CN112877299B - 一种猪流行性腹泻、猪细小病毒二联疫苗及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明一种猪流行性腹泻、猪细小病毒二联疫苗。本发明将保藏编号为CCTCC NO:V202085的猪细小病毒CH01株以及猪流行性腹泻病毒变异株2a接种至悬浮的ST细胞中，通过全悬浮的方法制备成二联疫苗，得到的二联疫苗免疫原性强，对于母猪自身以及其产仔能力有较强的保护力，可以有效保证母猪的正常繁殖。本发明提供的二联疫苗在猪流行性腹泻病毒和猪细小病毒共同免疫的领域，具有重要意义。

Description

一种猪流行性腹泻、猪细小病毒二联疫苗及其应用
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种猪流行性腹泻、猪细小病毒二联疫苗及其应用。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea v irus,PEDV)属尼多目、冠状病毒科、冠状病毒属，是猪病毒性腹泻爆发的主要病原之一。目前为止，由PEDV引起的猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)在全世界范围内持续流行，猪流行性腹泻是由病毒引起的仔猪和育肥猪一种急性肠道传染病，该病只发生于猪且各种年龄的猪都能感染发病而新生仔猪死亡率最高，病猪是主要传染源。
猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)属细小病毒科、细小病毒属，是引起猪的一种繁殖障碍疾病，该病主要表现为胚胎和胎儿的感染和死亡，特别是初产母猪发生死胎、畸形胎和木乃伊胎，但母猪本身无明显的症状。各种不同年龄、性别的家猪和野猪均易感染猪细小病毒，传染源主要来自感染细小病毒的母猪和带毒的公猪。
不论是PEDV引起的新生仔猪高病死率还是PPV引起的母猪繁殖障碍，它们都给养猪业造成了重大的经济损失，且严重威胁着养猪业的健康发展。就目前的疾病防控手段来看，疫苗免疫仍是预防疾病发生、流行和降低死亡率的最佳方法。现今，市场上出现了很多相关的单苗，都只针对其中一种疾病——猪腹泻或者猪繁殖障碍；新生仔猪由于抵抗力弱，对其进行疫苗免疫时，出现应激的情况尤为突出，严重的会导致仔猪死亡。为了避免这种应激，可以通过免疫母猪使新生仔猪获得母源抗体，从而来预防、控制新生仔猪腹泻引起的高死亡率，且母猪本身也能得到保护。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种猪流行性腹泻、猪细小病毒二联疫苗及其应用。本发明将猪细小病毒CH01株和猪流行性腹泻病毒变异株2a制备成二联疫苗，具有较好的免疫原性，同时可以有效保证母猪的正常繁殖能力。
第一方面，本发明提供一种猪细小病毒(porcine parvovirus)CH01 株。本发明从临床发病木乃伊胎儿中分离得到一株猪细小病毒 (porcine parvovirus)CH01毒株，并对其进行了保藏，具体保藏信息如下：保藏编号为：CCTCC NO:V202085；分类命名为：猪细小病毒 CH01株；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072；保藏日期为：2020年12月1日。
本发明进一步提供猪细小病毒CH01株在制备用于免疫猪细小病毒的药物中的应用。
第二方面，本发明提供一种疫苗，所述疫苗为猪流行性腹泻、猪细小病毒二联疫苗，包括：猪流行性腹泻病毒免疫组分，以及猪细小病毒免疫组分；
所述猪流行性腹泻病毒免疫组分来源于猪流行性腹泻病毒 (Porcine epidemicdiarrhea virus)变异株2a；
所述猪细小病毒免疫组分来源于上述猪细小病毒(porcine parvovirus)CH01株。
进一步地，所述猪流行性腹泻病毒免疫组分为灭活的所述猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)变异株2a；
所述猪细小病毒免疫组分为灭活的猪细小病毒(porcine parvovirus)CH01株。
进一步地，所述猪流行性腹泻病毒免疫组分和所述猪细小病毒免疫组分的体积比为：1～1:2～1。
进一步地，所述猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)变异株2a在所述二联疫苗中总含量不低于107.3TCID50/mL；
