CN111808826A

CN111808826A - 猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株及其应用

Info

Publication number: CN111808826A
Application number: CN202010635269.2A
Authority: CN
Inventors: 崔尚金; 梁琳; 刘存
Original assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Current assignee: Institute of Animal Science of CAAS
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2020-07-03
Publication date: 2020-10-23
Anticipated expiration: 2040-07-03
Also published as: CN111808826B

Abstract

本发明提供猪A型塞内卡病毒SVA/CH‑Fuj株及其应用。毒株CH‑Fuj具有免疫原性好、培养特性好、效价稳定等优点，将SVA/CH‑Fuj株接种ST细胞，收获培养物，用二乙烯亚胺灭活后，与ISA 201 VG佐剂混合乳化制成猪A型塞内卡病毒灭活疫苗。实验表明，利用本发明提供的猪A型塞内卡病毒灭活疫苗免疫2‑3周龄仔猪能够有效预防由猪A型塞内卡病毒引起的猪水疱性疾病，此疫苗具有安全、起效快、免疫期持久等优点。

Description

猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株及其应用

技术领域

本发明涉及生物制品和预防兽医领域，具体地说，涉及猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株及其应用。

背景技术

猪A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)，也称为塞内卡谷病毒(Seneca Valleyvirus，SVV)，是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，塞内卡病毒属(Senecavirus)的唯一成员。SVA是一种新发的猪的病毒性、传染性病原，是引起猪水疱性疾病的主要病原之一。SVA可以感染不同年龄的猪且可致新生仔猪死亡，感染猪临床症状主要表现为肌肉无力、嗜睡、跛足、腹泻，舌、鼻镜和蹄部冠状带出现充满液体的水疱，水疱破溃后形成溃疡，其对养猪业的生产和经济效益具有很大地威胁。SVA于2002年首次发现，对于新生仔猪，尤其是1至4日龄的新生仔猪，SVA感染后发病率可达70％，死亡率在15％～30％之间；感染其他日龄猪，发病率介于4％-70％。因此，SVA感染所引起的水疱性疾病对养猪业存在巨大威胁，亟需开发能够有效预防因SVA感染引起的相关疾病的疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种免疫原性好、培养特性好、效价稳定的猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株。

本发明的另一目的是提供猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株在制备疫苗中的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供猪A型塞内卡病毒(Senecavirus A)SVA/CH-Fuj株。发明人于2017年从福建省某猪场分离到一株猪A型塞内卡病毒，经鉴定，将驯化后的毒株命名为SVA/CH-Fuj株。本发明的猪A型塞内卡病毒是从发生典型水疱性疾病仔猪的蹄部水疱的水疱液中分离得到的。经猪睾丸传代细胞系(ST)传代后作为疫苗毒种，效价检测用强毒为SVA/CH-Fuj株第6～14代。该毒株可以引起ST细胞90％以上感染。

SVA/CH-Fuj株为在ST细胞上传代后的第6代病毒株，猪A型塞内卡病毒(Senecavirus A)SVA/CH-Fuj株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.19990，保藏日期2020年5月28日。

第二方面，本发明提供所述猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株的以下任一应用：

1)用于制备疫苗；

2)用于制备猪A型塞内卡病毒感染以及由其感染所致相关疾病的诊断试剂。

第三方面，本发明提供一种组合物，其包含灭活后的所述猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株以及药学上可接受的载体。

第四方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含上述组合物。

第五方面，本发明提供一种疫苗组合物，其包含上述免疫原性组合物。

第六方面，本发明提供一种猪A型塞内卡病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)将所述猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株接种至易感细胞进行培养，得到病毒液；

