CN111686246B - 一种用于猪流行性腹泻病毒的抗原抗体复合物疫苗及其制备方法 - Google Patents
一种用于猪流行性腹泻病毒的抗原抗体复合物疫苗及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于猪流行性腹泻的病毒抗原抗体复合物疫苗及其制备方法，属于兽用疫苗技术领域。所述抗原抗体复合物疫苗由体积比为1:5的猪流行性腹泻病毒抗原与猪流行性腹泻病毒抗体充分混合，加入终浓度为1000UI/mL的青霉素和1000ug/mL的链霉素，温度37℃条件下孵育2h获得。本发明抗原抗体复合物疫苗无需对抗原进行灭活，可使其中的活病毒得到有效保护，从而诱导免疫器官产生更多的免疫生发中心。复合物疫苗中抗体起着延缓病毒释放的作用，其中抗体的Fc片段使复合物更易被抗原提呈细胞捕获，从而引起免疫应答。本发明的病毒抗原抗体复合物疫苗既能突破母源抗体又能诱导高效价抗体，对哺乳仔猪、后备猪、母猪及其后代仔猪均具有良好的免疫效果和攻毒保护率。
Description
技术领域
本发明属于兽用疫苗技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒抗原抗体复合物疫苗及其制备方法。
技术背景
猪流行性腹泻病毒 ( porcine epidemic diarrhea virus，PEDV) 是一种能够引起猪的急性肠道传染病。感染猪主要症状为剧烈腹泻、呕吐和脱水；该病毒只感染猪，各种年龄和品种的猪均易感。PEDV的感染方式主要是通过被感染猪的粪便等经由消化道感染，其中受到的危害最严重的是哺乳仔猪，其发病死亡率高达80～100%，该病毒感染是导致仔猪早期死亡的主要疫病之一。我国最早在1976年首次报道该病的出现，在2010以后在我国多个省份爆发PEDV的感染，给我国的生猪养殖产业造成了巨大的经济损失。
目前生产上对于PEDV的防控，主要是采用传统疫苗，包括组织灭活苗、细胞灭活苗及弱毒疫苗，这些疫苗在PEDV的防治中起着重要的作用，传统疫苗均是免疫母猪从而使哺乳期仔猪获得先天免疫或通过采食初乳获得被动性免疫，但由于疫苗接种不当或母猪的健康状况不良等因素致使疫苗接种后的母猪不能产生足够的保护性抗体，无法给仔猪提供足以抵御病毒感染的免疫力，并且由于仔猪在整个哺乳期均面临PEDV感染的风险，而随着母源抗体的消失和开食后母乳摄入的减少，形成了仔猪免疫的空白期，增加了PEDV感染的风险。
抗原抗体复合物疫苗又称免疫复合物疫苗，是20世纪90年代发展起来的一种新型疫苗，由特异性高免血清按照恰当的比例与抗原混合而成，其优点包括可以突破母源抗体干扰,产生主动免疫，抗原抗体复合物疫苗中的抗体主要作用是延缓病毒的释放。病毒与抗体形成复合物以后, 由于抗体分子的 Fc片段与抗原提呈细胞（APC）的Fc受体有很高的亲合性, 因而使得与抗体结合的病毒更易更有效地与 APC结合，从而激活B 淋巴细胞和 T淋巴细胞,刺激B 淋巴细胞成为抗体分泌细胞，诱导机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫。并且在与其他疫苗同时接种时，不影响其他疫苗的免疫效果。基于以上优点近年来在动物疫病防控中的作用越来越受到关注。
发明内容
为了解决传统疫苗不适用于仔猪免疫从而造成仔猪在哺乳期的免疫保护不足，感染PEDV的风险增加的问题，本发明提供一种猪流行性腹泻病毒抗原抗体复合物疫苗及其制备方法。
