CN111035756B - 猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗及其制备方法。所述二联灭活疫苗是将猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒分别接种至易感细胞进行培养，收获病毒，灭活后按比例混合，然后加入佐剂制备得到的。本发明提供猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒抗原的无血清悬浮培养制备方法，将猪伪狂犬病病毒灭活病毒液与猪流行性腹泻病毒灭活病毒液按比例混合，再加入佐剂充分乳化制得猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗。该疫苗免疫保护率高、稳定性好、产量高、安全可靠，为PRV和PEDV的防控提供有效手段。

Description

猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗及其制备 方法
技术领域
本发明涉及生物技术和预防兽医领域，具体地说，涉及一种猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的多种家畜及野生动物的一种以发热，奇痒(猪除外)，呼吸和神经系统疾病为特征的急性传染病，其中对猪危害最大，主要引起怀孕母猪流产，产死胎，木乃伊胎，返情和屡配不孕；新生仔猪大量死亡；育肥猪增重变缓及种公猪丧失种用能力。世界卫生组织(OIE)将其列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。本病的流行在全球范围内呈持续上升趋势，目前已成为养猪业危害最大的疾病之一。
猪流行性腹泻，英文缩写为PED(Porcine Epidemic Diarrhea)，由猪流行性腹泻病毒引起的一种接触性肠道传染病，其特征为呕吐、腹泻、脱水。临床变化和症状与猪传染性胃肠极为相似。猪流行腹泻病毒(PEDV)，属于冠状病毒科冠状病毒属。病毒粒子呈现多性性，倾向圆形，外有囊膜。病毒存在于肠绒毛上皮细胞和肠系膜淋巴结，随粪便排出后，污染环境、饲料、饮水、交通工具及用具等而传染。
目前预防种猪的猪伪狂犬病和猪流行性腹泻病毒病的有效手段是免疫猪伪狂犬病灭活疫苗和猪流行性腹泻病毒病灭活疫苗。市面销售的该类产品均为单苗，需要分别免疫，人工和动物的应激次数都会增加，这两种疫苗的生产工艺也相对落后，耗费人工，抗原产能低，批间差异大，抗原含量低，影响疫苗的市场供应。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗及其制备方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗，所述二联灭活疫苗是将猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒分别接种至易感细胞进行培养，收获病毒，灭活后按比例混合，然后加入佐剂制备得到的。
优选地，所述猪伪狂犬病病毒为XF-1株。所述猪流行性腹泻病毒为2b KQ02株，猪流行性腹泻病毒2b KQ02株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:V202006，保藏日期2019年12月19日。
前述的二联灭活疫苗，收获的猪伪狂犬病病毒的病毒液滴度不低于108 TCID50/0.1mL，猪流行性腹泻病毒的病毒液滴度不低于107 TCID50/0.1mL。
优选地，两种病毒液灭活后按等体积混合。
优选地，所述佐剂为Montanide ISA206VG。
