CN113186170A - 一株猪轮状病毒株及其制备的灭活疫苗和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株猪轮状病毒株及其制备的灭活疫苗和用途，本发明首先公开了一株分离的猪A型轮状病毒RVA/Pig‑tc/CHN/SCMY‑A3/2017/G9P[23]型株(简称A3株)，其微生物保藏编号是V202132。本发明还公开了一种猪轮状病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：将包含A3株的病毒液与灭活剂混合，灭活后与佐剂混合，即得。利用本发明分离的猪轮状病毒制备得到的灭活疫苗能够产生较高的抗体水平，且能够抵抗病毒株的攻击。

Description

一株猪轮状病毒株及其制备的灭活疫苗和用途

技术领域

本发明涉及灭活疫苗的制备领域，具体涉及一株猪轮状病毒株及其制备的灭活疫苗和用途。

背景技术

A群轮状病毒(Group A rotavirus,RVA)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)，轮状病毒属(Rotavirus)，是无囊膜双链RNA病毒。RVA是一种重要的人畜共患病毒，是世界范围内引起婴幼儿和幼龄动物腹泻的重要病原之一，造成的经济损失重大。最初RVA被认为具有宿主特异性，而现在越来越多的流行病学资料表明，RVA可以从动物跨种间传播到人，也可以从一种动物跨种间传播到另一种动物。猪A群轮状病毒是导致仔猪严重腹泻的重要病原，受感染的仔猪主要表现为腹泻、脱水、呕吐、厌食等症状。VP7和VP4作为重要的结构蛋白决定了RVA的G型与P型，通常以VP7和VP4基因片段对应的基因型组合Gx-P[x]来表示毒株的基因型，且G型和P型之间会产生多种组合，不同组合的血清型之间交叉保护性低。迄今为止，在人源RVA毒株中，最常见的基因组合型为G1P[8]、 G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]、G9P[8]和G12P[8]，在猪中，已鉴定出RVA的12种 G型(G1-G6、G8-G12和G26)和16种P型(P[1]-P[8]、P[13]、P[19]、P[23]、 P[26]-P[28]、P[32]和P[34])。RVA的基因型复杂多样，G9型RVA被认为是人和猪中的一种新兴基因型，近年来G9型RVA也已成为中国大陆主要流行的基因型。在对2017～2018年四川地区24个猪场的腹泻仔猪粪便进行RVA的感染率及基因型的检测中，结果同样表明了G9型RVA为四川地区主要流行的基因型。

由于市场上还没有针对RVA感染的特效药物，接种疫苗是预防RVA感染的有效手段，目前动物RVA疫苗主要以减毒活疫苗为主，但减毒活疫苗在应用上会伴随着毒力返强等问题，相比之下，灭活疫苗更安全，且灭活疫苗在动物模型上也表现了很好的免疫原性，但目前市场上的猪轮状病毒灭活疫苗存在抗体水平低，免疫性不强的问题，因此，如何能制备出抗体水平高的猪轮状病毒灭活疫苗，是本领域亟待解决的一个技术难题。

发明内容

本发明的目的是提供一株猪轮状病毒株及其制备的灭活疫苗以及猪轮状病毒株制备的灭活疫苗在防治猪轮状病毒中的用途，制备得到的灭活疫苗安全性、抗体水平高，且能够抵抗异种病毒株的攻击。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一株分离的猪轮状病毒 RVA/Pig-tc/CHN/SCMY-A3/2017/G9P[23]型株(简称A3株)，保藏编号为V202132，其11个基因节段的GenBank登录号分别为：MK026435～MK026445，保藏编号为V202132轮状病毒G9P[23]型病毒株。

