CN113373107B

CN113373107B - 一种大规模制备传代鸡胚细胞生产病毒的方法

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Publication number: CN113373107B
Application number: CN202110126787.6A
Authority: CN
Inventors: 朱为; 张林亚; 周旭
Original assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Current assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Priority date: 2021-01-29
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2041-01-29
Also published as: CN113373107A

Abstract

本发明提供了一种大规模制备传代鸡胚细胞生产病毒的方法。具体地，本发明提供了一种在无二氧化碳或低二氧化碳条件下，连续传代培养鸡胚细胞生产病毒类产品的方法。本发明的方法简单高效，可以在无二氧化碳或低二氧化碳下实现原代鸡胚细胞的连续传代，尤其适用于在多层细胞工厂中大规模制备传代鸡胚细胞，进而实现病毒类产品的规模化生产。

Description

一种大规模制备传代鸡胚细胞生产病毒的方法

技术领域

本发明涉及病毒类疫苗和制剂领域，尤其涉及利用传代鸡胚细胞生产病毒性疫苗和治疗性病毒制剂的生产方法。

背景技术

疫苗是预防与控制传染性疾病的有效手段，已有多种病毒性疫苗研制成功，如麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗等。病毒性疫苗包括减毒活疫苗、灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗。近年来，利用病毒进行基因治疗和肿瘤治疗(如溶瘤病毒)也取得进展。病毒是专性细胞内生物，必须在细胞内进行复制和包装。病毒的生产离不开细胞基质，主要包括3类，人二倍体细胞株、原代细胞和连续传代细胞系。

原代细胞直接来源于动物组织或胚胎，包括地鼠肾、猴肾、兔肾、牛肾、鸡胚、鹌鹑胚等。原代细胞来源容易，属正常细胞，无致瘤性，用于疫苗生产已超过40年。原代细胞经原始培养或传代少数几代内(一般不超过5代)的细胞被允许用于病毒类产品的生产。例如，目前国内疫苗生产多采用原始培养的细胞。

然而，传统的麻疹疫苗或腮腺炎疫苗等采用原代鸡胚细胞通过单层细胞培养瓶或多层细胞工厂生产，需要处理大量的鸡胚。这一方法限制了单批可操作的数量，人工劳动强度大，污染风险高，而且来自不同个体和批次的鸡胚细胞质量和敏感性也存在差异。虽然将原代鸡胚细胞直接接种到细胞工厂，可以在一定程度上解决转瓶和单层细胞培养瓶劳动强度大、污染风险高的问题，但仍需要处理大量的鸡胚，无法解决前期细胞制备过程繁琐费时、污染风险高的问题，也无法解决细胞均一性差和批间差异大的问题。

此外，细胞扩增常用的培养介质包括转瓶、单层细胞培养瓶和多层细胞工厂。细胞培养和接种病毒后，需要充分的营养物质、适当的pH和良好的气体供应，才能维持细胞的生长和病毒的增殖。细胞通常在2％～10％二氧化碳浓度的培养箱中培养才能优良生长。在大规模生产时，为多层细胞工厂提供二氧化碳培养条件，不但增加成本，还存在高压二氧化碳钢瓶的安全性风险和断气风险。在非强制通气条件下，多层细胞工厂的气体交换不佳，需要专门的培养装置保证二氧化碳供应，进一步增加生产成本。因此，无需二氧化碳的培养条件，是最为简单易行的培养方式，适宜于大规模生产。

综上所述，本领域迫切需要开发一种适合工业化生产、污染风险低、简单高效的原代鸡胚细胞传代培养生产病毒类产品的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种适合工业化生产、污染风险低、简单高效的原代鸡胚细胞传代培养生产病毒类产品(如病毒疫苗、治疗类病毒产品，包括重组病毒)的方法。