第二方面，本发明提供所述二联灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)在生物反应器中悬浮培养ST细胞，用猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒分别接种培养好的ST细胞，继续培养，待细胞病变达80％以上时分别收获病毒，加入 BEI(BEI的终浓度0.005mol/L)灭活病毒；
2)灭活后的两种病毒按比例混合后，加入佐剂混匀。
前述的方法，细胞培养条件为：37℃，pH7.2～7.4，DO值40％～60％，反应器搅拌转速为80～100rpm。
本发明中，用于悬浮培养ST细胞的培养基配方为：葡萄糖6000-8000mg/L，丙氨酸100-180mg/L，L-谷氨酰胺300-400mg/L，精氨酸200-300mg/L，天冬氨酸 100-150mg/L，天冬酰胺300-450mg/L，半胱氨酸一水合物10-50mg/L，谷氨酸 50-150mg/L，异亮氨酸100-300mg/L，亮氨酸100-150mg/L，赖氨酸盐酸盐 100-350mg/L，蛋氨酸35-90mg/L，苯丙氨酸10-60mg/L，脯氨酸80-155mg/L，丝氨酸 100-200mg/L，苏氨酸150-250mg/L，色氨酸100-150mg/L，酪氨酸二钠盐30-100mg/L，缬氨酸100-185mg/L，胱氨酸盐酸盐50-85mg/L，组氨酸盐酸盐50-150mg/L，赖氨酸 50-500mg/L，甘氨酸50-90mg/L，氯化镁40-150mg/L，无水氯化钙100-150mg/L，氯化钠5000-7500mg/L，磷酸氢二钠10-45mg/L，六水氯化镁50-80mg/L，无水硫酸镁 2-65mg/L，氯化钾40-350mg/L，一水磷酸二氢钠20-50mg/L，七水合硫酸锌 0.1-0.7mg/L，九水合硝酸0.01-0.6mg/L，亚硒酸钠0.01-0.03mg/L，五水硫酸铜 0.0001-0.003mg/L，硫酸亚铁0.01-0.2mg/L生物素0.012-0.24mg/L，维生素C1-12mg/L，氯化胆碱0.5-5mg/L，叶酸0.2-5mg/L，烟酰胺5-8mg/L，盐酸吡哆醇5-8mg/L，泛酸钙 0.065-0.4mg/L磷酸吡哆醛0.06-0.3mg/L，核黄素0.08-0.6mg/L，钴胺素0.04-3mg/L，盐酸硫胺素0.05-0.5mg/L，肌醇5-8mg/L亚油酸0.1-0.3mg/L，大豆卵磷脂15-20mg/L，胆固醇6-10mg/L，腐胺0.04-0.8mg/L和乙醇胺1-30mg/L。
对于猪伪狂犬病病毒，最佳接毒细胞密度为3×106cells/ml，最佳接毒量为1％，最佳收毒时间为24h-30h。
对于猪流行性腹泻病毒，最佳接毒细胞密度为3×106cells/ml，最佳接毒量为1％，最佳收毒时间为30h-36h。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供的猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒抗原制备都是无血清悬浮培养工艺。反应器悬浮培养制备工艺是大势所趋，其中无血清悬浮培养更是生物制品企业追求的目标。本发明提供的悬浮培养工艺相比传统培养工艺，避免了血清的使用，收获的病毒液具有抗原含量高，抗原批量大，批次稳定等优点，大大减少了人工使用，操作步骤简单，污染风险较小，生产车间占地面积和空间小，降低了企业的生产成本；同时，免疫本发明所述猪伪狂犬病/猪流行性腹泻病二联灭活疫苗，一针免疫两毒，减少了动物的免疫次数，降低了动物应激次数，免疫效果好，免疫后中和抗体水平高，大大降低了养殖户的养殖成本。具体优点如下：
(一)本发明采用的悬浮型ST细胞为无血清培养，生产工艺稳定，成本低。
(二)制苗用病毒液的制备采用反应器悬浮培养，操作简单方便，占地面积小。
(三)本发明制备的抗原批量大，抗原病毒含量比传统转瓶工艺高近一个滴度。
(四)本发明制备的二联灭活苗，吸收好，安全性高，免疫效果佳，体内持续时间长。
附图说明
图1为本发明实施例1中ST细胞接种PRV、PEDV后30h产生细胞病变效应(CPE)。