本发明还提供了一种上述猪轮状病毒株在制备猪轮状病毒诊断试剂中的用途；

进一步地，所述用途为制备猪轮状病毒株与致病性病原体、抗原、抗体以及核酸检测相关的试剂。

本发明还提供了一种上述猪轮状病毒株在制备预防和/或治疗猪轮状病毒感染的疫苗中的用途。

本发明所述治疗是指部分或完全缓和、抑制猪轮状病毒的一种或多种症状或表现形式，延迟其发作，降低其发生，对其产生防治、改善和/或减轻。

进一步地，所述疫苗中还包括药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂，优选为佐剂，进一步优选为油佐剂，更进一步优选为法国SIPPEC公司MONTANID ISA 201VG佐剂。

本发明所述药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂是指，在与本发明灭活病毒株一起配制时，不破坏灭活病毒株的药理学活性的无毒载体、佐剂或稀释剂。

本发明还提供了一种猪轮状病毒灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：将包含上述病毒株的病毒液与灭活剂混合，灭活后再与佐剂混合，即得。

进一步地，所述病毒液的制备方法包括：将保藏编号为V202132的A型轮状病毒RVA/Pig-tc/CHN/SCMY-A3/2017/G9P[23]轮状病毒株与宿主细胞共培养，冻融宿主细胞，离心收获上清，即得病毒液。

进一步地，病毒株在与宿主细胞共培养前先用胰蛋白酶处理，优选为TPCK 胰酶处理；

所述宿主细胞为MA-104细胞；

所述共培养步骤为：在温度为25～39℃、3～7％CO₂条件下，将病毒液接种至经清洗液清洗过的单层培养的宿主细胞上，孵育0.5～1.5h后弃悬液，加入维持液，在同样的培养条件下孵育，至细胞病变(CPE)占比70～90％时，进行下一步冻融操作；

优选的，培养条件为：温度为37℃、5％CO₂，孵育1h后弃悬液；至细胞病变(CPE)占比80％时，进行下一步冻融操作。

进一步地，所述清洗液为Hank's液，维持液为含1％双抗的DMEM。

进一步地，所述灭活剂选自β-丙内酯；

进一步地，所述β-丙内酯的质量体积分数为0.1～0.075％，优选为0.025～0.05％，更优选为0.025％；

所述灭活的条件为：温度为25～39℃、灭活时间4～24h；

优选为温度37℃、灭活时间12h。

进一步地，灭活后的病毒液：佐剂的重量为1:1；

与佐剂混合的反应条件为：温度28～35℃，200～400r/min搅拌3～8min，优选为，温度30～32℃，350r/min搅拌5min。

本发明提供的一种猪轮状病毒灭活疫苗，其由上述方法制备得到。

本发明的有益效果是：

本发明病毒株具有致病性，对采用本发明病毒株制备得到的疫苗株做免疫性检验试验，结果表明，本发明猪轮状病毒A3株具有良好的安全性、免疫原性，能够产生较高的中和抗体水平，异源中和抗体效价为1:(89±14.76)、 1:(78.33±12.57)，能够对病毒的攻击产生一定的抵抗力，可实现规模化生产，具有很好的商品化开发前景。

附图说明

图1为RVA毒株感染乳鼠体重增长的变化图；

图2为不同灭活条件对细胞的病变影响图；

图3为病毒液的灭活检验图；

图4为灭活疫苗的中和抗体效价；

图5为荧光定量RT-PCR检测疫苗免疫组和阴性对照组粪便中的轮状病毒RNA图；

其中，图1、图4、图5中，差异显著(p<0.05)表示为*，差异极显著(p <0.01)表示为**；图2中，灭活剂浓度A为0.025％；B为0.05％；C为0.075％； D为0.1％；灭活时间：E为4h；F为6h；G为12h；H为24h；图3中，A：RVA 阳性对照组产生细胞病变；B：RVA/Pig-tc/CHN/SCMY-A3/2017/G9P[23]分离株。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实验数据表示为平均值±标准差，每个值都是三次独立实验的结果。