本发明的传代培养原代鸡胚细胞提供了一种高效的病毒性疫苗规模化的生产平台。

本发明提供了一种在无二氧化碳或低二氧化碳条件下传代培养原代鸡胚细胞的培养液。

在本发明的第一方面，提供了一种动物细胞传代培养的方法，所述方法包括步骤：

(S1)提供一原代动物细胞P0；

(S2)将所述的原代动物细胞P0，在浓度C0的二氧化碳条件下，在细胞培养液中进行传代培养，从而获得第n代的传代细胞Pn，其中n为传代次数；

其中，所述培养液包含基础培养液和强化添加物，所述强化添加物包括：

(1)亚油酸或其盐；较佳地亚油酸钠；

(2)硒元素；较佳地，亚硒酸或亚硒酸盐；更佳地，亚硒酸钠；

(3)钒元素，较佳地，偏钒酸铵；和

(4)硫辛酸。

在另一优选例中，所述强化添加物由组分(1)-(4)构成。

在另一优选例中，所述的n为选自1～40的任一正整数，较佳地n为2～20，更佳地n为3～6、或6～10。

在另一优选例中，所述传代培养是连续传代培养。

在另一优选例中，在步骤(S2)中，二氧化碳的浓度C0≤1％(v/v)，较佳地≤0.05％(v/v)，更佳地为≤0.04(v/v)或为0％(v/v)。

在另一优选例中，所述细胞来源于哺乳动物或非哺乳动物(如禽类)。

在另一优选例中，所述细胞来源于：地鼠、猴、兔、牛、羊、鸡、鹌鹑或其组合。

在另一优选例中，所述细胞来源于动物组织或胚胎，较佳地，选自鸡胚、鹌鹑胚、地鼠肾、猴肾、兔肾、牛肾。

在另一优选例中，所述细胞选自下组：鸡胚细胞、牛肾细胞、地鼠肾细胞、猴肾细胞、兔肾细胞，更佳地，选自鸡胚细胞。

在另一优选例中，在步骤(S2)中，所述培养液包含基础培养液和强化添加物。

在另一优选例中，所述强化添加物包括：

(1)亚油酸或其盐；较佳地亚油酸钠；

(3)钒元素，较佳地，偏钒酸铵；和

(4)硫辛酸。

在另一优选例中，所述强化添加物由组分(1)-(4)构成。

在另一优选例中，所述强化添加物含有以下成分：

(1)亚油酸或其盐(如亚油酸钠)，浓度为1×10^-4～5×10^-4mM；

(2)硒元素，浓度为3×10^-6～5×10^-5mM；

(3)钒元素，浓度为1×10^-8～5×10^-6mM；和

(4)硫辛酸，浓度为5×10^-6～1.5×10^-5mM。

在另一优选例中，所述强化添加物含有以下成分：

(1)亚油酸或其盐(如亚油酸钠)，浓度为2×10^-4～4×10^-4mM；

(2)硒元素，浓度为4×10^-6～3×10^-5mM；

(3)钒元素，浓度为4×10^-8～5×10^-6mM；和

(4)硫辛酸，浓度为8×10^-6～1.2×10^-5mM。

在另一优选例中，所述的强化添加物中，硒元素来自有机化合物或无机化合物，较佳地来自亚硒酸或亚硒酸盐(如亚硒酸钠)。

在另一优选例中，所述的强化添加物中，钒元素来自有机化合物或无机化合物，较佳地来自偏钒酸铵。

在另一优选例中，所述培养液选自：基础培养液、无蛋白培养液、或化学成分确定的培养液。

在另一优选例中，所述基础培养液选自M199、MEM、DMEM、RPMI 1640、F10、F12培养液。

在另一优选例中，所述基础培养液选自M199或MEM培养液。

在另一优选例中，所述培养液中添加或不添加血清。

在另一优选例中，所述添加血清的含量为5％～15％(v/v)，优选8～10％(v/v)。

在另一优选例中，所述血清选自下组：胎牛血清、小牛血清、或成牛血清。

在另一优选例中，所述血清为胎牛血清。

在另一优选例中，所述血清为小牛血清，优选为新生牛血清。

在另一优选例中，所述细胞培养介质选自：培养瓶、培养板、细胞工厂、微粒(微载体)、片状载体、固定床或其组合。

在另一优选例中，所述培养瓶选自：T型细胞培养瓶、转瓶。

在另一优选例中，所述细胞工厂为1～40层细胞工厂，优选为10～40层细胞工厂。

在另一优选例中，所述的传代细胞具有选自下组的一个或多个特征：

(i)细胞呈梭状纤维样(成纤维细胞)；

(ii)细胞形态饱满；

(iii)细胞生长状态稳定；

(iv)细胞无成瘤性；

(v)细胞染色体数目不变。

在另一优选例中，所述步骤(S1)中，原代细胞培养2～4天，较佳地2～3天，更佳地2天。

在另一优选例中，所述步骤(S2)中，原代细胞的接种密度范围选自0.1×10⁵～1.0×10⁶个/cm²，较佳地为0.5×10⁵～4.0×10⁵/cm²，更佳地为2.0×10⁵～3.0×10⁵个/cm²。

在另一优选例中，所述步骤(S2)中，第一传代细胞(即P1)的接种密度选自0.2×10⁵～0.8×10⁵个/cm²，优选为0.3×10⁵～0.5×10⁵个/cm²。

在另一优选例中，所述步骤(S2)中，传代细胞Pn的传代比例为1:2～1:4，优选为1:2～1:3，更优选为1:2。

在另一优选例中，所述步骤(S2)中，传代细胞Pn培养2～5天，较佳地3～5天，更佳地3～4天。

在本发明的第二方面，提供了一种传代动物细胞，所述动物细胞通过本发明的第一方面所述的方法传代培养得到的。

在另一优选例中，所述的传代动物细胞为上皮细胞，并且具有选自下组的一个或多个特征：

(i)细胞呈铺路石形；

(ii)细胞形态饱满；

(iii)细胞生长状态稳定；

(iv)细胞无成瘤性；

(v)细胞染色体数目不变。

在本发明的第三方面，提供了一种用于无二氧化碳或低二氧化碳条件下传代培养动物细胞的培养基，所述培养液包含基础培养基和强化添加物；

其中所述强化添加物包括：

(1)亚油酸或其盐；较佳地，亚油酸钠；

(3)钒元素；较佳地，偏钒酸铵；和

(4)硫辛酸。

在另一优选例中，所述二氧化碳的浓度C0≤1％(v/v)，较佳地≤0.05％(v/v)，更佳地为≤0.04(v/v)或为0％(v/v)。

在另一优选例中，所述培养基为液态。

在另一优选例中，所述强化添加物包括：

(1)亚油酸或其盐(如亚油酸钠)，浓度为1×10^-4～5×10^-4mM；

(2)硒元素，浓度为3×10^-6～5×10^-5mM；

(3)钒元素，浓度为1×10^-8～5×10^-6mM；和

(4)硫辛酸，浓度为5×10^-6～1.5×10^-5mM。

在本发明第四方面，提供了一种制备本发明的第三方面所述的用于无二氧化碳或低二氧化碳条件下传代培养动物细胞的培养基，包括步骤：

(a)提供一基础培养基或其组成组分，并与强化添加物混合，从而制得所述的培养液，

其中，所述强化添加物包括：

(1)亚油酸或其盐；较佳地，亚油酸钠；

(3)钒元素；较佳地，偏钒酸铵；和

(4)硫辛酸。

在另一优选例中，所述的传代培养动物细胞的培养基为液态或固态(如干粉)。

在另一优选例中，所述的混合包括在培养之前进行预混。

在另一优选例中，所述的混合包括在培养时现场(on-site)混合。

在本发明第五方面，提供了一种本发明的第二方面的传代动物细胞的用途，用于生产病毒类产品。

在另一优选例中，所述病毒类产品为人用和/或兽用。

在另一优选例中，所述病毒类产品包括病毒疫苗、重组病毒制品、治疗性病毒产品。

在另一优选例中，所述病毒疫苗包括减毒活疫苗、灭活疫苗。

在另一优选例中，所述病毒疫苗选自：麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、狂犬病疫苗、流感疫苗、黄热病疫苗、鸡传染性法氏囊病疫苗、新城疫疫苗、马立克氏病疫苗、禽流感疫苗、腺病毒疫苗、重组腺病毒载体疫苗、重组麻疹病毒载体疫苗、重组流感病毒载体疫苗、重组禽流感病毒载体疫苗。