(2)将收获的病毒液用BEI灭活；

(3)将灭活后的病毒液与佐剂混合，即得。

优选地，步骤(1)所述易感细胞为ST细胞。

优选地，步骤(3)所述佐剂为油佐剂，优选ISA 201 VG。

前述的方法，步骤(2)包括：将收获的病毒液采用0.05％的二乙烯亚胺(BEI)在30℃条件下灭活48小时后，加入0.02％硫代硫酸钠终止灭活。

优选地，所述猪A型塞内卡病毒灭活疫苗是由50％法国赛比克公司的商品化Montanide^TM ISA 201 VG佐剂和50％用BEI灭活的猪A型塞内卡病毒(SVA/CH-Fuj株)混合乳化后制得。

乳化工艺是采用法国赛比克公司的商品化Montanide^TM ISA 201 VG佐剂，除菌后可直接用于疫苗乳化制备；乳化前将灭活的同批病毒液解冻混合，在无菌室内用匀浆机以350r/min搅拌均匀，然后按照水相抗原与油相佐剂1:1的比例混合；乳化程序为先将水相放入乳化器中进行搅拌，然后缓缓加入油相佐剂，低速搅拌30-60min；制备得到的疫苗属水包油包水剂型，为了稳定界面和消除气泡，获得最佳乳化效果，需要静止30min后分装。

第七方面，本发明提供所述疫苗组合物或者按照上述方法制备的猪A型塞内卡病毒灭活疫苗在制备治疗或预防猪A型塞内卡病毒感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用。

本发明中，所述疾病包括但不限于由猪A型塞内卡病毒感染引起的水疱性疾病。

本发明提供的猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株具有免疫原性好、培养特性好、效价稳定等优点，将SVA/CH-Fuj株接种ST细胞，收获培养物，用二乙烯亚胺灭活后，与ISA 201VG佐剂混合乳化制成猪A型塞内卡病毒灭活疫苗。实验表明，利用本发明提供的猪A型塞内卡病毒灭活疫苗免疫2-3周龄仔猪能够有效预防由猪A型塞内卡病毒引起的包括猪水疱性疾病在内的多种疾病，此疫苗具有安全、起效快、免疫期持久等优点。

附图说明

图1为本发明实施例1中猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株电镜鉴定结果。

图2为本发明实施例1中猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株感染ST细胞后不同时间引起的细胞病变。其中，A：正常ST细胞对照；B：ST细胞接毒24h；C：ST细胞接毒48h；D：ST细胞接毒72h。

具体实施方式

本发明提供猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株及其应用。发明人于2017年从福建省某猪场分离到一株猪A型塞内卡病毒，经鉴定，将驯化后的毒株命名为SVA/CH-Fuj株。利用SVA/CH-Fuj株开展了猪A型塞内卡病毒病灭活疫苗的研制开发工作，选择了适合该病毒增殖的ST细胞和符合制造疫苗的灭活剂、佐剂及其他条件。对制品的生产工艺、安全性、保护率、免疫程序、最小剂量、抗体持续期和保存期等进行了试验测定，结果表明本疫苗安全有效。在此基础上，进行了中试生产，经抽样检验，全部符合拟定的质量标准，并对中试产品进行了安全试验和效力试验，其结果也证实本疫苗能有效地预防由SVA引起的猪水疱性疾病。在实验室试验、中间试制的基础上，本发明研制出了猪A型塞内卡病毒(SVA/CH-Fuj株)灭活疫苗，其结果也证实本疫苗能有效地预防由SVA引起的猪水疱性疾病，进一步验证了本疫苗的各项质量标准。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例中使用的猪的品种为英系大白猪。

实施例1猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株的分离及培养鉴定

1、毒种来源及标准

根据新生物制品申报要求，结合本发明获得的大量的试验数据，参照《中国兽药典》(2005年版)，对制苗用毒种进行了鉴定。

1.1毒种来源

制作本生物制品用的毒种为猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株，是本发明人于2017年从发生猪水疱病的仔猪分离驯化后获得，由于其在细胞上的增殖良好、滴度高，对猪的免疫原性好，所以选择其用于疫苗的生产。经猪睾丸传代细胞系(ST)传代后作为疫苗毒种，效检用强毒为SVA/CH-Fuj株第6～14代。该毒种为在ST细胞上传代后的第6代病毒株(图1)。