主要试剂与仪器

MA-104传代细胞系(ATCC CRL-2378.1)，由西南民族大学生命科学与技术学院预防兽医实验室保存。

Trizol^TM Reagent、Primescript^TM和TB Green II购于TaRaKa公司；DMEM 培养基、0.25％Trypsin-EDTA(1×)胰酶、双抗(青霉素链霉素)和DMSO细胞冻存液购自Gibco公司；TPCK胰蛋白酶购自SIGMA公司；胎牛血清购自 Biological Indusries公司；一抗：兔抗轮状病毒VP6基因多克隆抗体，由本实验室制备并保存；二抗：

Boost IHCDetection Reagent(HRP,Rabbit) 购自美国Cell Signaling Technology公司；PBS购自KPL公司。荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，型号为：QuantStudio 3；高速离心机购自四川蜀科仪器有限公司；恒温培养箱购自美国Thermo公司；移液器购自德国Eppendorf公司；Milli-Q 纯水仪购自法国Millipore公司；荧光倒置显微镜购自日本Olympus Corporation公司。

实施例1猪轮状病毒株的分离和致病性鉴定

猪轮状病毒株的分离

取适量粪便样本与PBS缓冲液，按照1:10的比例混合涡旋，反复冻融三次后，离心后吸取上清液，用直径大小为0.22μm的滤器过滤除菌。将经处理后的样本用终浓度为30μg/mL的胰蛋白酶(TPCK胰酶)在37℃、5％CO₂的条件下作用1h，接种于单层MA-104细胞，置于37℃，5％CO₂培养箱培养，观察细胞状态，直至细胞病变(CPE)到80％左右时将细胞培养物置于-80℃冰箱迅速冷冻，反复冻融3次后离心收获上清病毒液。利用噬斑技术对病毒液进行3次纯化。利用免疫荧光技术验证分离株为猪A群轮状病毒。

按照用A群猪轮状病毒的VP7特异性引物对F: CCCCGGTATTGAATATACCACAGT，R:TTTCTGTTGGCCACCCTTTAGT；和 VP4的特异性引物F:GGCTATAAAATGGCTTCDCTMAT，和R：ATTTCRGACCATTTATAMCC，对病毒细胞培养物进行RT-PCR扩增，分别得到 333bp和890bp的目的基因片段，测序获得相应的序列，利用在线分型工具RotaC V20对分离病毒的基因型进行鉴定。结果表明从腹泻仔猪的粪便样本中分离出病毒基因型为G9P[23]型，命名为RVA/Pig-tc/CHN/SCMY-A3/2017/G9P[23](简称A3毒株)病毒滴度为：10^5.8TCID₅₀/100μL，为致细胞病变型且经扩繁后保存于-80℃。

生物保藏信息

将所分离的猪轮状病毒G9P[23]株提交到中国典型培养物保藏中心进行保藏，其中，猪轮状病毒G9P[23]株的微生物保藏号是：V202132；分类命名是：猪呼肠孤病毒RVA/Pig-tc/CHN/SCMY-A3/2017/G9P，拉丁文学名是Rotavirus Group A rotaviruses AnimalVirus，保藏时间：2021年4月25日，保藏地址：中国武汉大学。

致病性鉴定

实验方法

1.实验动物

SPF级BALB/c孕鼠(妊娠期17～20d)10只，购自成都达硕实验动物有限公司。所有实验动物的饲养和使用均遵循西南民族大学发布的《实验动物饲养和使用指南》，实验动物合格证号为SYXK2011-043。

收集BALB/c孕鼠血清与粪便，通过病毒中和试验或荧光定量RT-PCR检测孕鼠体内是否有轮状病毒抗体或病毒RNA。孕鼠在分娩之前需单笼饲养，添加足够的SPF级鼠粮和无菌饮用水，保证充足且干净的垫料，分娩后不再换垫料，避免母鼠受刺激后致使乳鼠死亡。10只孕鼠共分娩70只乳鼠，待分娩3～4d后剔除体重差异较大的乳鼠，并对其进行分组。每两笼乳鼠为一组，平均分配使每组12只乳鼠，共2组，分别为RVA/Pig-tc/CHN/SCMY-A3/2017/G9P[23]组和阴性对照组(简称A3组和对照组)。