在另一优选例中，所述重组病毒制品选自下组：重组腺病毒载体基因治疗制品、重组溶瘤麻疹病毒制品。

在本发明的第六方面，提供了一种病毒的培养方法，包括步骤：

(1)在培养介质中，提供一如本发明的第二方面所述的传代细胞；

(2)用病毒感染(1)中的传代细胞，培养并收集，得到扩增的目的病毒收获液。

在另一优选例中，所述病毒选自下组：麻疹病毒、腮腺炎病毒、狂犬病病毒或其组合。

在另一优选例中，所述步骤(2)中还包括：

(2.1)用所述病毒感染细胞并培养，洗涤细胞后，更换不含血清的基础培养液，添加病毒保护剂，收集培养液为病毒收获液。

在另一优选例中，所述培养介质选自1～40层细胞工厂，优选2～40层细胞工厂，更优选10～40层细胞工厂。

在另一优选例中，所述传代细胞选自P2～P5代细胞。

在另一优选例中，所述病毒的感染复数(病毒数量：细胞数量)为0.0001～1，较佳地，0.0005～0.5，更佳地，0.001～0.2。

在另一优选例中，步骤(2.1)中，所述洗涤通过PBS进行洗涤。

在另一优选例中，步骤(2.1)中，所述病毒保护剂为人血白蛋白。

在另一优选例中，步骤(2.1)中，所述病毒保护剂的终浓度(v/v)为0.01％～5％，较佳地，0.1％～1％，更佳地，0.4％～0.6％。

在另一优选例中，步骤(2.1)中，所述病毒收获液为一次或多次收获液。

在另一优选例中，步骤(2.1)中，病毒的培养时间为2～8天。

在另一优选例中，所述病毒为麻疹病毒，且步骤(2)具有一个或多个下述特征：

(a)所述病毒保护剂的终浓度(w/v)为0.01％～5％，较佳地，0.1％～1％，更佳地，0.4％～0.6％；

(b)所述病毒的感染复数为0.001～1，较佳地，0.005～0.5，更佳地，0.02～0.2；

在另一优选例中，所述生产的麻疹病毒滴度范围为5.0～6.5lg CCID₅₀/ml。

在另一优选例中，所述病毒为腮腺炎病毒，且步骤(2)具有一个或多个下述特征：

(a)所述病毒保护剂的终浓度(w/v)为0.01％～5％，较佳地，0.1％～1％，更佳地，0.4％～0.6％。

(b)所述病毒的感染复数为0.0001～1，较佳地，0.0005～0.1，更佳地，0.001～0.05。

在另一优选例中，所述生产的腮腺炎病毒滴度范围为5.0～7.5lg CCID₅₀/ml。

在本发明的第七方面，提供了一种病毒疫苗的制备方法，包括步骤：

(1)提供一如本发明的第二方面所述的传代细胞；

(2)用病毒感染(1)中的传代细胞，培养并收集，得到扩增的目的病毒收获液；

(3)将步骤(2)所得病毒收获液纯化后配制成疫苗。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(4)将步骤(2)所得病毒进行纯化、灭活后配制成疫苗。

在另一优选例中，所述本发明的方法、用途为体外、非治疗性的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了原代鸡胚细胞(P0代细胞)的形态。

图2显示了采用M199培养液(无强化添加物)和5％二氧化碳培养条件时，鸡胚细胞在T150瓶连续传代的细胞形态，其中P1、P3、P5和P10分别表示第1、3、5、10代的细胞，在10×物镜下观测。

图3显示了采用M199培养液和无二氧化碳培养条件时，鸡胚细胞在T150瓶连续传代的细胞形态。其中，A、D为对照组，即在含Earle盐的M199培养液和5％二氧化碳下培养的细胞形态；B、E为在含Hanks盐的M199培养液中，无二氧化碳下培养的细胞形态；C、F为在含Earle盐的M199培养液中，无二氧化碳下培养的细胞形态。A、B、C为10×物镜下观测图，D、E、F为40×物镜下观测图。

图4显示了采用强化M199培养液(含强化添加物)时，鸡胚细胞连续传代各代次的细胞密度和倍增数。其中，A为试验组，采用强化M199培养液(含强化添加物)在无二氧化碳条件下培养。B为对照组1，采用M199培养液(不含强化添加物)在5％二氧化碳条件下培养。C为对照组2，采用M199培养液(不含强化添加物)在无二氧化碳条件(0％)下培养。

图5显示了采用强化MEM培养液传代培养鸡胚细胞的形态和各代次收获的细胞密度和倍增数。其中，A为采用强化MEM培养液传代培养时鸡胚细胞的形态，P1、P5、P10和P15分别表示第1、5、10、15代的细胞；B显示了各代次收获的细胞密度和倍增数。