所述猪细小病毒(porcine parvovirus)CH01株在所述二联疫苗中总含量不低于107.5TCID50/mL。
进一步地，还包括佐剂，所述佐剂为ISA201VG。
第三方面，本发明提供一种制备所述二联疫苗的方法，包括：
将猪细小病毒(porcine parvovirus)CH01株和猪流行性腹泻病毒 (Porcineepidemic diarrhea virus)变异株2a接种至悬浮型ST细胞中，经过培养后收获病毒液，配以佐剂制备得到所述二联疫苗。
本发明通过此方法制备猪细小病毒和猪流行性腹泻病毒时，猪流行性腹泻病毒变异株2a的病毒液滴度最高可达108.5TCID50/mL，猪细小病毒CH01株的病毒液滴度最高可达109.0TCID50/mL。
本发明具备如下有益效果：本发明将猪细小病毒CH01株和猪流行性腹泻病毒变异株2a制备成二联疫苗，其中猪细小病毒CH01株相较于其他猪细小病毒株而言，毒价高，免疫原性强，最高可达109.0 TCID50/mL。
本发明将猪细小病毒CH01株和猪流行性腹泻病毒变异株2a制备成二联疫苗后，显著提高了其对于母猪繁殖能力的保护力，可以更有效地保证母猪的产仔能力，胎儿正常率以及产仔存活率显著提高。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的不同胰酶浓度接种猪腹泻病毒的效价结果；
图2为本发明实施例1提供的不同细胞密度接种猪腹泻病毒的效价结果；
图3为本发明实施例1提供的不同接种剂量及收获时间，猪腹泻病毒液的效价结果；
图4为本发明实施例2提供的不同细胞密度接种猪细小病毒的效价结果；
图5为本发明实施例2提供的不同接种剂量及收获时间，猪细小病毒液的效价结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1猪流行性腹泻病毒变异株2a病毒液的制备
(一)生产用毒种的繁殖
包括细胞的扩大培养，病毒接种，病毒液收获，病毒效价测定，无菌及外源检测。
1、细胞扩大培养：校准生物反应器的溶氧(DO)电极、PH电极、温度电极后并对其高压灭菌，泵入生物反应器总体积20％的生长待用。待摇瓶中悬浮型ST细胞密度达到7-10×106个/mL且细胞活率为 95％以上时，将悬浮型ST细胞以0.5-1×106个/ml的密度转接于生物反应器中，设置最佳培养条件为37℃，PH 7.2-7.4，DO 40％-60％，70r±5。
2、病毒接种：当生物反应器中ST细胞密度达到7-10×106个/mL，用生长液稀释ST细胞使其密度为2-3×106个/mL，并加入胰酶使其终浓度为10-15μg/mL，按0.01MOI剂量接种猪流行性腹泻病毒变异株2a， 37℃继续培养，设置最佳培养条件为37℃，PH 7.2-7.4，DO40％-60％， 70r±5。
病毒液收获：接毒后24h左右收获并取样检测其TCID50，检测病毒含量和纯净性，符合规定后定量分装，并标记名称、生产日期、代次、效价。
病毒含量测定及无菌、外源检验：按现行〖中国兽药典〗附录进行病毒效价测定及检验，病毒含量均不低于107.9TCID50/ml，且应无菌生长、无规定外源。
(二)猪流行性腹泻病毒变异株2a病毒液的制备
1、生物反应器的扩大培养：将生物反应器的溶氧(DO)电极、 PH电极、温度电极进行校准，并对罐体进行高压灭菌，待反应器冷却后泵入生物反应器总体积20％的生长液待用。待种细胞罐中细胞密度为7-10×106个/mL且细胞活率为95％以上时,将悬浮型ST细胞以 0.5-1×106个/mL的细胞密度转接于生物反应器中，设置最佳培养条件为37℃，PH 7.2-7.4，DO 40％-60％，70r±5。
2、病毒接种：当生物反应器中ST细胞密度达到7-10×106个/mL，用生长液将悬浮型ST细胞稀释至细胞密度2-3×106个/ml，并加入胰酶使其终浓度为10-15μg/mL，按0.01MOI的接种猪流行性腹泻病毒变异株2a，37℃继续培养，设置最佳培养条件为37℃，PH7.2-7.4，DO 40％-60％，70r±5。
3、病毒液收获：接毒后24h取样检测其TCID50(猪流行性腹泻病毒变异株2a的病毒液滴度最高可达108.5TCID50/mL)，检测病毒含量和纯净性，符合规定后定量分装，并标记名称、生产日期、效价。
4、病毒含量测定及无菌、外源检验：按现行〖中国兽药典〗附录进行病毒效价测定及检验，病毒含量均不低于107.9TCID50/mL，且应无菌生长、无规定外源。