一种用于猪流行性腹泻病毒的抗原抗体复合物疫苗，由体积比为1:5的猪流行性腹泻病毒抗原与猪流行性腹泻病毒抗体充分混合，加入终浓度为1000UI/mL的青霉素和终浓度为1000ug/mL的链霉素，温度37℃条件下孵育2h制得；
所述猪流行性腹泻病毒抗原是将猪流行性腹泻临床病料的毒株接种vero细胞培养，传代至40～45代，所得到细胞半数感染量（TCID50）为10-5/mL～10-6/mL的猪流行性腹泻病毒即为病毒抗原液；
所述猪流行性腹泻病毒抗体是将配制的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗通过对实验猪的加强免疫，获得实验猪的血清抗体，抗体效价不低于1:128的血清抗体即为病毒抗体；
所述猪流行性腹泻临床病料的毒株已于2019年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心保存，地址：中国 武汉 武汉大学， 保藏编号为CCTCC NO:V201915。
一种用于猪流行性腹泻病毒的抗原抗体复合物疫苗的制备操作步骤如下：
（1）制备猪流行性腹泻病毒的病毒抗原液
将浓度104/mL的vero细胞液接种于25cm2的细胞培养瓶中，加入6mL含10%胎牛血清的DMEM培养基，温度37℃、浓度5%的二氧化碳气体条件下，通气培养2～3天；显微镜观察，当细胞铺满至90%时,用D-Hanks缓冲液清洗细胞面2次；将1mL种毒液接种于25cm2的细胞培养瓶，加入终浓度为5ug/mL的胰蛋白酶，混合均匀，在温度37℃、浓度5%的二氧化碳气体条件下，通气孵育2h，每30分钟轻摇培养瓶1次；孵育完成，用D-Hanks缓冲液清洗细胞面1次，加入5mL无血清细胞培养液和终浓度为5ug/mL的胰蛋白酶，温度37℃、浓度5%的二氧化碳气体条件下，继续培养3-4天；
所述猪流行性腹泻临床病料的毒株以种毒液形式保藏于中国典型培养物保藏中心；
当细胞培养物出现明显的细胞核增大、细胞皱缩、脱落和溶解时，收集细胞和培养液，反复冻融3次，转速5000r/min条件下离心5min，取上清液；至此病毒完成1次传代,接着重复上述传代操作，传代次数在40～45次；
对上清液进行测定TCID50，满足TCID50为10-5/mL～10-6/mL的病毒液即为病毒抗原液；
（2）制备猪流行性腹泻病毒的病毒抗体
在病毒抗原液中加入终浓度为5mmol/L的二乙烯亚胺（BEI），灭活24h；使用10kd超滤管进行20倍浓缩，在浓缩液中按浓缩液总量25%的量加入氢氧化铝胶佐剂，充分混匀，即得到猪流行性腹泻病毒的灭活疫苗；
采用所述灭活疫苗对60kg体重的实验猪进行三次免疫接种，在最后一次加强免疫接种后的第7天，采集实验猪血液；
将实验猪血液在转速5000 r/min条件下离心10min，取血清，在温度56℃的水浴条件下灭活30 min，-20℃保存；采用琼脂扩散实验测定血清抗体效价，血清抗体效价不低于1:128的高免血清即为病毒抗体；
（3）制备抗原抗体复合物
将所述病毒抗原液和所述病毒抗体按体积比1：5充分混合，加入终浓度为1000UI/mL的青霉素和终浓度为1000ug/mL的链霉素，温度37℃条件下孵育2h，获得抗原抗体复合物，按抗原抗体复合物总量0.005%的量加入浓度10%的硫柳汞溶液，充分混合即为抗原抗体复合物疫苗。
进一步限定制备方法的技术方案如下：
步骤（2）中，所述实验猪为清洁级实验猪，不携带所规定的重要人兽共患病病原、猪烈性传染病病原以及不携带所规定的对猪危害大和对科学研究干扰大的病原的实验用猪。
步骤（2）中，实验猪的具体免疫操作如下：灭活疫苗免疫采用后海穴注射接种，进行3次接种；第一次接种剂量为4mL/只，在第一次接种后的第14天和第28天分别加强免疫接种一次，接种剂量均为5mL/只。