图6显示了不同代次鸡胚细胞制备的麻疹病毒收获液滴度。其中，1为第一次病毒收获液，2为第二次病毒收获液。

图7显示了不同代次鸡胚细胞制备的腮腺炎病毒收获液滴度。其中，P0和P5分别表示原代和第5代的细胞。

图8显示了裸鼠注射A549细胞、MRC-5细胞和第8代鸡胚细胞的注射部位组织病理切片。其中，A为阳性对照组A549细胞，B为阴性对照组MRC-5细胞，C为实验组第8代鸡胚细胞。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了鸡胚细胞在无二氧化碳或低二氧化碳下连续传代的方法。具体地，本发明人通过添加强化添加物，优化特别适合原代鸡胚细胞(或其传代鸡胚细胞)的培养液，提供了将原代鸡胚细胞进行连续传代、适用于无二氧化碳或低二氧化碳的下培养的技术。在此基础上完成了本发明。

实验表明，本发明的方法培养时间短、操作简单、成本低，细胞生长稳定。此外，通过使用传代的鸡胚细胞，大幅降低鸡胚的使用量，提高了生产用细胞的均一性。

术语说明

除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文所用，术语“本发明的细胞”、“本发明的传代鸡胚细胞”、“本发明的鸡胚细胞”可互换使用，指通过本发明第一方面的原代鸡胚细胞传代培养的方法培养的鸡胚细胞。

强化添加物和强化培养液

本发明提供了一种细胞培养液和强化添加物配方。在细胞传代培养阶段，细胞培养液采用市售M199和MEM等作为基础培养液，添加牛血清，添加强化添加物。

典型地，本发明的强化添加物包括亚油酸或亚油酸钠、亚硒酸或亚硒酸钠、偏钒酸铵和硫辛酸，以及Cu²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺等无机盐。

在本发明中，细胞培养液的基础培养液采用M199和MEM，优选M199。

细胞培养阶段添加5％～15％牛血清(v/v)，优选10％，优选胎牛血清，更优选新生牛血清。

基础培养液可以是预先配制好的液体，也可以是干粉。强化添加物可添加在基础培养液干粉中，也可配制好液体基础培养液后添加。

在另一优选例中，配制好的细胞培养液中，强化添加物(见表A)包含：优选的亚油酸或亚油酸钠、亚硒酸或亚硒酸钠、偏钒酸铵和硫辛酸的含量分别为1×10^-4～5×10^-4mM、3×10^-6～5×10^-5mM、1×10^-8～5×10^-6mM和5×10^-6～1.5×10^-5mM，更优选地分别为2×10^-4～4×10^-4mM、4×10^-6～3×10^-5mM、4×10^-8～5×10^-6mM和8×10^-6～1.2×10^-5mM。

表A.

在本发明中，虽然在接种病毒后仍可采用本发明的培养液，但也可采用低血清和不添加强化添加剂的培养液。例如，在接种病毒后，将培养液中的牛血清含量降为1％～2％(v/v)，并且不添加强化添加物。

原代细胞及其传代细胞

应理解，本发明的原代细胞可以选自来源于哺乳动物或非哺乳动物(如禽类)的动物细胞。例如，来源于地鼠、猴、兔、牛、羊、鸡、鹌鹑的组织或胚胎。较佳地，本发明的培养基和培养方法适用于选自下组的细胞：牛肾细胞、地鼠肾细胞、猴肾细胞、兔肾细胞、鸡胚细胞。

一种优选的原代细胞来源于原代鸡胚细胞。通过本发明提供的含有强化添加物的培养液，在无二氧化碳或低二氧化碳条件下，培养原代细胞，获得的传代鸡胚细胞具有选自下组的一个或多个特征：

(i)细胞呈梭状纤维样(成纤维细胞)；

(ii)细胞形态饱满；

(iii)细胞生长状态稳定；

(iv)细胞无成瘤性；

(v)细胞染色体数目不变。

本发明的传代细胞具备原代细胞类似的性质，制备的病毒与原代细胞制备的病毒，其滴度水平相当，病毒的基因序列无差异。

在本发明一具体实施例中，将原代细胞传代5代内，用于病毒类(例如腮腺炎病毒、麻疹病毒)产品生产，获得的病毒收获液质量好，有利于病毒类产品的工业化生产。

培养工艺

本发明的培养基和培养方法特别适合用于大规模制备用于病毒生产的传代细胞，尤其是利用原代细胞来大规模制备传代次数为1～40，较佳地2～20的传代细胞。应理解，在本发明中，对于生产设备和方式没有特别限制，例如可用于培养瓶、培养板(如,单层或多层培养板)、细胞工厂、微粒(微载体)、片状载体、固定床、或其组合。

一种优选的生产方式是采用细胞工厂工艺。细胞工厂工艺是一种规模化细胞培养工艺，解决了传统细胞培养瓶或转瓶培养占地面积大、污染风险高、瓶间/批间差异大的问题。

在本发明中，优选采用自动化和标准化的操作工艺，从而进一步提高疫苗生产的可控性，保证疫苗生产的无菌过程和疫苗质量的稳定性和安全性。

二氧化碳培养

本发明人出乎意料地发现，通常用于原代鸡胚细胞培养的细胞培养液，在进行传代培养时需要二氧化碳条件，并不适用于在细胞工厂中的连续传代。

通过优化细胞培养液，可以在极低浓度二氧化碳或无二氧化碳培养条件下，实现原代鸡胚细胞的连续传代，尤其适用于在多层细胞工厂中大规模制备传代鸡胚细胞，实现病毒类产品的规模化生产。