5、病毒液纯化：将自然沉淀的病毒液吸取上清通过0.65μm滤器，再通过300KDa的膜包浓缩。
(三)灭活及半成品检测：
1、灭活：将纯化后的病毒液原液稀释后加入灭活罐中，加入BEI 灭活，使BEI终浓度为0.005mol/L，边加边搅拌，混合均匀后于37℃下灭活48h，加入终浓度为2％硫代硫酸钠终止灭活，在此过程中每隔 2-4小时搅拌一次。
2、无菌检验：按现行〖中国兽药典〗附录进行检验，应无菌生长。
3、灭活检验：取灭活后的抗原做无菌检测及将灭活液按1％体积比接种于贴壁的Vero，36h后收获并反复冻融2-3次，将收获的冻融物按以上方法接种Vero细胞，如此反复盲传2代，每代连续观察7d，细胞应无病变。
(四)最佳条件优化及结果
1、最佳胰酶浓度的确定：待细胞密度达到7-10×106个/mL后，用生长液将ST细胞稀释至细胞密度为2×106个/mL后，按0.01MOI剂量接种种毒，加入胰酶使其浓度分别为10μg/mL，15μg/mL，20μg/mL， 24h后取样并检测病毒含量。结果表明最佳胰酶浓度为10μg/ml，具体结果见图1。
2、最佳细胞密度的确定:用生长液将ST细胞稀释至细胞密度分别为2×106个/mL和3×106个/mL，加入终浓度为10μg/mL胰酶，按0.01 MOI剂量接种种毒，24h后取样并测定病毒效价。结果显示最佳接毒细胞密度为2×106个/mL，具体结果见图2。
3、最佳接毒量及收获时间的确定：用生长液将ST细胞稀释至细胞密度为2×106个/mL，加入终浓度为10μg/mL胰酶，分别按0.001、 0.01、0.1MOI剂量接种种毒，18h、24h、30h、36h取样并检测病毒含量。结果表明最佳接毒量为0.01MOI，最佳收获时间为24h，具体结果见图3。
实施例2猪细小病毒CH01株病毒液的制备
(一)生产用毒种的繁殖
1、包括细胞的扩大培养，病毒接种，病毒液收获，病毒含量测定，无菌及外源检测。
2、细胞扩大培养：校准生物反应器的溶氧(DO)电极、PH电极、温度电极后并对其高压灭菌，泵入生物反应器总体积20％的生长待用。待摇瓶中悬浮型ST细胞密度达到7-10×106个/ml且细胞活率为 95％以上时，将悬浮型ST细胞以0.5-1×106个/mL的密度转接于生物反应器中，设置最佳培养条件为37℃，PH 7.2-7.4，DO 40％-60％，70r±5。
3、病毒接种：待生物反应器中ST细胞密度达到7-10×106个/mL 时，用生长液稀释ST细胞使其密度为2-3×106个/mL，按0.1MOI剂量接种猪细小病毒CH01株，37℃继续培养，设置最佳培养条件为37℃， PH 7.2-7.4，DO 40％-60％，70r±5。
猪细小病毒CH01株的保藏信息如下：
保藏编号为：CCTCC NO:V202085；分类命名为：猪细小病毒 CH01株；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为：中国武汉武汉大学，邮编430072；保藏日期为：2020年12月1日。
病毒液收获：接毒后42h左右收获并取样检测，检测病毒含量和纯净性，符合规定后定量分装，并标记名称、生产日期、代次、效价。
病毒含量测定及无菌、外源检验：按现行〖中国兽药典〗附录进行病毒含量测定及检验，病毒含量均不低于108.1TCID50/mL，且应无菌生长、无规定外源。
(二)猪细小病毒CH01株病毒液的制备
1、生物反应器的扩大培养：将生物反应器的溶氧(DO)电极、 PH电极、温度电极进行校准，并对罐体进行高压灭菌，待反应器冷却后泵入生物反应器总体积20％的生长液待用。待种细胞罐中细胞密度为7-10×106个/ml且细胞活率为95％以上时,将悬浮型ST细胞以 0.5-1×106个/ml的细胞密度转接于生物反应器中，设置最佳培养条件为37℃，PH 7.2-7.4，DO 40％-60％，70r±5。
2、病毒接种：当生物反应器中ST细胞密度达到7-10×106个/mL，用生长液将悬浮型ST细胞稀释至细胞密度2-3×106个/ml，按0.1MOI 剂量接种猪细小病毒CH01株，37℃继续培养，设置最佳培养条件为 37℃，PH 7.2-7.4，DO 40％-60％，70r±5。
3、病毒液收获：接毒后42h取样检测其TCID50(猪细小病毒CH01 株的病毒液滴度最高可达109.0TCID50/mL)，检测病毒含量和纯净性，符合规定后定量分装，并标记名称、生产日期、效价。