图2为本发明实施例8中不同猪伪狂犬病毒gB-ELISA平均抗体消长规律图。
图3为本发明实施例8中不同猪流行性腹泻病毒IgG-ELISA平均抗体消长规律图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中，猪伪狂犬病病毒毒株XF-1由武汉科前生物股份有限公司提供。毒株XF-1可参见CN106511993A。
以下实施例中，用于悬浮培养ST细胞的培养基配方为：葡萄糖8000mg/L，丙氨酸180mg/L，L-谷氨酰胺400mg/L，精氨酸300mg/L，天冬氨酸150mg/L，天冬酰胺 450mg/L，半胱氨酸一水合物50mg/L，谷氨酸150mg/L，异亮氨酸300mg/L，亮氨酸 150mg/L，赖氨酸盐酸盐350mg/L，蛋氨酸90mg/L，苯丙氨酸60mg/L，脯氨酸8155mg/L，丝氨酸200mg/L，苏氨酸250mg/L，色氨酸150mg/L，酪氨酸二钠盐100mg/L，缬氨酸 185mg/L，胱氨酸盐酸盐85mg/L，组氨酸盐酸盐150mg/L，赖氨酸500mg/L，甘氨酸 90mg/L，氯化镁150mg/L，无水氯化钙150mg/L，氯化钠7500mg/L，磷酸氢二钠45mg/L，六水氯化镁80mg/L，无水硫酸镁30mg/L，氯化钾200mg/L，一水磷酸二氢钠50mg/L，七水合硫酸锌0.5mg/L，九水合硝酸0.2mg/L，亚硒酸钠0.01mg/L，五水硫酸铜 0.001mg/L，硫酸亚铁0.05mg/L生物素0.02mg/L，维生素C10mg/L，氯化胆碱2mg/L，叶酸1mg/L，烟酰胺8mg/L，盐酸吡哆醇8mg/L，泛酸钙0.2mg/L磷酸吡哆醛0.1mg/L，核黄素0.2mg/L，钴胺素0.1mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，肌醇8mg/L亚油酸0.1mg/L，大豆卵磷脂20mg/L，胆固醇10mg/L，腐胺0.2mg/L和乙醇胺20mg/L。
实施例1猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒抗原的制备
1.猪伪狂犬病病毒TK-gE-gI(XF-1株)三基因缺失株抗原的制备
1.1毒种的制备
将悬浮型ST细胞接种摇瓶，置于5％CO2摇床培养箱培养，温度37℃，转速 150r/min。取细胞活率95％以上，细胞密度7×106～8×106cells/ml种子细胞加入接种瓶，混匀后取样计数，转接至生物反应器。控制培养条件：温度37℃，接种密度1× 106～1.5×106cells/ml，转速100～120r/min，pH值7.0～7.4，溶氧(DO)值40％，当细胞密度长至7×106～8×106cells/ml，补加新鲜培养基至细胞密度3×106～4×106cells/ml，以1％(v/v)的比例将PRV TK-gE-gI三基因缺失株(XF-1株)病毒液接种于悬浮型ST细胞，转速80～100r/min，pH值7.2～7.4，溶氧(DO)值40％，37℃继续培养24h～30h，当细胞活率低于20％时收获病毒液，定量分装，置-70℃以下保存。病毒含量和纯净性，应符合规定。湿毒-15℃以下保存，有效期为6个月。毒种继代应不超过5代。
1.2细胞的制备
摇瓶中ST细胞培养：从液氮罐中取出悬浮型ST细胞快速解冻后，以1×106～1.5×106cells/ml的细胞密度转至细胞三角摇瓶，在5％CO2摇床中37℃连续培养3代，细胞活率达到95％以上，密度达到7×106～8×106cells/ml后，以1×106～1.5×106cells/ml 的密度扩大，为一级生物反应器提供种细胞。
一级生物反应器中ST细胞培养：摇瓶培养的种细胞进行取样观察细胞状态，取细胞活率95％以上，细胞密度7×106～8×106cells/ml的种子细胞加入接种瓶，混匀后取样计数，转移至一级生物反应器中，使罐内细胞密度达到1×106～1.5×106cells/ml. 培养温度37℃，转速100～120r/min，pH值7.0～7.4，溶氧(DO)值40％。