2.BALB/c乳鼠攻毒、腹泻观察

BALB/c乳鼠攻毒前与母鼠分开，在恒温灯下饥饿处理1h，4组攻毒组每只乳鼠灌胃接种A3毒株200μL。阴性对照组每只乳鼠灌胃接种200μL DMEM培养液。攻毒后观察96h，每24h对乳鼠称重并记录，通过以下公式计算的归一化增重(％)：归一化增重(％)＝(接种后Xh的体重-接种后24h的体重)/(接种后24h的体重)；每24h定时观察3次乳鼠的腹泻情况，有1次处于腹泻状态即认定该乳鼠当天发生腹泻。通过粪便的颜色、质地和数量对腹泻的严重程度进行评分(1-无或正常粪便；2-软便至稀便；3-水样便)，腹泻评分为1和≥2的小鼠分别视为正常和腹泻，腹泻评分为3分被认为是重度腹泻。每24h收集乳鼠粪便，用PBS(pH＝7.4)处理并保存于-80℃。

2.数据分析

运用软件GraphPad Prism 6.01对实验数据进行分析并作图，使用IBM SPSSStatistics 26.0统计软件程序的一般线性模型程序对攻毒后每个时间点(24h、48 h、72h和96h)攻毒组和阴性对照组乳鼠之间进行单因素方差分析(ANOVA)。使用Duncan多重比较检验确定组平均值之间的差异。p<0.05视为具有统计学显著性。

4.试验结果

BALB/c乳鼠攻毒后的临床表现及体重增重的变化

攻毒组的BALB/c乳鼠通过灌胃攻毒后，均发生了不同程度的腹泻，腹泻持续时间一致，部分乳鼠可观察到肛周或腿部有粪便污染，精神状态与活动状态均无太大变化。对照组的乳鼠在观察期间未见腹泻及其他异常状况。

监测攻毒后攻毒后0～96h(hpi)乳鼠的日增重，结果显示，感染A3分离株的乳鼠在48hpi体重增加严重减少，为0.267±0.138g。尽管它们的体重增加在 72hpi时有所增加(0.467±0.063g)，但实际体重增加仍显著低于对照组 (1.186±0.054g)(p<0.01)(图1)。结果表明，RVA感染可影响BALB/c乳鼠早期72h体重的生长。

BALB/c乳鼠攻毒后的腹泻情况

BALB/c乳鼠通过灌胃攻毒后，在24hpi后均出现腹泻症状，粪便呈黄色、稀软，腹泻评分为2±1，腹泻症状一直持续到72hpi，严重腹泻症状可持续24～48h，大部分乳鼠严重腹泻发生在48hpi～72hpi，粪便呈黄色、水样，部分乳鼠肛周或腿部有粪便污染，腹泻评分为3±1，96hpi时所有乳鼠的腹泻症状已逐渐减轻。对照组所有乳鼠均未发生腹泻，粪便呈棕色。可见，本发明所分离的A3分离株株为致病性猪轮状病毒。

实施例2猪轮状病毒株灭活疫苗的制备

1.方法

(1)猪G9 RVA病毒液的制备

先将纯化的A3分离株用终浓度30μg/mL的胰蛋白酶(TPCK胰酶)在37℃、 5％CO₂的条件下作用1h，接种于MA-104细胞，37℃，5％CO₂培养箱孵育1h，每20min轻晃1次；孵育后弃掉悬液，同时加入35～40mL维持液(含1％双抗的DMEM)，置于37℃，5％CO₂培养箱培养；每天观察细胞状态，直至细胞病变(CPE)到80％左右时将细胞培养物置于-80℃冰箱迅速冷冻，反复冻融3次后离心收获上清病毒液，将病毒液扩繁至100mL备用。