将所述抗原抗体复合物疫苗通过0.22um的滤膜过滤除菌，并分装于50mL灭菌玻璃瓶中，置于4℃保存。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
（1）本发明采用临床分离猪流行性腹泻病毒致病毒株，该病毒株的毒力较强，但是就疫苗的效果来说，毒力越强的毒株免疫原性越好，越能够刺激机体产生主动免疫；由于毒力强采用强毒株制作的疫苗一般是灭活疫苗，但灭活疫苗液存在免疫反应持续时间较短，需要多次接种、诱导的免疫反应水平较低，以及灭活疫苗中存在灭活剂对病毒抗原存在影响等缺点。本发明抗原抗体复合物疫苗无需对病毒抗原进行灭活，不破坏病毒抗原的完整性，抗原抗体复合物可使其中的活病毒得到有效保护，从而诱导器官产生更多的免疫生发中心。抗原抗体复合物中的抗体可Fc片段更易与抗原递呈细胞(APC)结合，有效地激活淋巴T细胞,释放细胞因子。对40日仔猪分别进行灭活疫苗和本发明复合物疫苗进行3次免疫接种试验，分别在每次接种后的第7天采血，测定血清抗体效价，结果显示，本发明抗原抗体复合物疫苗的平均抗体效价分别为1:23.115、1:24.874和1:26.874，灭活疫苗平均抗体效价分别为1:22.737、1:24.737和1:26.874，抗原抗体复合物疫苗接种较灭活疫苗在早期能够诱导更高的水平的血清抗体。
（2）本发明抗原抗体复合物疫苗可免疫哺乳仔猪，疫苗效果不受母源抗体的影响，接种后仔猪可产生主动免疫。哺乳期的仔猪虽然有来源于母猪乳汁中IgA或IgG抗体的被动保护，但仍有强毒株感染的风险，在母源抗体存在的情况下灭活疫苗和弱毒疫苗的免疫效果均会受到影响。复合物疫苗的作用效果不会因母源抗体或乳汁中免疫球蛋白的存在而受到影响。采用抗原抗体复合物疫苗对3日仔猪进行后海穴注射免疫，分别在第1、6、12和18天采血观察血清抗体变化情况，结果显示，在免疫后的第6天，仔猪的血清抗体水平开始维持缓慢上升的趋势，而对照组的血清抗体水平则逐渐降低。结果表明本发明抗原抗体复合物疫苗可免疫哺乳仔猪，可产生主动免疫。
（3）本发明抗原抗体复合物疫苗的保护率高，对3日龄仔猪免疫后攻毒的保护率在80%。对怀孕母猪产前进行2次后海穴注射免疫，后代仔猪3日龄进行攻毒，抗原抗体复合物疫苗的保护率为83.33%，与弱毒疫苗的保护率相同，高于灭活疫苗免疫的保护率。
（4）本发明抗原抗体复合物疫苗安全性高，高毒力毒株制备疫苗对疫苗安全性要求较高，本发明通过病毒抗原与抗体1:5比例的混合，抗原抗体复合物疫苗中的抗体主要作用是延缓病毒的释放，即当抗体水平降低到一定水平时，抗原抗体复合物疫苗中的抗原开始释放复制并产生免疫保护力，因此比普通疫苗的安全性更高。对免疫仔猪的粪便进行猪流行性腹泻病毒核酸的荧光PCR检测，未检测到粪便排毒。
附图说明
图1为复合物疫苗对3日仔猪进行免疫后的抗体水平变化图。
图2为灭活疫苗和复合物疫苗对40日后备猪进行免疫后的抗体水平变化图。
图3为不同疫苗免疫母猪PEDV的血清抗体效价变化图。
具体实施方式
为了便于理解，下面结合实施例对本发明予以进一步阐述。
以下实施例所用材料的来源和设备说明如下：
以下材料由市场购得：青霉素、链霉素、胎牛血清、DMEM细胞培养液、D-Hanks缓冲液、胰蛋白酶、二乙烯亚胺、氢氧化铝胶佐剂、硫柳汞。
电子分析天平（精确到千分之一）、恒温干燥箱(物品清洗后烘干)、高压灭菌锅（试剂配制物品高压灭菌）、水浴锅、恒温孵育箱、细胞培养瓶（25cm2）、96孔细胞培养板、10kd超滤离心管、控温离心机、锥形瓶（1000mL）、容量瓶（1000mL）、10mL采血管、15mL试管、1.5mL试管、100mL溶液分装瓶、0.22um滤器、50mL注射器、移液器。