本发明人研究表明，采用无二氧化碳的培养条件，一方面是极为简单易行的培养方式，另一方面特别适宜于大规模生产传代细胞。

以鸡胚细胞为例，原代鸡胚组织经胰蛋白酶消化后，可以直接接种到细胞转瓶、细胞培养瓶和多层细胞工厂，同时或经培养后接种病毒，生产疫苗。实验发现，将上述培养的原代细胞再次经胰蛋白酶消化后，转接至新的细胞培养瓶或多层细胞工厂，在二氧化碳培养条件下进行培养，细胞生长良好，并可连续传代，可以用于生产病毒。但是，如果没有二氧化碳条件，细胞一般只能传一代；继续传代，细胞往往只能贴壁，不能生长，即使细胞能生长，也会发生形态改变。

应理解，在培养条件下，二氧化碳的浓度C0应显著低于常规的培养浓度(5％)，此外只要有利于本发明中细胞的生长，没有特别的限制，因此通常可在0～1％(v/v)。

典型地，在本发明中，所述的“无二氧化碳或低二氧化碳”的培养条件，是指在培养条件中，二氧化碳的浓度C0≤1％(v/v)，较佳地≤0.05％(v/v)，更佳地为≤0.04％(v/v)或为0％(v/v)(按供气或培养容器中的气体体积计)。

通常地，采用细胞培养箱或生物反应器中培养细胞时，二氧化碳浓度系指通过管道、钢瓶等路径(即强制通气)，通入二氧化碳并达到设定的浓度，一般设为2％～10％，最常设置为5％。

如本文所用，“无二氧化碳”、“低二氧化碳”、“封闭”的培养条件，指不向细胞培养容器中额外地通入二氧化碳(例如，通过管道、钢瓶等路径)，在细胞培养箱、细胞培养瓶、细胞工厂、细胞生物反应器等培养介质中培养细胞。应理解，在如本文所用的“无二氧化碳”、“低二氧化碳”、“封闭”的培养条件下，细胞培养容器中仍然可以存在大气浓度的二氧化碳(大气二氧化碳浓度约为0.03～0.04％)。

采用本发明所述强化培养基，将细胞在细胞培养箱、一般的生化孵箱、恒温房间进行培养时，无需额外通入二氧化碳，利用大气(使用透气盖)、或完全封闭培养介质，即可实现细胞的传代培养。

滴度

如本文所用，CCID₅₀(cell culture infective dose 50％)为细胞培养半数感染量，即指能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变(cytopathic effect,CPE)的病毒量，用于检测病毒滴度。

应用

具体地，本发明的方法可通过传代细胞高效制备病毒，制备的病毒与原代细胞制备的病毒滴度水平相当或更高，病毒的基因序列无差异。基于此技术可生产病毒类产品如减毒活疫苗、灭活疫苗和病毒类治疗制剂，用于病毒性传染病的预防、基因治疗和肿瘤治疗。

在本发明中，麻疹和腮腺炎减毒活疫苗的实验证明，采用本发明方法连续传代所生产的细胞生产疫苗，病毒滴度与原代细胞相似或优于原代细胞。收获的病毒，经基因测序，重要的病毒基因未发生改变。对传代培养的第8代鸡胚细胞进行成瘤性检查，结果为阴性，未见成瘤。染色体检查显示，第5代和第9代的鸡胚细胞，保持染色体数目不变。因此，本发明的原代鸡胚细胞连续传代后，可应用于病毒类产品的生产，例如人用病毒性疫苗：麻疹减毒活疫苗、腮腺炎减毒活疫苗、黄热减毒活疫苗、狂犬病疫苗等。

生产病毒疫苗的方法

本发明提供一种病毒疫苗的制备方法，包括步骤：

(1)提供一种如本发明第一方面所述的传代细胞Pn；

(2)用所述病毒感染细胞，在含血清培养液中扩增，洗涤细胞后，更换不含血清的基础培养液，添加病毒保护剂，收集培养液为病毒收获液；

在另一优选例中，所述方法还包括步骤；

(3)将步骤(2)所得病毒进行纯化、灭活后配制成疫苗。

在一个具体实施例中，所生产的病毒疫苗包括麻疹减毒活疫苗及腮腺炎减毒活疫苗。

本发明提供了一种病毒接种与收获模式。优选细胞传代培养呈致密状态时接种病毒，收获病毒前用PBS洗涤细胞，然后换用不含牛血清的基础培养液继续培养并收获病毒，其中PBS洗涤细胞后换用的基础培养液中可加人血白蛋白作为病毒保护剂。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明的传代培养原代鸡胚细胞提供了一种高效的病毒类产品(如病毒性疫苗)规模化的生产平台。

(2)本发明的减毒活疫苗(人用和兽用)、灭活疫苗、治疗性病毒产品的生产方法高效稳定。

(3)本发明的疫苗生产方法具有可控性，保证疫苗生产的无菌过程和疫苗质量的稳定性和安全性。

(4)本发明的生产方法大幅降低鸡胚的使用量，提高了生产用细胞的均一性。

(5)本发明的生产方法显著提高细胞制备效率以及细胞和病毒产品的安全性，显著降低人工劳动强度、减少鸡胚需求。

(6)本发明的培养条件，容易实现原代细胞的良好传代培养，且不改变其病毒敏感性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1原代鸡胚细胞的制备与培养

选择9～11日龄发育良好的SPF鸡胚蛋，清洗消毒后解剖，收获躯干部，用无菌眼科手术剪刀反复剪碎，用欧氏液洗涤2次，取沉淀。每只鸡胚加入4mL0.25％胰酶，于37℃水浴消化20min。消化结束后小心倒去上清消化液，用欧氏液洗涤消化后的细胞2次，加入细胞培养液重悬(约40mL/胚)。摇匀后静置，收上层细胞悬液，再次用细胞培养液重悬收集1次。用细胞培养液调节细胞密度，接种到细胞培养瓶或细胞工厂，于36±1℃培养2～3天，即为原代鸡胚成纤维细胞(以下简称P0)，可用于传代或接种病毒。细胞培养液为含10％新生牛血清的M199，培养介质为T150细胞培养瓶。