4、病毒含量测定及无菌、外源检验：按现行〖中国兽药典〗附录进行病毒含量测定及检验，病毒含量均不低于108.1TCID50/mL，且应无菌生长、无规定外源。
5、病毒液纯化：将自然沉淀的病毒液吸取上清通过0.65μm滤器，再通过300KDa的膜包浓缩。
(三)灭活及半成品检测：
1、灭活：将纯化后的病毒液原液稀释后加入灭活罐中，加入BEI 灭活，使BEI终浓度为0.005mol/L，边加边搅拌，混合均匀后于37℃下灭活48h，加入终浓度为2％硫代硫酸钠终止灭活，在此过程中每隔 2-4小时搅拌一次。
2、无菌检验：按现行〖中国兽药典〗附录进行检验，应无菌生长。
3.灭活检验：取灭活后的抗原做无菌检测及将灭活液按1％体积比接种于贴壁的ST细胞，5d后收获并反复冻融2-3次，将收获的冻融物按以上方法接种ST细胞，如此反复盲传2代，每代连续观察7d，细胞应无病变。
(四)最佳条件优化及结果
1、最佳细胞密度的确定:用生长液将ST细胞稀释至细胞密度分别为2×106个/mL和3×106个/mL，按培养体积的5％剂量接种种毒，42h 后取样并测定病毒效价。结果显示最佳接毒细胞密度为2×106个/ml，具体结果见图4。
2、最佳接毒量及收获时间的确定：用生长液将ST细胞稀释至细胞密度为2×106个/mL，分别按培养体积的0.01、0.1、0.5MOI剂量接种种毒，分别于24h、48h、72h、96h取样并检测病毒含量。结果表明最佳接毒量为0.1MOI剂量，最佳收获时间为48h，具体结果见图5。
实施例3猪流行性腹泻、猪细小病毒二联灭疫苗的制备及检验
(一)PEDV/PPV二联灭活疫苗制备
1、水相制备：将灭活好的猪流行性腹泻病毒变异株2a和猪细小病毒CH01株病毒液按体积比1：1混合均匀。
2、乳化、分装：将水相与201佐剂按体积1:1混合后乳化，检测合格后定量分装、轧盖、贴签；其中猪流行性腹泻病毒变异株2a含量≥107.3TCID50/mL，猪细小病毒CH01株含量≥107.5TCID50/mL。
3、疫苗检验方法及结果
按照上述方法制备3批疫苗，批号分别为：20200301、10190302、 20200303
(1)性状检验3批灭活疫苗外观呈乳白色
(2)无菌检验3批灭活疫苗按照现行〖中国兽药典〗附录进行检验，应无菌生长。
(3)支原体检验3批灭活疫苗按照现行〖中国兽药典〗附录进行检验，未发现小瓶和小管培养物颜色出现明显变化，移植的液体培养物在固体培养基上无“煎蛋”状支原体菌落。
(4)外源病毒检验3批灭活疫苗按照现行〖中国兽药典〗附录进行检验，应为纯净毒种。
表1 3批猪流行性腹泻、猪细小病毒二联灭活疫苗检验结果
检验项目 20200301 20200302 20200303
性状检验 乳白色 乳白色 乳白色
无菌检验 无菌生长 无菌生长 无菌生长
支原体检验 无支原体生长 无支原体生长 无支原体生长
外源病毒检验 无外援病毒污染 无外援病毒污染 无外援病毒污染
实施例4猪流行性腹泻、猪细小病毒二联灭活疫苗的动物试验
(一)安全性试验
选取猪流行性腹泻、猪细小病毒中和抗体阴性的后备母猪20头，随机分成4组，每组5头，组1、组2、组3分别注射实施例3中的200301、 200302、200303三批疫苗，组4注射生理盐水作为空白对照组，临床观察2周，均为100％健活，未见不良反应。具体结果见表2。
表2三批猪流行性腹泻、猪细小病毒二联灭活疫苗安全性试验结果
Figure BDA0002915244040000091
Figure BDA0002915244040000101
(二)效力试验
1、猪流行性腹泻病毒部分
选取产前6-8周猪流行性腹泻、猪细小病毒中和抗体阴性(PEDV 中和抗体效价不高于1：2)的妊娠母猪10头，随机分成2组，每组5 头猪，组1免疫实施例3中的猪流行性腹泻、猪细小病毒二联灭活疫苗 1头份/头，组2肌肉注射相同量的生理盐水作为空白对照组；第一次免疫后14天采血，并进行第二次免疫，二免后14天采血，测其中和抗体水平；
待母猪产仔后，分别随机取组1中3日龄、7日龄仔猪各10头，组2 中3日龄、7日龄仔猪各10头；均口服猪流行性腹泻病毒强毒株2a病毒液5ml，观察仔猪攻毒后临床表现。
2、猪细小病毒部分
选取产前6-8周猪流行性腹泻、猪细小病毒中和抗体阴性(PPV 中和抗体效价不高于1：4)的妊娠母猪10头，随机分成2组，每组5 头猪，组1免疫实施例3中的猪流行性腹泻、猪细小病毒二联灭活疫苗 1头份/头，14天加强免疫一次；组2用生理盐水做相同处理作为空白对照组；分别于免疫后14d、21d、28d采血分离血清，用微量血凝抑制法测HI抗体效价。