实施例1
一种猪流行性腹泻病毒抗原抗体复合物疫苗的制备方法的具体操作步骤如下：
（1）制备猪流行性腹泻病毒的病毒抗原
（1.1）抗原种毒
制苗用猪流行性腹泻病毒毒株（SD株）由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所分离、鉴定、保管和供应，该毒株已于2019年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心保存，地址：中国 武汉 武汉大学，命名为：猪流行性腹泻病毒SD株；保藏编号为CCTCC NO：V201915。
（1.2）猪流行性腹泻病毒抗原液的制备
接种用的vero细胞培养于25cm2的细胞培养瓶，采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。显微镜观察，当细胞铺满至90%时,用D-Hanks缓冲液清洗细胞面2次；将1mL种毒液接种于25cm2的细胞培养瓶，加入终浓度为5ug/mL的胰蛋白酶，轻晃培养瓶使病毒液均匀铺于细胞面，温度37℃、浓度5%的二氧化碳气体条件下，通气孵育2h，每30分钟轻摇培养瓶1次；孵育完成后用D-Hanks缓冲液清洗细胞面1次，加入5mL无血清细胞培养液和终浓度为5ug/mL的胰蛋白酶，温度37℃、浓度5%的二氧化碳气体条件下，继续培养3-4天；当接毒后的细胞出现明显的细胞皱缩、细胞核变大、细胞脱落、溶解等病变后收集细胞和培养液，反复冻融3次，5000r/min离心5min，取上清液分装于无菌玻璃瓶中，转入-20℃冷库保存备用保存，至此病毒完成1次传代。所用于复合物疫苗病毒抗原制备的种毒液已经为传代40次的病毒液，在此基础上再传代1～5次，即病毒传代次数在40～45的范围内作为本发明抗原抗体复合物疫苗的病毒抗原，将病毒传代次数限定在40～45代范围内是为了保证病毒毒价和毒力的稳定性。本实施例的病毒代数为43代。
（1.3）病毒液毒价的测定
Vero细胞接种于96孔板，细胞90%铺成单层即可接种病毒。取步骤（2）保存的病毒液病毒液作10倍稀释，无血清DMEM培养基分装于10个试管中，每管0.9ml，取0.1ml病毒悬液加入第一管中，摇匀后为10-1，换一支吸管0.1ml放入第二管中摇匀后10-2，如此稀释至10-8。将细胞培养板中的培养液倒掉，用PBS缓冲液清洗细胞1次，取已稀释好的病毒液接种于细胞孔内，每孔0.1ml，10-2～10-8每个稀释度分别接种8孔，另取病毒原液接种8孔细胞，每孔0.1ml，作为病毒对照。再取4孔细胞分别接种0.1ml培养基作为正常细胞对照。接种完毕后一起放入37℃温箱内，吸附1.5～2h。吸附完毕后倒掉病毒液或稀释液，每瓶细胞中各加入0.2 mL细胞维持液。置37℃培养，72h后观察结果，TCID50在10-5/mL～10-6/mL之间，本实施例测得病毒液的TCID50效价为10-5.8，满足作为抗原的要求。
（2）制备猪流行性腹泻病毒的病毒抗体
采用步骤（1）中制备的抗原，病毒含量满足TCID50为10-5/mL～10-6/mL。加入终浓度为5mmol/L的BEI灭活病毒24h。灭活的病毒原液经10kd超滤管对病毒原液进行20倍浓缩，在浓缩液中按浓缩液总量25%的比例加入氢氧化铝胶佐剂，充分混匀，即得到猪流行性腹泻病毒灭活疫苗。