1.2毒种标准

1.2.1病毒含量

将毒种用不含血清的DMEM作10倍系列稀释，共做10个(10^-1-10^-10)个稀释度，将各稀释度病毒液分别接种于已长成良好单层的96孔ST细胞培养板，每个稀释度作8个重复，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照6孔。接毒细胞置37℃、含5％CO₂培养箱中培养，观察细胞病变(CPE)，细胞固缩、脱落、出现较多空隙则判为CPE。观察5日，记录细胞病变孔数，同时正常细胞对照孔应不产生CPE，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。每毫升病毒液病毒含量不低于10^7.5TCID₅₀。

1.2.2毒力

毒种代次为猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株6-14代细胞毒，病毒含量不低于10^7.5TCID₅₀/ml。毒力测定程序为8-9周龄健康易感仔猪10头，随机分成2组，每组5头；一组每头仔猪滴鼻5ml(病毒含量为10^7.0TCID₅₀/ml)，另一组不接种作为空白对照组，隔离饲养。攻毒后连续观察14日，每日测温并观察临床症状。判定结果为接种猪发生水疱性疾病，发病猪出现腹泻和/或蹄部、口腔黏膜或鼻部起水疱或观察到水疱破溃后遗留的结痂，空白对照猪均应无异常临床症状。

1.2.3免疫原性

将毒种接种ST细胞，收获细胞培养液，按本规程用BEI灭活，添加Montanide^TM ISA201 VG佐剂制备灭活疫苗。用2-3周龄健康易感仔猪(抗原检测为阴性；SVA血清中和抗体效价≤1:4)5头，每头肌肉接种疫苗2ml，免疫后14～21日同样剂量加强免疫一次，同时设对照仔猪5头。二免后21日，连同对照猪用猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株6-14代细胞毒攻毒，每头猪滴鼻5ml(病毒含量为10^7.0TCID₅₀/ml)。攻毒后连续观察14日，对照猪应全部发生水疱病，免疫猪应至少有4头保护。

1.2.4纯净检验

对建立的猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株原始种子批15-16代、基础种子批17-26代和生产种子批27-30代按现行《中国兽药典》(三部)附录进行无菌检验、支原体检验和外源病毒检验，检测结果表明，本发明中建立的原始种子批、基础种子批、生产种子批均无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染，符合《中国兽药典》(三部)的规定。

1.2.5特异性

用不含血清的DMEM将毒种稀释成200TCID₅₀/0.1ml，与等量的SVA特异性阳性血清混匀，置37℃中和1小时，接种于96孔细胞培养板中培养已长成良好单层的ST细胞，每孔0.1ml，接种6孔，同时设正常细胞对照、病毒对照和阴性血清对照，置37℃、含5％CO₂培养箱中培养，观察5日。中和病毒组和正常细胞对照组应无CPE，而病毒对照组和阴性血清对照组一个产生CPE。

1.2.6毒种使用代次

将原始分离得到的猪A型塞内卡病毒，在ST细胞上连续传35代(即在菌种保藏号为CGMCC No.19990的SVA/CH-Fuj毒株的基础上连续传代30代)，测定了每一代病毒的TCID₅₀，选择第10、15、20、25、30、35代病毒分别经BEI灭活后制成灭活疫苗，接种2-3周龄健康易感仔猪，二免21天后用强度进行攻毒。结果表明，病毒在ST细胞上传代，第5代以后(包括第5代病毒，即保藏编号为CGMCC No.19990的病毒株)各代次病毒含量稳定，每毫升培养基中病毒含量不低于107.5TCID50。攻毒试验表明，第10、15、20、25、30、35代病毒制备的疫苗免疫猪在对猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株攻击的保护性无显著差异，免疫猪均为发生水疱性疾病；第35代病毒制备的疫苗免疫后攻毒有1头发病，而对照组猪均发生水疱性疾病。根据以上结果，为保证生产毒种良好的免疫原性和安全性，本发明确定了病毒的传代最高次数在30代，原始毒种为5-14代，基础毒种为第17-26代和生产种子批27-30代，生产用毒种最高传代次数限制在3代以内。