二级生物反应器中ST细胞培养：当一级生物反应器中细胞密度达到7×106～8×106cells/ml左右，活率95％以上后，转移至二级生物反应器内，取样计数，使罐内细胞密度达到1×105～1.5×105cells/ml。培养体积为预培养体积的40～50％左右，控制反应器温度37℃，转速80～100r/min，pH值7.0～7.4，溶氧(DO)值40％。
1.3接毒与收获
当二级生物反应器内悬浮型ST细胞密度达到7×106～8×106cells/ml时，补加新鲜生长液控制细胞密度在3×106～4×106cells/ml时，以1％(v/v)的比例将PRV TK-gE-gI三基因缺失株(XF-1株)接种于悬浮型ST细胞，转速80～100r/min，pH值7.2～7.4，溶氧(DO)值40％，37℃继续培养24～30h左右，当细胞活率低于20％时收获病毒液。
1.4病毒液检测及灭活
按现行《中国兽药典》附录进行检验，病毒液应无菌生长，每毫升病毒液中病毒含量应不低于108TCID50/ml。将检验合格的病毒原液或稀释后加入灭活灌，加入浓度为0.2mol/l的BEI至终浓度0.005mol/l，边加边搅拌，混合均匀后，保持36～37℃，灭活48h后立即加入过滤除菌的50％Na2S2O3(硫代硫酸钠)溶液，使其终浓度为2.0％，充分搅拌均匀。置于2～8℃保存，留样检验。
1.5灭活检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。取灭活后的病毒液，接种3 个25cm2瓶生长良好的ST细胞，每瓶2ml，37℃吸附1h后弃掉病毒液，加入细胞维持液5ml，置于37℃下培养3日后收获，反复冻融2次，离心取上清2ml再次接种ST细胞，如此再盲传2代，应观察不到细胞病变。
2.猪流行性腹泻病毒(KQ02株)抗原的制备
2.1毒种的繁殖
将悬浮型ST细胞接种摇瓶，置于5％CO2摇床培养箱培养，温度37℃，转速 150r/min。取细胞活率95％以上，细胞密度7×106～8×106cells/ml种子细胞加入接种瓶，混匀后取样计数，转接至生物反应器。控制培养条件：温度37℃，接种密度1× 106～1.5×106cells/ml，转速100～120r/min，pH值7.0～7.4，溶氧(DO)值40％，当细胞密度长至7×106～8×106cells/ml，补加新鲜生长液至细胞密度3×106～4×106cells/ml，并补加终浓度为15～25ug/ml的胰蛋白酶溶液，以1％(v/v)的比例将PEDV KQ02株病毒液接种于悬浮型ST细胞，转速80～100r/min，pH值7.2～7.4，溶氧(DO)值40％，37℃继续培养36～48h，当细胞活率低于20％时收获病毒液，定量分装，置于-70℃以下保存。病毒含量和纯净性，应符合规定。湿毒-15℃以下保存，有效期为6个月。毒种继代应不超过5代。
2.2细胞的制备
摇瓶中ST细胞培养：从液氮罐中取出悬浮型ST细胞快速解冻后，以1×106～1.5×106cells/ml的细胞密度转至细胞三角摇瓶，在5％CO2摇床中37℃连续培养3代，细胞活率达到95％以上，密度达到7×106～8×106cells/ml后，以1×106～1.5×106cells/ml 的密度扩大，为一级生物反应器提供种细胞。
一级生物反应器中ST细胞培养：摇瓶培养的种细胞进行取样观察细胞状态，取细胞活率95％以上，细胞密度7～8×106cells/ml的种子细胞加入接种瓶，混匀后取样计数，转移至一级生物反应器中，使罐内细胞密度达到1×106～1.5×106cells/ml.培养温度37℃，转速100～120r/min，pH值7.0～7.4，溶氧(DO)值40％。