采用制备的铝胶佐剂灭活疫苗免疫60kg体重的实验猪，具体免疫程序如下：免疫采用后海穴注射免疫，进行3次接种。第一次免疫剂量为4mL/只，在第一次免疫后的第14天和第28天分别加强免疫一次，免疫剂量均为5mL/只。在最后一次加强免疫后的第7天使用采血管采集猪血液。
采集的猪血液经5000 r/min 离心 10min，取血清，置于56℃水浴灭活补体30min，按总量的0.005%加入10%的硫柳汞溶液，-20℃后保存备用。
采用琼脂扩散实验测定血清抗体效价，血清抗体效价不低于1:128的高免血清即可作为病毒抗体。
（3）制备抗原抗体复合物
将步骤(1)的病毒抗原与步骤(2)的病毒抗体按照五个不同的体积比1:1、1：5、1:10、1：15、1:20分别在无菌容器内充分混合，分别加入终浓度为1000UI/mL的青霉素和终浓度为1000ug/mL的链霉素，置于37℃孵育2h，获得五个抗原抗体复合物疫苗。将配制好的复合物疫苗通过0.22um的滤膜过滤除菌，并分装于10mL离心管中，置于4℃保存。将抗原抗体复合物疫苗按现行《中国兽药典》附录进行细菌和支原体检验，结果符合药典相关规定。
（4）抗原抗体结合检验
将步骤（3）中制备的不同比例组合的五个抗原抗体复合物疫苗分别接种vero细胞。取细胞铺壁90%的vero细胞，将25cm2细胞瓶中的培养液倒掉，用D-Hanks缓冲液清洗细胞1次，分别接种各组合抗原抗体复合物疫苗1mL，并加入终浓度为5ug/mL的胰蛋白酶；在37℃ 二氧化碳细胞培养箱中孵育2h。
孵育完成，取出病毒液并用D-Hanks缓冲液清洗细胞面1次，加入5mL无血清细胞培养液和终浓度为5ug/mL的胰蛋白酶，继续培养3-4天，观察细胞病变情况（结果见表1）。每组设4个重复。结果显示，1:1组合复合物接种细胞均出现明显病变，1:5组合复合物接种细胞引起25%接种细胞出现明显病变，说明以上两种组合的复合物疫苗中仍有大量的游离病毒未与抗体发生结合。1:10、1:15和1:20三组组合均未引起细胞病变，说明病毒抗原全部与抗体发生结合。
（5）安全性检验
由于1:1组合仍有可能存在大量的病毒，而1:20组合的抗体明显过量，由于复合物疫苗中抗体过量会抑制复合物对免疫淋巴细胞的刺激作用，复合物中抗原稍过量或抗原抗体等价，抗原抗体复合物疫苗才能产生有效的免疫刺激，因此选择1:5、1:10和1:15三个组合进行安全性试验。将3日龄仔猪20只分为4组，每组5只，1、2、3组分别注射接种1:5、1:10和1:15三个组合复合物疫苗，4组注射生理盐水，疫苗注射均采用后海穴注射，注射剂量3mL。试验仔猪均采用代乳粉饲喂，观察试验仔猪的疫苗接种反应，试验期为2周。
结果显示， 1组在接种后第3天1只仔猪出现轻微的免疫反应，包括轻微的腹泻和畏冷，症状持续2天后好转。其他2组复合物疫苗免疫后均无明显不良免疫反应，对照组正常，试验期内无仔猪死亡。
（6）攻毒保护试验
选择1:5、1:10和1:15三个组合进行攻毒保护试验。将3日龄仔猪20只分为4组，每组5只，1、2、3组分别注射接种1:5、1:10和1:15三个组合复合物疫苗，4组注射生理盐水，疫苗注射均采用后海穴注射，注射剂量3mL。试验仔猪均采用代乳粉饲喂。在免疫后的第14天，用TCID50效价为10-5.8的病毒液进行口服攻毒，接毒量为2mL/只。观察各组仔猪发病和死亡情况。
试验结果显示，1、2和3组的疫苗保护率分别为80%、60%和40%，从保护率结果看抗原抗体按1:5混合的疫苗的保护率最高，达到80%，虽然有1只仔猪发病，但未发生死亡。未接种疫苗的对照组发病率为100%。
结论：综合抗原抗体结合性试验、安全性试验和攻毒保护试验的结果，复合物疫苗中抗原抗体的比例为1:5时效果最好。