1.2.7毒种保存期的确定

将猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株病毒液和冻干毒分别在-20℃和-70℃下保存，于保存后不同时间取样进行TCID₅₀测定。结果显示，病毒液于-20℃冻存18个月、于-70℃保存30个月时毒价开始明显下降；冻干毒保存在-20℃和-70℃下，于保存后每年取样进行TCID₅₀测定。结果在-20℃下保存36个月的病毒的效价略有下降，保存48个月病毒TCID₅₀值明显下降，而在-70℃下保存48个月病毒TCID₅₀没有明显的变化，保存60个月下降明显。考虑到在病毒保存时存在的其他不利因素，保证病毒保存期可靠性，所以将猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株病毒液在-20℃的保存期定为12个月，在-70℃的保存期定为24个月；将猪A型塞内卡病毒冻干毒在-20℃的保存时间定为36个月；冻干毒在-70℃的保存时间为48个月。

2、生产用细胞

2.1细胞来源

ST细胞购自中国(武汉)典型培养物保藏中心。

2.2细胞的选择

本发明选用传代细胞系ST进行病毒增殖，结果病毒在ST细胞上的病变时间较早，增殖滴度高，猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株在ST细胞中增殖产生的细胞病变见图2。

2.3细胞系的建立

制苗用细胞系选用ST细胞。传代范围控制在40-55代，本发明建立了原始细胞库、基础细胞库和工作细胞库。其中原始细胞库共分装55瓶；基础细胞库分装370瓶；工作细胞库共分装了350瓶。对各个代次的细胞都按《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒的污染。

2.4细胞系的鉴定

根据现行《中国兽药典》附页中有关“生产、检验用细胞标准”规定进行检验，均符合标准。

实施例2猪A型塞内卡病毒灭活疫苗的制备

本实施提供猪A型塞内卡病毒灭活疫苗(SVA/CH-Fuj株)的制备工艺。从实验室制备的3批疫苗和中间试制的5批疫苗质检结果来看，用该工艺流程制备的疫苗产品质量稳定，效检结果完全符合所制定的质量标准。

1、病毒液的制备

病毒培养过程中，血清会影响病毒复制，首先通过中和试验确定培养用血清不含抗SVA的中和抗体。通过比较试验，确定以含10％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，以含2％血清DMEM培养基为维持液，最佳接毒剂量为1％(v/v)病毒含量为10^7.0TCID₅₀/ml的接种剂量，37℃培养，较佳的收毒时间为48～72小时。

在本实施例中选用细胞培养液(DMEM，购自Gibco公司)中血清浓度为10％，pH值控制在7.2～7.4之间，维持液(DMEM，购自Gibco公司)中血清浓度为2％，以1％(v/v)病毒含量为10^7.0TCID₅₀/ml的接种剂量接种长至良好单层的ST细胞。接种后每日观察CPE，当CPE达到75％以上时收获(48～72小时)，冻融3次，离心除去细胞碎片，取上清收获病毒液。

2、灭活工艺

将二乙烯亚胺(BEI)作为灭活病原的烷化剂，其可破坏破坏微生物核酸，而不影响其蛋白质成分，并保持病毒抗原性。在本实施例中选择BEI作为灭活剂，通过对不同浓度BEI和不同灭活时间下灭活效果的比较试验，表明0.05％BEI在30℃灭活36小时可将病毒灭活。为保证安全，最终确定以0.05％的BEI在30℃条件下灭活48小时作为较佳的灭活方式。