(2)灭活剂的条件优化

选取β-丙内酯作为灭活剂，将灭活剂设置为不同浓度(0.1％、0.075％、0.05％和0.025％)和不同灭活时间(4h、6h、12h和24h)，具体操作如下：

取经过MA-104细胞扩繁后的A3分离株病毒液与相应浓度的灭活剂充分混合，置于37℃恒温振荡培养箱内进行灭活。将灭活后的病毒液接种到生长良好的单层MA-104细胞上，置于37℃含5％CO₂的细胞培养箱中，每天观察细胞状态，培养3～4d，选取最佳条件的灭活剂浓度及灭活时间。

(3)猪G9 RVA灭活疫苗的制备及质量检验

将按照(2)得到的最优条件灭活的A3分离株接种到2瓶25cm²生长良好的单层MA-104细胞上，并同时设立DMEM阴性对照，接种到MA-104细胞上，置于37℃、5％CO2的恒温培养箱内进灭活48～72h，观察CPE。

量取20mL经检验后灭活完全的A3分离株细胞培养物与等体积的 MONTANID ISA201VG佐剂，将其同时水浴加热至31℃±1℃，将二者混合后在搅拌器内以350r/min的转速搅拌5min，搅拌完成后，将疫苗4℃放置过夜后进行疫苗的质量检测。

无菌检测：将A3分离株灭活疫苗100～200μL涂布于LB培养基上，37℃培养24h后观察有无细菌生长。

剂型检测：吸取少量A3分离株灭活疫苗滴于去离子水中，观察疫苗的扩散情况，若灭活疫苗与去离子水均匀混合，则制备的灭活疫苗为水包油包水灭活疫苗。

初步稳定性检验：吸取1mL疫苗到1.5mL离心管中，以3000r/min、4℃的条件离心15min，观察疫苗有无分层情况。

安全性检测(动物接种法)：A3分离株灭活疫苗在室温下回温，分别通过颈部皮下注射的方式接种6～8周龄SPF级BALB/c雌鼠，接种剂量为1mL/只，接种后饲养于西南民族大学实验室无菌条件的动物房，并观察其采食和精神状态、注射部位有无红肿等异常情况。

2.试验结果

灭活条件优化结果如图2所示，当灭活剂β-丙内酯终浓度为0.05％、0.075％、0.1％时，部分细胞发生圆缩甚至脱落等现象，灭活时间为4h、6h、12h时，部分细胞圆缩，细胞间距增大，当灭活时间为12h时，细胞生长良好且未发生病变；当灭活剂β-丙内酯的终浓度为0.025％，灭活时间为12h时，接种A3分离株细胞培养物的MA-104细胞生长良好且未发生病变(图2A、G)；因此，本发明的最佳灭活条件为：终浓度为0.025％的β-丙内酯灭活剂在37℃恒温震荡培养箱内灭活12h。

灭活检验结果如图3所述，接种未灭活的A3分离株的MA-104细胞出现细胞脱落、圆缩、拉丝、脱落的细胞聚集成团块等RVA典型的细胞病变(图3A)，而接种灭活后的A3分离株的MA-104细胞生长良好，未出现细胞病变(图3B)，说明SCMY-A3病毒液灭活完全，可用于后期的疫苗制备。

对灭活疫苗进行质量检验结果显示，对A3分离株灭活疫苗进行无菌检验，结果显示LB培养基中无其他细菌生长；剂型检验结果显示，灭活疫苗与去离子水混合均匀，说明本研究所制备的A3分离株灭活疫苗为水包油包水型疫苗；稳定性检验结果显示A3分离株灭活疫苗在3000r/min、4℃的条件下离心15min 后未见分层，可见A3分离株灭活疫苗稳定性好；安全性检验结果显示A3分离株灭活疫苗接种的BALB/c小鼠精神饱满，食欲正常，注射部位吸收良好，无任何不良反应及红肿等异常现象，表明本发明所制备的A3A3分离株灭活疫苗具有良好的安全性，可用于后续实验。