实施例2
猪流行性腹泻病毒抗原抗体复合物疫苗免疫3日龄仔猪效果评价
采用复合物疫苗对3日仔猪进行免疫，分免疫组和对照组，采用后海穴注射免疫，注射剂量为3mL。试验仔猪均采用代乳粉饲喂。分别在免疫后的第1、6、12和18天采血观察血清抗体变化情况，结果如图1显示，在免疫后的第6天，仔猪的血清抗体水平较对照组明显升高，表明抗原抗体复合物疫苗可以使新生仔猪早期产生保护性抗体，提高抵抗病毒感染的能力。
实施例3
猪流行性腹泻病毒抗原抗体复合物疫苗免疫40日龄后备猪的效果评价
取40日后备猪20头，分为灭活疫苗免疫组和复合物疫苗免疫组，每组10只，分别进行灭活疫苗和本发明复合物疫苗进行3次免疫接种，接种剂量为4mL，均采用后海穴注射接种。分别在每次接种后的第7天采血，测定血清抗体效价，结果如图2显示，本发明复合物疫苗的平均抗体效价分别为1:23.115、1:24.874和1:26.874，灭活疫苗平均抗体效价分别为1:22.737、1:24.737和1:26.874，复合物疫苗接种较灭活疫苗在早期能够诱导更高的水平的血清抗体。
实施例4
猪流行性腹泻病毒抗原抗体复合物疫苗免疫怀孕母猪的效果评价
选同期配种的母猪12头，分为4组，每组3只，1组使用本发明复合物疫苗、2组使用猪流行性腹泻灭活疫苗、3组使用猪流行性腹泻弱毒疫苗、4组使用生理盐水，分别在产前40天和产前20天进行后海穴注射免疫，注射剂量为4mL。各组通过在免疫前5d、一免后20d、二免后20d前腔静脉采集母猪血液检测PEDV抗体效价,分析各免疫阶段血清抗体变化情况。采集母猪分娩后1d、3d、7d、15d的乳汁采用ELIAS方法检测PEDV IgA抗体,分析各时间段乳汁IgA抗体水平变化情况。母猪免疫血清抗体检测结果如图3所示，复合物疫苗组在经过2次免疫后母猪血清抗体效价显著升高，其抗体效价水平高于灭活疫苗免疫组，但略低于弱毒疫苗组。对不同时间点采集的初乳中IgA抗体测定结果如表3所示，复合物疫苗组初乳中IgA抗体效价与弱毒疫苗相当，均高于灭活疫苗组。结果提示，复合物疫苗免疫可有效诱导母猪产生血清IgG抗体和乳汁IgA抗体，这对保护哺乳期仔猪免受病毒攻击至关重要。
实施例5
复合物疫苗对新生仔猪攻毒保护试验研究。
从从实施例4中每个疫苗接种组的每头母猪分娩的猪群中随机选取 2 头 3 日龄采食过初乳的新生仔猪，各组分开单独饲喂，并待猪群稳定后立即口服本实验室鉴定并保存的病毒液 10mL，病毒液的TCID50效价为10-5.8，同一窝的仔猪分别做好标记。于攻毒后 6h 进行饲喂，每次饲喂人工猪奶粉 10～20mL。每12h观察一次，统计各组攻毒后72h内仔猪的腹泻率、死亡率。结果显示，复合物疫苗组和弱毒疫苗组攻毒后的腹泻率和死亡率分别为50%和16.67%，低于灭活疫苗组的66.67%和33.33%，对照组的腹泻率达到100%，死亡率达到83.33%，结果提示，复合物疫苗组免疫母猪可对后代仔猪产生有效的保护。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在任何其他不脱离本发明设计精神的前提下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (1)
1.一种用于猪流行性腹泻病毒的抗原抗体复合物疫苗，其特征在于：由体积比为1:5的猪流行性腹泻病毒抗原与猪流行性腹泻病毒抗体充分混合，加入终浓度为1000UI/mL的青霉素和终浓度为1000μg/mL的链霉素，温度37℃条件下孵育2h制得；
