，并每天取样计数，观测细胞增殖情况，并根据葡萄糖含量及时进行换液；
测试不同血清浓度的M199培养基和无血清培养基(SFM)中细胞增殖情况，如图5-6所示。在基础M199培养基中最低仅添加3% 的NBS，在SFM培养基中不需添加血清即可维持细胞正常贴附及增殖。
1.3 细胞三维传代工艺。
步骤A，细胞接种：待细胞扩增至足够数量时在125mL转瓶中进行小体系三维培养，三维多孔微载体密度按照2-6g/L进行配制、灭菌并置换PBS，采用间歇接种的方法接种Vero细胞，所述间歇接种的条件为40rpm搅拌5min，然后0rpm放置25min，往复循环，细胞接种密度2-10×105cells/mL，根据细胞贴附能力循环8-20次后调节为45-60rpm搅拌；
步骤B，细胞培养：Vero细胞在生物反应器中与三维多孔微载体混匀悬浮培养，并每天取样计数，观测细胞增殖情况，并根据葡萄糖含量及时进行换液；
步骤C，细胞传代：待细胞扩增至一定数量时进行三维传代（可以是逐级放大也可以是同体系传代），在第3-5天时事先取样计数实际细胞密度，密度不低于2×106cells/mL时消化三维细胞，接种下一级生物反应器并进行二次培养，具体包括以下步骤：
步骤C1，清洗微载体：静止待微载体沉降后，尽量多的弃除上清，加入剩余微组织3倍体积的PBS打开搅拌充分清洗，静置后弃上清，以此方法清洗3次以去除血清残留。
步骤C2，TrpzymeTM重组胰蛋白酶消化细胞：使用终浓度为50%的重组胰酶进行消化，打开温度于37℃ 45-60rpm约需25min-45min，用3倍浓度的AM/PI染剂染色后在显微镜下观察，待细胞80%以上脱落后结束消化，加入3倍胰酶体积的完全培养基终止消化。
步骤C3，细胞接种：根据计数结果接种相应体积微组织及细胞悬液至下一级反应器，加入完全培养基至最终培养体积之后重复步骤B进行细胞培养。
细胞增殖曲线如图7所示，以此方法传代不影响细胞增殖，在培养第6天时Vero细胞的细胞密度可达近1×107cells/mL。
实施例2
MDCK细胞在反应器中实现高密度培养。
步骤a，三维多孔微载体密度按照8g/L进行配制、灭菌并置换PBS，采用间歇接种的方法接种MDCK细胞，所述间歇接种的条件为40rpm搅拌5min，然后0rpm放置25min，往复循环，细胞接种密度1×106cells/mL，换液程序及搅拌设计如表1所示；
步骤b，细胞培养：载体细胞在生物反应器中与三维多孔微载体混匀悬浮培养，并每天取样计数，观测细胞增殖情况，并根据葡萄糖含量及时进行换液。
细胞增殖曲线如图8所示，在培养第7天时MDCK细胞的细胞密度可达1.24×107cells/mL。
表1 MDCK细胞灌流换液工艺及搅拌设计表
实施例3
人二倍体细胞MRC5在反应器中实现高密度培养。
步骤a，将人二倍体细胞MRC5细胞复苏，待细胞扩增至足够数量时进行消化，三维多孔微载体密度按照10g/L进行配制、灭菌并置换PBS，采用间歇接种的方法接种MRC5细胞，所述间歇接种的条件为40rpm搅拌5min，然后0rpm放置25min，往复循环，细胞接种密度5×105cells/mL，换液程序及搅拌设计如表2所示，（在同一瓶中进行进出液，待葡萄糖含量低于1.5g/L时更换新灌流液）；
步骤b，细胞培养：载体细胞在生物反应器中与三维多孔微载体混匀悬浮培养，并每天取样计数，观测细胞增殖情况，并根据葡萄糖含量及时进行换液。
细胞增殖曲线如图9所示，在培养第5天时MRC5细胞的细胞密度可达6.73×106cells/mL。
表2 灌流换液工艺及搅拌设计表
实施例4
在实施例1的基础上进行PEDV病毒培养。
细胞高密度培养：步骤A，细胞接种：待细胞扩增至足够数量时在125mL转瓶中进行小体系三维培养，三维多孔微载体密度按照2g/L进行配制、灭菌并置换PBS，采用间歇接种的方法接种Vero细胞，所述间歇接种的条件为40rpm搅拌5min，然后0rpm放置25min，往复循环，细胞接种密度5×105cells/mL，根据细胞贴附能力循环8-20次后调节为45rpm搅拌；
步骤B，细胞培养：Vero细胞在生物反应器中与三维多孔微载体混匀悬浮培养，并每天取样计数，观测细胞增殖情况，并根据葡萄糖含量及时进行换液，每天根据葡萄糖含量进行换液（低于1g/L时进行换液）；