二级生物反应器中ST细胞培养：当一级生物反应器中细胞密度达到7×106～8×106cells/ml左右，活率95％以上后，转移至二级生物反应器内，取样计数，使罐内细胞密度达到1×106～1.5×105cells/ml。培养体积为预培养体积的40～50％左右，控制反应器温度37℃，转速80～100r/min，pH值7.0～7.4，溶氧(DO)值40％。
2.3接毒与收获
当二级生物反应器内悬浮型ST细胞密度达到7×106～8×106cells/ml时，补加新鲜生长液控制细胞密度在3×106～4×106cells/ml时，以1％(v/v)的比例将PEDV(KQ02 株)接种于悬浮型ST细胞，转速80～100r/min，pH值7.2～7.4，溶氧(DO)值40％，37℃继续培养24～30h左右，当细胞活率低于20％时收获病毒液。
2.5病毒液检测及灭活
按现行《中国兽药典》附录进行检验，病毒液应无菌生长，每毫升病毒液中病毒含量应不低于107TCID50/ml。将检验合格的病毒原液或稀释后加入灭活灌，加入浓度为0.2mol/l的BEI至终浓度0.005mol/l，边加边搅拌，混合均匀后，保持36～37℃，灭活48h后立即加入过滤除菌的50％Na2S2O3(硫代硫酸钠)溶液，使其终浓度为2.0％，充分搅拌均匀。置于2～8℃保存，留样检验。
2.6灭活检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。取灭活后的病毒液，接种3 个25cm2瓶生长良好的ST细胞，每瓶2ml，37℃吸附1h后弃掉病毒液，加入细胞维持液5ml，置于37℃下培养3日后收获，反复冻融2次，离心取上清2ml再次接种ST细胞，如此再盲传2代，应观察不到细胞病变。
ST细胞接种PRV、PEDV后30h产生细胞病变效应(CPE)见图1。
实施例2猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒抗原制备的最佳条件优化
1.猪伪狂犬病病毒培养最佳条件优化
1.1接种细胞密度的确定：待摇瓶中细胞密度达到7×106-8×106cells/ml时，用生长液将ST细胞按2×106cells/ml、3×106cells/ml和4×106cells/ml细胞密度进行稀释，按1％的体积比接毒，取样测定病毒效价。最佳接毒细胞密度为3×106cells/ml。
1.2接毒剂量的确定：待细胞密度达到7×106-8×106cells/ml后用生长液将ST细胞稀释为3×106cells/ml的细胞密度，接毒量分别按0.3％、1％、3％体积比接毒，取样并检测病毒含量。最佳接毒量为1％。
1.3收毒时间的确定：待细胞密度达到7×106-8×106cells/ml后用生长液将ST细胞稀释为3×106cells/ml的细胞密度，按1％体积比接毒，18h、24h、30h、36h取样并检测病毒含量。优选地，收毒时间为24h-30h。
2.猪流行性腹泻病毒培养最佳条件优化
2.1接毒细胞密度的确定：待摇瓶中细胞密度达到7×106-8×106cells/ml时，用生长液将ST细胞按2×106cells/ml、3×106cells/ml和4×106cells/ml细胞密度进行稀释并加入终浓度为20μg/ml的胰酶，按体积比的1％接毒，取样测定病毒效价。最佳接毒细胞密度为3×106cells/ml。
2.2胰酶浓度的确定：待细胞密度达到7×106-8×106cells/ml后用生长液将ST细胞稀释为3×106cells/ml的细胞密度，按体积比的1％接毒，分别使胰酶浓度为10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml，取样并检测病毒含量。最佳胰酶浓度为20μg/ml。
2.3接毒量的确定：待细胞密度达到7×106-8×106cells/ml后用生长液将ST细胞稀释为3×106cells/ml的细胞密度，加入的胰酶浓度为20μg/ml，接毒量分别按0.3％、1％、3％体积比接毒，取样并检测病毒含量。最佳接毒量为1％。