3、乳化工艺

采用法国赛比克公司的商品化Montanide^TM ISA 201 VG佐剂，除菌后可直接用于疫苗乳化制备；乳化前将灭活的同批病毒液解冻混合，在无菌室内用匀浆机以350r/min搅拌均匀，然后按照水相抗原与油相佐剂1:1的体积比混合；乳化程序为先将水相缓缓加入在乳化器中搅拌油相佐剂中，以350r/min连续搅拌40min；制备得到的疫苗属水包油包水型。

4、半成品检验质量标准

4.1无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

4.2病毒含量测定

以DMEM培养液将毒种作连续10倍系列稀释，每个稀释度取100μl加入96孔细胞培养板中培养长至良好单层的ST细胞，每个稀释度作8个重复，并设正常细胞培养对照，置37℃、含5％的CO₂培养箱中培养，观察细胞病变(CPE)，细胞固缩、脱落、出现较多空隙则判为CPE。观察5日，记录细胞病变孔数，同时正常细胞对照孔应不产生CPE，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。每毫升病毒液病毒含量不低于10^7.5TCID₅₀。

4.3灭活检验

灭活后的病毒液，按病毒液与细胞培养液1:10的比例接种3瓶ST细胞，37℃培养观察5日，对无病变者再盲传2代，同时设病毒对照。结果无细胞病变。实验室生产的3批半成品均合格。

5、关于成品检验质量标准

5.1安全检验标准

为了保证疫苗的安全性，本发明对制备的5批疫苗先后进行了“对小白鼠的安全性试验”、“对仔猪单剂量接种、单剂量重复接种、一次性超剂量(2倍剂量)接种的安全性试验”、“对妊娠母猪单剂量接种、单剂量重复接种、一次性超剂量(2倍剂量)接种的安全性试验”。试验结果表明，各免疫动物单剂量接种、单剂量重复接种、一次性大剂量接种后，猪只状态均良好，采食饮水正常，无异常反应；疫苗接种后对妊娠母猪的繁殖功能也无明显影响。以上试验均证明疫苗是安全的。在试行规程(草案)中规定：用2-3周龄健康易感仔猪(SVA PCR抗原检测为阴性，SVA血清中和抗体效价≤1:4)5头，每头肌肉接种疫苗4ml，连续观察14日，每头再注射疫苗4ml，连续观察14日，均应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

5.2效力检验标准的制定

5.2.1中和抗体效价与免疫攻毒保护相关性试验

将安全性试验合格的1批猪A型塞内卡病毒灭活疫苗，按照不同剂量0.5ml/头份、1ml/头份、2ml/头份、4ml/头份分别免疫2-3周龄健康易感仔猪(SVA PCR抗原检测为阴性；SVA血清中和抗体效价≤1:4)，并以A型塞内卡强毒滴鼻5ml(病毒含量为10^7.0TCID₅₀/ml)，以确定抗体滴度与免疫攻毒保护的相关性。试验结果表明，二免21天后血清中和抗体效价在1:16时，免疫猪具有攻毒保护效力，部分猪在攻毒后2～3天出现轻度腹泻症状，3日后恢复；当二免21天中和抗体效价在1:32时，免疫猪全部保护。因此，确定疫苗效力检验时，检验标准为二免21天后，其血清中和抗体效价≥1:32，免疫猪应全部保护。

5.2.2最小免疫剂量和最小使用剂量试验

将安全性试验合格的猪A型塞内卡病毒灭活疫苗(批号SY201606)，按照不同剂量0.5ml/头份、1ml/头份、1.5ml/头份、2ml/头份分别免疫2-3周龄健康易感仔猪，于免疫后14～21天加强免疫，采血进行测定中和抗体效价。结果显示，以0.5ml/头份剂量免疫猪二免21日后中和抗体效价介于1:10～1:16之间，而1ml/头份剂量免疫猪二免21日后中和抗体效价介于1:32～1:45之间，而2ml/头份剂量免疫猪二免21日后中和抗体效价介于1:32～1:64之间。根据中和抗体效价与攻毒保护相关性试验结果，确定在二免21天后中和抗体效价达到1:32以上时，可以完全保护2-3周龄仔猪抵抗猪A型塞内卡病毒强毒的攻击。考虑到疫苗的保存、运输和使用过程中可能存在的效价降低因素。本发明将猪A型塞内卡病毒灭活疫苗的最小免疫剂量确定为1ml/头份，使用剂量确定为2.0ml/头份。