所述猪流行性腹泻病毒抗原是将猪流行性腹泻临床病料的毒株接种vero细胞培养，传代至40～45代，所得到细胞半数感染量（TCID50）为10-5/mL～10-6/mL的猪流行性腹泻病毒即为病毒抗原液；
所述猪流行性腹泻病毒抗体是将配制的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗通过对实验猪的加强免疫，获得实验猪的血清抗体，抗体效价不低于1:128的血清抗体即为病毒抗体；
所述猪流行性腹泻临床病料的毒株已于2019年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心保存，保藏编号为CCTCC V201915；
所述抗原抗体复合物疫苗的制备操作步骤如下：
（1）制备猪流行性腹泻病毒的病毒抗原液
（1.1）将浓度104/mL的vero细胞接种于25cm2的细胞培养瓶中，加入6mL含10%胎牛血清的DMEM培养基，温度37℃、浓度5%的二氧化碳气体条件下，通气培养2～3天；显微镜观察，当细胞铺满至90%时，用D-Hanks缓冲液清洗细胞面2次；
（1.2）将1mL种毒液接种于25cm2的细胞培养瓶，加入终浓度为5μg/mL的胰蛋白酶，混合均匀，温度37℃、浓度5%的二氧化碳气体条件下，通气孵育2h，每30分钟轻摇培养瓶1次；
（1.3）孵育完成，用D-Hanks缓冲液清洗细胞面1次，加入5mL无血清细胞培养液和终浓度为5μg/mL的胰蛋白酶，温度37℃、浓度5%的二氧化碳气体条件下，继续培养3-4天；
所述猪流行性腹泻临床病料的毒株以种毒液形式保藏于中国典型培养物保藏中心；
当细胞培养物出现明显的细胞核增大、细胞皱缩、脱落和溶解时，收集细胞和培养液，反复冻融3次，转速5000r/min条件下离心5min，取上清液；至此病毒完成1次传代，接着重复上述传代操作，传代次数在40～45次；
对上清液进行测定TCID50，满足TCID50为10-5/mL～10-6/mL的病毒液即为病毒抗原液；
（2）制备猪流行性腹泻病毒的病毒抗体
在病毒抗原液中加入终浓度为5mmol/L的二乙烯亚胺（BEI），灭活24h；使用10kd超滤管进行20倍浓缩，在浓缩液中按浓缩液总量25%的量加入氢氧化铝胶佐剂，充分混匀，即得到猪流行性腹泻病毒的灭活疫苗；
采用所述灭活疫苗对60kg体重的实验猪进行三次免疫接种，在最后一次加强免疫后的第7天，采集实验猪血液；
将实验猪血液在转速5000 r/min条件下离心10min，取血清，在温度56℃的水浴条件下灭活30 min，-20℃保存；采用琼脂扩散实验测定血清抗体效价，血清抗体效价不低于1:128的高免血清即为病毒抗体；
实验猪的具体免疫操作如下：灭活疫苗免疫采用后海穴注射接种，进行3次接种；第一次接种剂量为4mL/只，在第一次接种后的第14天和第28天分别加强免疫接种一次，接种剂量均为5mL/只；
所述实验猪为清洁级实验猪，不携带所规定的重要人兽共患病病原、猪烈性传染病病原以及不携带所规定的对猪危害大和对科学研究干扰大的病原的实验用猪；
（3）制备抗原抗体复合物
将所述病毒抗原液和所述病毒抗体按体积比1：5充分混合，加入终浓度为1000UI/mL的青霉素和终浓度为1000μg/mL的链霉素，温度37℃条件下孵育2h，获得抗原抗体复合物，按抗原抗体复合物总量0.005%的量加入浓度10%的硫柳汞溶液，充分混合即为抗原抗体复合物疫苗；
将所述抗原抗体复合物疫苗通过0.22μm的滤膜过滤除菌，并分装于50mL灭菌玻璃瓶中，置于4℃保存。
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