试验例1灭活疫苗免疫效果的检测

(1)猪G9 RVA灭活疫苗免疫BALB/c小鼠的试验

选取6～8周龄SPF级BALB/c雌鼠18只，随机分为3组。采集每只雌鼠的血清和粪便样本，并通过病毒中和试验检测RVA抗体、荧光定量RT-PCR检测病毒RNA。通过颈部皮下注射的方式免疫小鼠。第1组小鼠接种0.5mL混合 MONTANID ISA 201VG佐剂的DMEM作为阴性对照组；第2组小鼠接种0.5mL A3灭活疫苗。一免2周后，2、3组雌鼠以同种剂量、同种方式加强免疫0.5mL 灭活疫苗。在二免后0、7、14、28、42、56d用毛细玻璃管通过眼眶采血法采集小鼠血液。将收集的血液以5000r/min、4℃的条件离心10min，将分离的血清放置于-80℃冰箱保存备用。此外，在二免当晚每组分出3只雌鼠与6～8周龄 SPF级BALB/c雄鼠按照1雄2雌的交配方式同笼交配，同笼2晚后移出雄鼠，每只雌鼠单笼饲养。

(2)病毒中和抗体试验

A3分离株用终浓度为30μg/mL的胰蛋白酶(TPCK胰酶)在37℃、5％CO₂的条件下预激活1h；将收集的血清在56℃恒温水浴锅中热灭活处理30min；将灭活后的血清用DMEM细胞培养液做连续两倍稀释后加入96孔细胞培养板，每个稀释度3孔，每孔50μL；将预激活的RVA株稀释至200TCID₅₀，并与稀释后的血清混合，每孔50μL，在37℃、5％CO₂下孵育1h；，取出生长成单层MA-104 细胞的96孔细胞板用Hank's溶液洗涤3次后，将每种混合物转入96孔板中，每孔100μL，再加入维持液(含1％双抗的DMEM)，每孔50μL，在37℃、5％CO₂条件下孵育72～96h，按照Reed-Muech氏法计算血清中和抗体效价。

(3)乳鼠攻毒保护试验

在免疫灭活疫苗的母鼠和阴性对照组的母鼠所产的乳鼠中，每组选取5只体重差异不大的乳鼠，标记为A3疫苗免疫组和对照组。在乳鼠3～4d时对其攻毒，攻毒前与母鼠分开，在恒温灯下饥饿处理1h，疫苗免疫组每只乳鼠分别灌胃接种A3毒株200μL。对照组每只乳鼠灌胃接种200μL病毒液。攻毒后观察96h，每24h对乳鼠称重并记录；每24h定时观察3次乳鼠的腹泻情况，有1次处于腹泻状态即认定该乳鼠当天发生腹泻，评价乳鼠的腹泻程度。每24h收集乳鼠粪便，用PBS(pH＝7.4)处理并保存于-80℃。待攻毒96h后同时提取样本核酸，对样本进行RVA的测定。

(4)数据分析

运用软件GraphPad Prism 6.01对实验数据进行分析并作图，使用IBM SPSSStatistics 26.0统计软件程序(Chicago,IL,USA)的一般线性模型程序对免疫后不同天数的血清抗体效价之间进行单因素方差分析(ANOVA)。使用Duncan多重比较检验确定组平均值之间的差异。p<0.05视为具有统计学显著性。

3.实验结果

中和抗体效价试验结果如图4，在A3分离株灭活疫苗二免后，小鼠可产生较高的血清抗体，而在接种混合佐剂的DMEM培养液的阴性对照组中，所有小鼠均未检测出抗体滴度。其中，BALB/c小鼠均在二免后7d产生最高的抗体效价，为1:(232±39.28)。在此之后，小鼠产生的中和抗体效价开始逐渐下降。二免后14d产生的抗体效价为1:(179.33±21.94)，直至二免后56d，小鼠所产生的抗体效价为1:(11.67±2.52)，可以看出，A3灭活疫苗可在雌性小鼠体内产生较高的抗体。