2.4收毒时间的确定：待细胞密度达到7×106-8×106cells/ml后用生长液将ST细胞稀释为3×106cells/ml的细胞密度，加入的胰酶浓度为20μg/ml，按1％的体积比接毒，24h、30h、36h、42h取样并检测病毒含量。最佳收毒时间为30h-36h。
实施例3无血清悬浮培养工艺生产抗原的毒价测定
按照实施例2最佳条件生产三个批次的抗原，批号分别为190105、190115、190125。按照现行《中国兽药典》进行PRV、PEDV病毒液TCID50检测，三批实验结果见表1。
表1 PRV、PEDV毒价TCID50
抗原批号 PRV毒价 PEDV毒价
190105 109.0TCID50/ml 108.3TCID50/ml
190115 109.3TCID50/ml 108.5TCID50/ml
190125 109.2TCID50/ml 108.2TCID50/ml
实验结果表明，此全悬浮无血清生产工艺极稳定，相比添加血清的生产工艺，不仅省去了血清成本，避免了外源病毒的污染，培养的病毒液滴度和稳定性均有保障，并且此工艺更容易实现大规模培养，满足市场需求。
实施例4猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗的制备方法
按照实施例2中猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒培养最佳条件下制备的灭活病毒液，进行二联灭活疫苗的制备。
猪伪狂犬病/猪流行性腹泻病二联灭活疫苗的制备及检验：
1.抗原纯化
猪伪狂犬病病毒灭活液和猪流行性腹泻病毒灭活液自然沉淀后，通过0.65μm的套筒滤器过滤，然后过300kd的膜包进行浓缩，最后过分子筛进行纯化。
2.水相制备
两种纯化后的抗原按1：1(体积比)混合均匀。其中猪伪狂犬病病毒灭活前病毒含量应不低于108TCID50/ml，猪流行性腹泻病毒病毒灭活前病毒含量应不低于107 TCID50/ml。两种抗原的比例经过实验优化后确定最佳比例为1：1，将两种抗原比例调整为1：2或者2：1制备的二联苗，综合各方面实验数据，其免疫效果均较差，最终优选两种抗原混合比例为1：1。
3.乳化：将水相与佐剂Montanide ISA206VG按照1：1的比例(质量比)混合后剪切乳化。取样，吸取疫苗10.0ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。
4.分装：将乳化合格的疫苗定量分装，轧盖，贴签。
5.无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，产品应无菌生长。
6.稳定性检验：将制备好的二联灭活疫苗分别放在4℃、25℃、37℃存放一个月、三个月、六个月等时间后观察其物理性状，检验其有效性。结果表明4℃为最佳存放条件(表2)。
表2不同温度下疫苗产品的稳定性
温度 一个月 三个月 六个月
4℃ 正常 正常 正常
25℃ 效力降低 轻微分层，效力降低 分层，无免疫效果
37℃ 轻微分层，效力降低 分层，无免疫效果 分层，无免疫效果
实施例5佐剂的优化筛选实验
动物疫苗的佐剂是一种在动物体内能够非特异性的增强机体对抗原的特异性免疫应答的辅助物质，不仅能够提高动物机体内的免疫应答的时间、速度和强度，还能减少疫苗的使用剂量，减少抗原的降解。
1.按照实施例4的制苗方法，分别采用Montanide ISA206VG、ISA15AVG、IMS251CVG、Aluminum、Mineral oil五种佐剂制备不同佐剂的疫苗。五种疫苗的稳定性、物理性状与无菌检验等指标均符合要求。
2.仔猪安全性试验
每种疫苗分别接种28～35日龄健康仔猪5头进行安全性试验，每头颈部肌肉注射4mL疫苗，观察2周，无异常。再次每头颈部肌肉注射8mL疫苗，继续观察2周，剖检，无异常。五种疫苗对仔猪安全。
3.不同妊娠阶段母猪的安全性试验