图1是显微镜下观察的原代鸡胚细胞(P0代细胞)。P0代细胞成纤维状，其中混杂少量多角形的上皮细胞。

实施例2采用M199培养液在T150细胞瓶中进行鸡胚细胞的传代培养

采用含10％新生牛血清的M199作为细胞培养液，以T150细胞瓶为培养介质。分别在5％二氧化碳和无二氧化碳的培养条件下，从P0代细胞进行连续传代培养，观察细胞生长情况。

制备P0代细胞，按(2.0～4.0)×10⁵个/cm²密度接种T150瓶，分别放置于含5％二氧化碳的培养箱、或旋紧瓶盖放置于无二氧化碳的培养箱，于36±1℃培养2～3天，至细胞成致密状态。

弃去培养液，加入适量0.25％胰酶消化；待细胞圆缩，加入新的细胞培养液终止，轻轻吹打均匀。按照(0.3～0.6)×10⁵个/cm²密度接种至T150细胞瓶，分别放置于5％二氧化碳的培养箱、或旋紧瓶盖放置于无二氧化碳相应培养箱中培养，至细胞呈致密状态。细胞代次为第1代，记为P1代细胞。

同上，进行细胞消化，按照细胞密度(0.3～0.6)×10⁵个/cm²或分种率1:2～1:4，接种到T150细胞瓶后培养至致密状态，记为P2代细胞。后续同样连续传代。每传一代，细胞代次增加1代。对各代次细胞在显微镜下观察细胞形态，测定细胞密度。

图2是采用M199培养液和在5％二氧化碳条件下，鸡胚细胞在T150瓶连续传代培养时的P1、P3、P5和P10代的细胞形态。在5％二氧化碳培养条件下，细胞在T150瓶中可在3～4天长成致密状态，细胞成典型成纤维状，形态修长饱满；将细胞连续传代至第10代，形态无差异，传代时细胞平均倍增数为2倍。

图3是采用M199培养液和无二氧化碳条件下，鸡胚细胞在T150瓶连续传代培养时的细胞形态。对照组(图3A和图3D)采用M199培养液和5％二氧化碳条件，细胞形态正常。采用含Hanks盐的M199培养液和无二氧化碳条件时，细胞传至P3代，细胞内出现空泡，形态皱缩，排列紊乱(图3B和图3E)；继续传代，细胞形态更加不良。在无二氧化碳封闭培养条件下，采用含Earle盐的M199培养液，细胞传至P2代时，细胞不能长成致密单层；显微镜下观察，可见细胞内部出现空泡、黑点，形态发生改变(图3C和图3F)。

实验结果表明，采用市售M199作为基础培养液，添加10％新生牛血清，在5％二氧化碳条件下可以连续传代。但是，在无二氧化碳培养条件下，细胞只能在T型细胞瓶中传1～2代，继续传代，细胞不能长成致密状态；或细胞虽可传代，但形态发生改变，不宜用于病毒培养。

实施例3采用M199培养液在细胞工厂中进行鸡胚细胞的传代培养

采用含10％新生牛血清的M199作为细胞培养液，以4层细胞工厂为培养介质，在5％二氧化碳培养条件下，从P0代细胞进行连续传代培养。

同实施例2方法在T225瓶中培养P0代细胞，放置于含5％二氧化碳的培养箱，于36±1℃培养2天。消化P0代细胞，按照(2.0～4.0)×10⁵个/cm²密度接种T225瓶，同上培养2～3天，为P1代细胞。

消化P1代细胞，按照细胞密度(0.3～0.6)×10⁵个/cm²或分种率1:2～1:4，接种至4层细胞工厂，将带有空气滤芯的接头安装在细胞工厂接口处，放置于5％二氧化碳培养箱中培养3～4天，细胞长成致密状态，为P2代细胞。消化P2代细胞，继续传代接种到4层细胞工厂，发现细胞无法贴壁生长成片。

实验结果表明，在5％二氧化碳培养箱和自然通气状态下，细胞工厂内部与外界的气体交换不充分，细胞可以在细胞工厂中生长1代，继续传代不能良好生长。

实施例4采用MEM和欧氏乳蛋白液培养液在无二氧化碳培养条件下进行鸡胚细胞的传代培养

以MEM和欧氏乳蛋白液作为基础培养液，添加10％胎牛血清，用NaHCO₃溶液调节至不同pH值(pH6.8、7.0、7.2、7.4、7.6和7.8)，以无二氧化碳封闭培养方式，在T150细胞瓶中进行鸡胚细胞的传代培养。从原代细胞传至P1代后，细胞胞质内出现空泡，部分细胞脱落。

实验结果表明，采用MEM和欧氏乳蛋白液作为基础培养液，不能用于无二氧化碳培养条件下的鸡胚细胞传代培养。

实施例5采用强化M199培养液在T150细胞瓶中进行鸡胚细胞的传代培养

以M199作为基础培养液，在其中添加一组强化添加物，其中含有亚油酸3×10^-4mM、亚硒酸钠5×10^-6mM、偏钒酸铵5×10^-6mM和硫辛酸1×10^-5mM，配制成溶液后，经0.2μm除菌过滤，再添加10％新生牛血清，并用NaHCO₃溶液调节pH至7.1～7.3，以T150细胞瓶为培养介质，在无二氧化碳封闭的培养条件下，从P0代细胞进行连续传代培养(图4A)。对照组采用M199培养液(不添加强化添加物)，同上添加10％新生牛血清并调节pH至7.1～7.3，分别在5％二氧化碳(图4B)和无二氧化碳封闭(图4C)的培养条件下，从P0代细胞进行连续传代培养。