6、抗体消长规律与免疫持续期试验

将安全性试验合格的3批猪A型塞内卡病毒灭活疫苗为SY201605、SY201606、SY201607分别免疫2-3周龄健康易感仔猪。检测免疫猪中和抗体水平的变化，分析抗体消长规律，为进一步掌握免疫效力及免疫持续期，制定合理的免疫程序。

试验结果表明，2-3周龄健康易感仔猪免疫2ml/头份，免疫后14-21天后加强免疫一次，在二免后210天，免疫仔猪血清中中和抗体仍不低于1:16，为保证疫苗的免疫保护效果，确定其免疫持续期为6个月。

7、免疫程序的确定

根据仔猪母源抗体的持续时间，3～4周龄仔猪的母源抗体已下降到较低水平(平均中和抗体效价低于1:8)，2周龄仔猪母源抗体较高介于1:10～1:16之间。2周龄仔猪母源抗体水平较高，对疫苗免疫效果有一定的影响，但3～4周龄仔猪母源抗体下降至较低水平，容易形成免疫空白期。在2周龄免疫时，随对疫苗免疫效果有一定影响，但是可以避免较长的免疫空白期；3～4周龄免疫时，对疫苗免疫效果影响较小能建立主动免疫，4周龄墓园抗体很低，存在感染风险。

根据免疫后的抗体消长规律、母源抗体变化规律、免疫期等情况，本发明确定了猪A型塞内卡病毒灭活疫苗免疫程序为：仔猪2-3周龄免疫1次，2-3周后加强免疫1次。每次免疫均为2ml/头，一年免疫一次。

8、疫苗的保存期

本发明对制备的3批灭活疫苗(SY201605、SY201606、SY201607)保存期进行了试验研究，将3批疫苗在2-8℃条件下保存3、6、9、12、18、21个月，在各时间段分别取样对其性状、安全性及免疫效力检测。结果显示，3批疫苗在2-8℃条件下保存21个月性状不发生明显变化，无菌检验和安全性都符合质量标准的要求，效力检验中二免21天后猪血清中和抗体效价仍高于1:32。考虑到疫苗在运输和使用过程中造成的效价损耗，将疫苗的保存期确定为2-8℃条件下保存18个月。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株，其特征在于，保藏号为CGMCC No.19990。

2.权利要求1所述猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株的以下任一应用：

1)用于制备疫苗；

3.一种组合物，其特征在于，其包含灭活后的权利要求1所述猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株以及药学上可接受的载体。

4.一种免疫原性组合物，其特征在于，其包含权利要求3所述的组合物。

5.一种疫苗组合物，其特征在于，其包含权利要求4所述的免疫原性组合物。

6.猪A型塞内卡病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将权利要求1所述猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株接种至易感细胞进行培养，得到病毒液；

(2)将收获的病毒液用BEI灭活；

(3)将灭活后的病毒液与佐剂混合，即得。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述易感细胞为ST细胞；和/或

步骤(3)所述佐剂为油佐剂，优选ISA 201VG。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：将收获的病毒液采用0.05％的二乙烯亚胺在30℃条件下灭活48小时后，加入0.02％硫代硫酸钠终止灭活。

9.权利要求5所述疫苗组合物或者按照权利要求6-8任一项所述方法制备的猪A型塞内卡病毒灭活疫苗在制备治疗或预防猪A型塞内卡病毒感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述疾病包括由猪A型塞内卡病毒感染引起的水疱性疾病。