步骤C，细胞传代：待细胞扩增至一定数量时进行三维传代（可以是逐级放大也可以是同体系传代），在第3-5天时事先取样计数实际细胞密度，密度不低于2×106cells/mL时消化三维细胞，接种下一级生物反应器并进行二次培养，具体包括以下步骤：
步骤C1，清洗微载体：静止待微载体沉降后，尽量多的弃除上清，加入剩余微组织3倍体积的PBS打开搅拌充分清洗，静置后弃上清，以此方法清洗3次以去除血清残留。
步骤C2，TrpzymeTM重组胰蛋白酶消化细胞：使用终浓度为50%的重组胰酶进行消化，打开温度于37℃ 45-60rpm约需25min-45min，用3倍浓度的AM/PI染剂染色后在显微镜下观察，待细胞80%以上脱落后结束消化，加入3倍胰酶体积的完全培养基终止消化。
步骤C3，细胞接种：根据计数结果接种相应体积微组织及细胞悬液至下一级反应器，加入完全培养基至最终培养体积之后进行重复步骤B进行细胞培养。
病毒培养：培养3天细胞密度可达约2-2.5×106cells/mL。在第3天时事先取样计数实际细胞密度，计数准备接种猪腹泻病毒。
步骤1，清洗微载体：细胞处于对数生长期时，静置待微载体沉降后弃去培养基，用PBS清洗3次。
步骤2接毒：在基础培养基中添加终浓度为10µg/mL的胰酶，猪腹泻病毒MOI为0.02接毒。
步骤3收毒：接毒后每24h进行取样收毒，持续收毒至120h，检测病毒滴度。
细胞增殖曲线如图10所示，Vero细胞接种PEDV后仍有小幅增长，之后逐渐下降，直到第五天基本完全从载体上脱落。如图11所示，为细胞接毒前后细胞贴附、脱落情况，本方法和2D产毒滴度峰值均为细胞未完全脱落时，如图12所示，本发明的方法收获的病毒滴度可达二维的120倍，如图13所示，三维连续传代后不影响产毒，滴度仍可达到108TCID50/mL，如图14所示，本方法的总产毒量是传统2D法的27倍。
实施例5
在实施例1的基础上进行oHSVⅡ病毒培养。
细胞高密度培养：步骤A，细胞接种：待细胞扩增至足够数量时在125mL转瓶中进行小体系三维培养，三维多孔微载体密度按照2g/L进行配制、灭菌并置换PBS，采用间歇接种的方法接种Vero细胞，所述间歇接种的条件为40rpm搅拌5min，然后0rpm放置25min，往复循环，细胞接种密度5×105cells/mL，根据细胞贴附能力循环8-20次后调节为45rpm搅拌；
步骤B，细胞培养：Vero细胞在生物反应器中与三维多孔微载体混匀悬浮培养，并每天取样计数，观测细胞增殖情况，并根据葡萄糖含量及时进行换液，每天根据葡萄糖含量进行换液（低于1g/L时进行换液）；
步骤C，细胞传代：待步骤B细胞扩增至一定数量时进行三维传代（可以是逐级放大也可以是同体系传代），在第3-5天时事先取样计数实际细胞密度，密度不低于2×106cells/mL时消化三维细胞，接种下一级生物反应器并进行二次培养，具体包括以下步骤；
步骤C1，清洗微载体：静止待微载体沉降后，尽量多的弃除上清，加入剩余微组织3倍体积的PBS打开搅拌充分清洗，静置后弃上清，以此方法清洗3次以去除血清残留。
步骤C2，TrpzymeTM重组胰蛋白酶消化细胞：使用终浓度为50%的重组胰酶进行消化，打开温度于37℃ 45-60rpm约需25min-45min，用3倍浓度的AM/PI染剂染色后在显微镜下观察，待细胞80%以上脱落后结束消化，加入3倍胰酶体积的完全培养基终止消化。
步骤C3，细胞二次接种：根据计数结果接种相应体积微组织及细胞悬液至下一级反应器，加入完全培养基至最终培养体积之后重复步骤B进行细胞培养。
病毒培养：培养4天细胞密度可达约2.6-3.4×106cells/mL。在第4天时事先取样计数实际细胞密度，计数准备接种oHSVⅡ；
步骤1，清洗微载体：细胞处于对数生长期时，静置待微载体沉降后弃去培养基，用PBS清洗3次。
步骤2，接毒：以oHSVⅡ的感染复数MOI 0.01-0.05感染Vero细胞。
步骤3，收毒：接毒后每24h进行取样收毒，持续收毒至72h，感染的细胞全部病变为标准，之后检测病毒滴度。