同实施例2的方法制备细胞和连续传代培养至P6代。

图4是采用强化M199培养液时，鸡胚细胞连续传代的细胞增殖情况。实验结果表明：

采用强化M199培养液(添加强化添加物)作为基础培养液，在封闭(无二氧化碳)培养条件下于T150细胞瓶中培养时，细胞能稳定传代(图4A)；细胞呈典型梭状纤维样，形态饱满、修长，呈旋涡状整齐排列；平均每次传代细胞倍增数为2倍。

采用M199培养液的对照组(不添加强化添加物)，在5％二氧化碳条件下，细胞能传代培养(图4B)，平均每次传代细胞倍增数为2倍；但是，在封闭(无二氧化碳)培养条件下，细胞只能传递至第2代(图4C)。

实施例6采用强化MEM培养液在细胞工厂中进行鸡胚细胞的传代培养

以MEM作为基础培养液，在其中添加一组强化添加物，其中含有亚油酸钠1×10^- ⁴mM、亚硒酸3×10^-5mM、偏钒酸铵5×10^-8mM和硫辛酸1×10^-5mM，配制成溶液后，经0.2μm除菌过滤，再添加10％新生牛血清，并用NaHCO₃溶液调节pH至7.1～7.3，以1层、2层、4层和10层细胞工厂为培养介质，在无二氧化碳的培养条件下，进行连续传代培养。

按照实施例1中方法制备原代鸡胚细胞后，采用上述强化MEM培养液，以(2.0～3.0)×10⁵个/cm²接种于1层细胞工厂中，置于36±1℃、无二氧化碳培养箱中培养2～3天，即为原代细胞，标记为P0代。经胰酶消化P0代细胞，用细胞培养液重悬，按细胞密度(0.3～0.6)×10⁵个/cm²或分种率1:2～1:4，接种至2层细胞工厂中继续培养3～4天，为P1代细胞。待P1代细胞长成致密状态后，按照1:2比例在细胞工厂中连续传代，其中P1～P5代采用2层细胞工厂，P6～P13代采用4层细胞工厂，P14～P15代采用10层细胞工厂培养。从P1代到P15代，细胞培养3～4天长成致密状态，细胞形态呈典型的成纤维样，排列整齐；平均每次传代细胞倍增数为2倍。

图5显示了采用强化MEM培养液时，传代培养鸡胚细胞的形态和各代次收获的细胞密度和倍增数。

实验结果表明，采用强化MEM培养液作为基础培养液，在无二氧化碳的培养条件下，鸡胚细胞能在细胞工厂中稳定传代培养。

实施例7采用强化M199培养液在4层细胞工厂中进行鸡胚细胞麻疹病毒的培养

按照实施例5及其强化M199培养液配方，采用4层细胞工厂为培养介质和无二氧化碳培养条件，制备培养原代细胞，并将细胞连续传代至P3和P5代。待细胞长成致密状态后，弃去原有培养液，按感染复数(MOI)0.1接种麻疹病毒，培养液采用含2％新生牛血清的M199培养液。培养3天后，换用含1％新生牛血清的M199培养液继续培养2天；弃去原有培养液，用无菌PBS洗涤细胞2次，换用不含牛血清的M199培养液继续培养2天，收集培养瓶中的培养液，加入人血白蛋白至终浓度为0.5％(w/v)，即为第一次病毒收获液；在收获后的细胞工厂中加入不含牛血清的M199培养液再继续培养1天，收集培养瓶中的培养液，加入人血白蛋白至终浓度为0.5％(w/v)，即为第二次病毒收获液。采用CCID₅₀法测定病毒滴度。

实验结果如图6所示，各代次鸡胚细胞培养的麻疹病毒收获液滴度水平在6.0lgCCID₅₀/ml左右，符合《中国药典》对麻疹减毒活疫苗原液滴度的要求(≥4.5lg CCID₅₀/ml)。

实施例8采用强化MEM培养液在2层细胞工厂中进行鸡胚细胞腮腺炎病毒的培养

按照实施例6及其强化MEM培养液配方，采用2层细胞工厂为培养介质，制备培养原代细胞，并将细胞连续传代至P5代。待细胞生长呈致密状态后，弃去旧培养液，按感染复数(MOI)0.01接种腮腺炎病毒，细胞维持液采用含1％新生牛血清的M199培养液，继续培养2天后，用无菌PBS洗涤细胞2次，换不含牛血清、含0.5％(w/v)人血白蛋白的M199溶液继续培养，于接种病毒后第4天收获培养液，即为病毒收获液。实验重复3次。采用CCID₅₀法测定病毒滴度。

实验结果如图7所示。采用含强化MEM细胞培养液在2层细胞工厂中培养P0代细胞并传代至P5代，可用于腮腺炎病毒培养。P5代细胞产毒水平(6.9lg CCID₅₀/ml)高于P0代细胞(5.7lg CCID₅₀/ml)，均符合《中国药典》对腮腺炎减毒活疫苗原液滴度的要求(≥5.0lgCCID₅₀/ml)。

实施例9采用传代鸡胚细胞培养的麻疹和腮腺炎病毒的序列测定

将麻疹病毒沪-191株毒种接种P0、P3和P5代鸡胚细胞，经培养后收获病毒液，对麻疹病毒N和H基因进行测序。将腮腺炎病毒S₇₉株毒种接种P0、P3和P5代鸡胚细胞，经培养后收获病毒液，对腮腺炎病毒的F、SH和HN基因进行测序。