攻毒保护试验中，二免后32d，灭活疫苗免疫的母鼠及阴性对照组的母鼠产下乳鼠，每组均仅有2只母鼠配种成功，共获得20只乳鼠，此时母鼠的中和抗体效价约为1:(98±18.49)，如图5。用同源毒株对乳鼠攻毒结果显示，疫苗免疫组的乳鼠未观察到腹泻，而阴性对照组的乳鼠在48hpi时观察到严重腹泻，腹泻评分为3分。

此外，通过荧光定量RT-PCR检测疫苗免疫组和阴性对照组粪便中的轮状病毒RNA，检测结果见表1：

表1荧光定量RT-PCR检测疫苗免疫组和阴性对照组粪便中的轮状病毒RNA

单位：Copies/100mg sample。

表1结果显示，疫苗免疫组的乳鼠和阴性对照组乳鼠的粪便中均检测到了 RVA，且疫苗免疫组的乳鼠粪便中的病毒RNA的拷贝数显著低于阴性对照组，可见，本发明灭活疫苗免疫母鼠后可以保护其子代免受RVA感染。

综上所述，本发明A3分离株具有很好的致病性，采用上述病毒株制备的水包油包水型灭活疫苗具有很好的安全性、稳定性，产生的抗体水平高，产生的抗体能够抵抗异种病毒株的攻击。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的保护范围，凡是利用本发明的说明书所作的等效流程或等效结构的变换，或直接、或间接运用在其他相关的技术领域，均应同理包括在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株分离的猪轮状病毒株，其特征在于，保藏编号为V202132的A型轮状病毒RVA/Pig-tc/CHN/SCMY-A3/2017/G9P[23]病毒株，其11个基因节段的GenBank登录号分别为：MK026435～MK026445。

2.权利要求1所述的猪轮状病毒株在制备猪轮状病毒诊断试剂中的用途；

进一步地，所述用途为制备猪轮状病毒株与致病性病原体、抗原、抗体以及核酸检测相关的试剂。

3.权利要求1所述的猪轮状病毒株在制备预防和/或治疗猪轮状病毒感染的疫苗中的用途。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述疫苗中还包括药学上可接受佐剂，优选为油佐剂，更优选为法国SIPPEC公司MONTANID ISA 201 VG佐剂。

5.一种猪轮状病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将包含权利要求1所述病毒株的病毒液与灭活剂混合，灭活后再与佐剂混合，即得。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述病毒液的制备方法包括：将保藏编号为V202132的轮状病毒株与宿主细胞共培养，冻融宿主细胞，离心收获上清，即得病毒液。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，病毒株在与宿主细胞共培养前先用胰蛋白酶处理，优选为TPCK胰酶处理；

所述宿主细胞为MA-104细胞；

所述共培养步骤为：在温度为25～39℃、3～7％CO₂条件下，将病毒液接种至经清洗液清洗过的单层培养的宿主细胞上，孵育0.5～1.5h后弃悬液，加入维持液，在同样的培养条件下孵育，至细胞病变(CPE)占比70～90％时，进行下一步冻融操作；

优选的，培养条件为：温度为37℃、5％CO₂，孵育1h后弃悬液；至细胞病变(CPE)占比80％时，进行下一步冻融操作。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述清洗液为Hank's液，维持液为含1％双抗的DMEM。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述灭活剂选自为β-丙内酯；

进一步地，所述β-丙内酯的质量体积分数为为不高于0.05％，优选为不高于0.025％，进一步优选为0.025％；

所述灭活的条件为：温度为25～39℃、灭活时间4～24h；

优选为温度37℃、灭活时间12h。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，灭活后的病毒液(TCID₅₀＝10^5.8/100μL)：佐剂的体积比1:1；

与佐剂混合的反应条件为：温度28～35℃，200～400r/min搅拌3～8min，优选为，温度30～32℃，350r/min搅拌5min。

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