选取猪流行性腹泻、猪细小病毒中和抗体阴性的后备青年母猪10 头，组1为实验组，于配种前1个月进行免疫，14天后加强免疫；组2 为空白对照组，用生理盐水作相同处理；在二免后28天对这10头怀孕母猪攻毒，方法为用效价为106.0TCID50/ml的猪细小病毒液滴鼻4ml/ 头。攻毒后第5d、7d、9d采血，分离得到血浆后于37℃培养5天，收集培养物上清做HA检查，连续通过三代，每次做HA检测，确定有无病毒血症，并观察母猪产仔情况。
3、效力试验结果
3.1猪流行性腹泻部分在一免疫后21天中和抗体水平达到1： 32，此时进行二免，二免后14天中和抗体水平达到1：64；对免疫母猪后所产下的3日龄和7日龄仔猪进行猪流行性腹泻病毒攻毒，10头仔猪哺乳、精神、粪便均未见异常，100％健活；注射生理盐水的对照组所产下仔猪，3日龄和7日龄攻毒后，10头免疫仔猪全部表现为典型的猪流行性腹泻症状，呕吐、拉稀等且全部死亡；具体结果见表3、表4。
表3：免疫后母猪的猪流行性腹泻病毒中和抗体水平
Figure BDA0002915244040000111
表4：免疫后母猪所产仔猪对猪流行性腹泻病毒的攻毒保护率
Figure BDA0002915244040000112
3.2猪细小病毒部分对免疫后母猪分别于第14天、21天、28天采血分离血清并测定HI抗体效价；攻毒后，组1母猪检测无病毒血症，对照组2发生比率为93.3％；组1母猪所产仔存活率100％，对照组2母猪所产仔存活率为91.6％。具体数据见表5、表6、表7。
表5：免疫后母猪的猪细小病毒HI抗体效价水平
Figure BDA0002915244040000113
Figure BDA0002915244040000121
表6：免疫后母猪对猪细小病毒的攻毒保护实验
Figure BDA0002915244040000122
表7：免疫后母猪对猪细小病毒的攻毒保护的产仔情况
Figure BDA0002915244040000123
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一种猪细小病毒（porcine parvovirus）CH01株，其特征在于，所述猪细小病毒（porcine parvovirus）CH01株的保藏编号为CCTCC NO:V202085。
2.权利要求1所述猪细小病毒（porcine parvovirus）CH01株在制备用于免疫猪细小病毒的药物中的应用。
3.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包括灭活的权利要求1所述猪细小病毒（porcine parvovirus）CH01株。
4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为猪流行性腹泻、猪细小病毒二联疫苗，包括：猪流行性腹泻病毒免疫组分，以及猪细小病毒免疫组分；
所述猪流行性腹泻病毒免疫组分为灭活的猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus）变异株2a；
所述猪细小病毒免疫组分为灭活的猪细小病毒（porcine parvovirus）CH01株。
5.根据权利要求4所述的二联疫苗，其特征在于：所述猪流行性腹泻病毒免疫组分和所述猪细小病毒免疫组分的体积比为：1~1 : 2~1。
6.根据权利要求5所述的二联疫苗，其特征在于：所述猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus）变异株2a在所述二联疫苗中总含量不低于107.3TCID50/mL；
所述猪细小病毒（porcine parvovirus）CH01株在所述二联疫苗中总含量不低于107.5TCID50/mL。
7.根据权利要求4-6任一项所述的二联疫苗，其特征在于：还包括佐剂，所述佐剂为ISA201VG。
8.权利要求4-7任一项所述二联疫苗的制备方法，其特征在于，包括：
将权利要求1所述猪细小病毒（porcine parvovirus）CH01株和猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus）变异株2a分别接种至悬浮型ST细胞中，经过培养后收获病毒液并纯化，灭活后混合均匀，配以佐剂制备得到所述二联疫苗。
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