实验结果表明，在三个不同代次的鸡胚细胞中培养的麻疹病毒序列完全一致，未发生变异；在三个不同代次的鸡胚细胞中培养的腮腺炎病毒序列完全一致，未发生变异。

实施例10传代鸡胚细胞的染色体和成瘤性检查

鸡胚细胞二倍体染色体数目为2n＝78，包括9对大染色体(8对常染色体和1对性染色体)和30对微小染色体，性染色体为Z、W，雄性为同配ZZ，雌性为异配ZW。取第5代和第9代鸡胚细胞进行染色体检查，未发现染色体数目和核型改变。

将鸡胚细胞连续传代至第8代，收获细胞，用PBS将细胞稀释成5×10⁷个活细胞/mL的悬液，注射于4～6周龄BALB/c雌性裸鼠皮下，每只注射0.2mL(含10⁷个活细胞)，连续观察16周，注射部位未见结节形成。在观察期末，对注射部位进行组织病理学检查。

实验结果如图8所示。实验组细胞(第8代鸡胚细胞)(图8C)注射部位组织切片正常，无肿瘤样细胞。阳性对照细胞(A549细胞)组(图8A)于第7天注射部位全部出现结节，组织病理学检查为肿瘤细胞。阴性对照细胞(MRC-5细胞)组(图8B)注射部位未见结节形成，组织病理学检查正常，无肿瘤样细胞。

该项研究表明，鸡胚细胞传代至第8代无成瘤性，具有良好的安全性。

讨论

原代鸡胚细胞可用于多种病毒性疫苗的生产，如麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、狂犬病疫苗、腺病毒疫苗、流感疫苗、黄热病疫苗、鸡传染性法氏囊病毒疫苗、新城疫疫苗、马立克氏病疫苗、禽流感疫苗等，也可用于重组腺病毒载体疫苗、重组麻疹病毒载体疫苗的生产，以及治疗性重组麻疹病毒载体和重组腺病毒载体制品的生产。

将原代细胞传代5代内，用于病毒类产品生产，可以大大节约原代鸡胚的使用量，不但细胞的均一性增加，而且多次传代培养，增加了外源污染的观察期，提高了疫苗的安全性。

但是，通常用于原代鸡胚细胞培养的细胞培养液，在进行传代培养时需要二氧化碳条件，且不适用于在细胞工厂中的连续传代。

在本发明中，通过优化细胞培养液，可以在无二氧化碳培养条件下，实现原代鸡胚细胞的连续传代，尤其适用于在多层细胞工厂中大规模制备传代鸡胚细胞，实现病毒类产品的规模化生产。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种动物细胞传代培养的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(S1) 提供一原代动物细胞P0；

(S2) 将所述的原代动物细胞P0，在浓度C0的二氧化碳条件下，在细胞培养液中进行传代培养，从而获得第n代的传代细胞Pn，其中n为传代次数；

(1)亚油酸或亚油酸钠；浓度为1×10^-4～5×10^-4mM；

(2)亚硒酸或亚硒酸钠；浓度为3×10^-6～5×10^-5mM；

(3)偏钒酸铵；浓度为1×10^-8～5×10^-6mM；和

(4)硫辛酸；浓度为5×10^-6～1.5×10^-5mM；

在步骤(S2)中，二氧化碳的浓度C0≤1%(v/v)；

n为选自1～40的任一正整数；所述动物细胞为鸡胚细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的n为选自2~20的任一正整数。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的n为选自3~6的任一正整数。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的n为选自6~10的任一正整数。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(S2)中，二氧化碳的浓度C0≤0.05%(v/v)。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，C0≤0.04(v/v)。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述强化添加物含有以下成分：

(1) 亚油酸，浓度为1×10^-4～5×10^-4mM；

(2) 亚硒酸钠，浓度为3×10^-6～5×10^-5mM；

(3) 偏钒酸铵，浓度为1×10^-8～5×10^-6mM；和

(4) 硫辛酸，浓度为5×10^-6～1.5×10^-5mM。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述强化添加物含有以下成分：

(1)亚油酸钠，浓度为1×10^-4～5×10^-4mM；

(2)亚硒酸，浓度为3×10^-6～5×10^-5mM；

(3)偏钒酸铵，浓度为1×10^-8～5×10^-6mM；和

(4)硫辛酸，浓度为5×10^-6～1.5×10^-5mM。

9.一种病毒的培养方法，其特征在于，包括步骤：

(S1) 提供一原代动物细胞P0；

(1)亚油酸或亚油酸钠；浓度为1×10^-4～5×10^-4mM；

(2)亚硒酸或亚硒酸钠；浓度为3×10^-6～5×10^-5mM；

(3)偏钒酸铵；浓度为1×10^-8～5×10^-6mM；和

(4)硫辛酸；浓度为5×10^-6～1.5×10^-5mM；

在步骤(S2)中，二氧化碳的浓度C0≤1%(v/v)；

n为选自1～40的任一正整数；所述动物细胞为鸡胚细胞；

(S3)在培养介质中，提供上一步骤所获得的传代细胞；

(S4)用病毒感染(S3)中的传代细胞，培养并收集，得到扩增的目的病毒收获液。

10.一种病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(S1) 提供一原代动物细胞P0；

(1)亚油酸或亚油酸钠；浓度为1×10^-4～5×10^-4mM；

(2)亚硒酸或亚硒酸钠；浓度为3×10^-6～5×10^-5mM；

(3)偏钒酸铵；浓度为1×10^-8～5×10^-6mM；和

(4)硫辛酸；浓度为5×10^-6～1.5×10^-5mM；

在步骤(S2)中，二氧化碳的浓度C0≤1%(v/v)；

n为选自1～40的任一正整数；所述动物细胞为鸡胚细胞；

(S3)提供上一步骤所获得的传代细胞；

(S4)用病毒感染(S3)中的传代细胞，培养并收集，得到扩增的目的病毒收获液；

(S5)将步骤(S4)所得病毒收获液纯化后配制成疫苗。