细胞增殖曲线如图15所示，Vero细胞接种oHSVⅡ后细胞开始脱落，直到第四天基本完全从载体上脱落，如图16所示，为细胞接毒前后随时间变化细胞贴附、脱落情况，本专利方法培养收获的病毒滴度与二维对照如图17所示，相同MOI情况下，本专利方法培养的病毒滴度均高于2D，培养收获的病毒滴度可达二维的15.9倍，如图18所示三维连续传代后不影响oHSVⅡ滴度，均在108TCID50/mL以上，反应器中HSV滴度最高为108.7TCID50/mL，通过补液维持细胞处于最佳的生长条件可以有效提高病毒产量，如图19所示本方法的总产毒量是传统2D法的100倍。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种三维多孔微载体悬浮培养细胞生产病毒的方法，其特征在于，包括细胞高密度培养和病毒培养，所述细胞高密度培养包括以下步骤：
步骤a，细胞接种：三维多孔微载体密度按照2-10g/L进行配制，采用间歇接种的方法接种载体细胞；
步骤b，细胞培养：载体细胞在生物反应器中与三维多孔微载体混匀悬浮培养；
或者，所述细胞高密度培养包括以下步骤：
步骤A，细胞接种：三维多孔微载体密度按照2-10g/L进行配制，采用间歇接种的方法接种载体细胞；
步骤B，细胞培养：载体细胞在生物反应器中与三维多孔微载体混匀悬浮培养；
步骤C，细胞传代，待步骤B培养的载体细胞扩增至一定数量后进行三维传代，当细胞密度不低于2×106cells/mL时消化三维细胞，接种生物反应器并进行培养或继续连续传代培养；
所述病毒培养包括以下步骤：
病毒接种、收集、检测：待步骤b或步骤C培养的载体细胞的细胞密度不低于2×106cells/mL时进行接种病毒，并持续收毒1-5天；
所述载体细胞为Vero细胞、MDCK细胞或人二倍体细胞；
所述接种载体细胞的接种细胞密度为2-10×105cells/mL；
所述步骤b、步骤B或步骤C培养的载体细胞的培养时间为3-5天。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤C细胞传代包括以下步骤：
步骤C1，清洗微载体：静止待微载体沉降后，弃除上清，加入剩余微组织3倍体积的PBS，搅拌充分清洗，静置后弃上清，重复清洗1次以上以去除血清残留；
步骤C2，使用胰蛋白酶消化细胞：使用终浓度为50%的重组胰酶进行消化，在37℃ 45-60rpm搅拌25min-45min，用3倍浓度的AM/PI染剂染色后在显微镜下观察，待细胞80%以上脱落后结束消化，加入3倍胰酶体积的完全培养基终止消化；
步骤C3，细胞接种培养：根据计数结果接种步骤C2得到的相应体积微组织及细胞悬液接种至反应器，加入完全培养基至最终培养体积之后重复步骤B进行细胞培养。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒为PEDV病毒或oHSVⅡ病毒。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，PEDV病毒接毒120h后，病毒滴度大于108TCID50/mL 。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，oHSVⅡ病毒接毒72h后，病毒滴度大于108TCID50/mL。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间歇接种的条件为40rpm搅拌5min，然后0rpm放置25min，往复循环，根据细胞贴附能力循环8-20次后调节为45-60rpm搅拌。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b或步骤B细胞培养的培养体系中含有M199培养基和质量分数3%的NBS、DAM-SR减血清培养基、DMEM培养基或无血清培养基。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述病毒培养包括以下步骤：
步骤1，清洗微载体：载体细胞处于对数生长期时，静置待微载体沉降后弃去培养基，用PBS清洗3次；
步骤2，接毒：病毒以感染复数MOI为0.01~0.5感染载体细胞；
步骤3，收毒：接毒后每6-24h进行取样收毒，持续收毒至感染的细胞全部病变。
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