每种疫苗灭活疫苗分别接种怀孕30d、60d、90d的怀孕母猪各3头进行安全性试验，每头颈部肌肉注射8mL疫苗，连续观察母猪健康情况，均无不良反应，母猪产仔后，胎儿的发育情况正常和所产仔猪的健康状况正常。五种疫苗对母猪及其胎猪安全。
4.仔猪效力实验
挑选PRV、PEDV中和抗体≤1：2的28-35日龄的仔猪30头，分成6组，每组5头猪，第一组免疫Montanide ISA206VG佐剂疫苗1头份/头，第二组免疫Montanide ISA15AVG佐剂疫苗1头份/头，第三组免疫Montanide IMS251CVG佐剂疫苗1头份/头，第四组免疫Aluminum佐剂疫苗1头份/头，第五组免疫Mineral oil1佐剂疫苗1头份/头，第六组免疫生理盐水为阴性对照。一免14d后，进行二免，分别于二免后7d、14d、 21d、28d、35d采血，检测PRV、PEDV中和抗体效价。各疫苗平均中和抗体水平见表3。
表3五种疫苗PRV、PEDV平均中和抗体水平
结果表明，五种佐剂中Montanide ISA206VG的免疫效果最好，产生的抗体水平最高，并且持续时间较长。
Montanide ISA206VG是基于矿物油的佐剂，用于制备水包油包水的佐剂，不含任何动物来源的成分，制备的乳剂非常稳定，粘度低且易于注射。
实施例6二联灭活疫苗的安全性评价
1.仔猪安全性试验
用实施例3制备的3批疫苗，批号C190407、C190408、C190409，分别接种28～35 日龄左右的健康易感仔猪，选取4头/批，颈部肌肉注射8ml，按2倍免疫剂量接种，另每批设1头空白对照(以生理盐水代替疫苗进行同剂量注射)，连续观察14日，免疫猪应均无不良反应，且全部健活。
2.母猪安全性试验
按2倍免疫剂量用实施例3制备的3批疫苗接种妊娠母猪2头/批，每头颈部肌肉注射8ml，另每批设1头空白对照(以生理盐水代替疫苗进行同剂量注射)，连续观察14 日，免疫猪应均无不良反应，且全部健活，待母猪产仔后，继续观察仔猪生长发育情况，均无不良反应。
以上实验结果表明，本发明提供的二联灭活疫苗的安全性良好。
实施例7二联灭活疫苗的免疫保护效力
从某市场上购买PRV、PEDV中和抗体≤1：2的28-35日龄的仔猪48头，分成4组，每组12头猪，第一组免疫本发明实施例4制备的猪伪狂犬病/猪流行性腹泻病二联灭活苗1头份/头，第二组免疫本发明实施例4制备的PRV灭活单苗1头份/头，第三组免疫本发明实施例4制备的PEDV灭活疫苗单苗1头份/头，第四组设为空白对照组，一免14d 后，进行二免，分别于二免疫后7d、14d、21d、28d、35d采血，检测PRV、PEDV中和抗体效价(表4)。
表4仔猪免疫后PRV、PEDV平均中和抗体效价
中和抗体效价 7d 14d 21d 28d 35d
二联苗PRV 1：8.2 1：13.5 1：20.6 1：32.8 1：40.8
单苗PRV 1：8.1 1：13.4 1：20.4 1：32.4 1：40.3
二联苗PEDV 1：8.4 1：16.3 1：22.8 1：40.6 1：45.6
单苗PEDV 1：8.3 1：16.2 1：22.3 1：40.2 1：45.2
空白对照 ≤1:2 ≤1:2 ≤1:2 ≤1:2 ≤1:2
从组一免疫组中随机挑取仔猪10头，分为2组，每组5头，一组口服PRV XF-1株，以每头107个病毒粒子的剂量攻毒，另一组口服PEDV KQ02株，以每头106个病毒粒子的剂量攻毒；从组二免疫组中随机挑取仔猪5头，口服PRV XF-1株，以每头107个病毒粒子的剂量攻毒；从组三免疫组中随机挑取仔猪5头，口服PEDV KQ02株，以每头 106个病毒粒子的剂量攻毒；另取组四对照组中仔猪10头；同样分为组，每组5头，一组口服PRV XF-1株，以每头107个病毒粒子的剂量攻毒，另一组口服PEDV KQ02株，以每头106个病毒粒子的剂量攻毒；观察仔猪攻毒后保护与发病情况，结果见表5。
表5仔猪攻毒保护情况
以上实验结果表明，攻毒后，免疫组仔猪全部正常，保护率100％；对照组仔猪全部发病，本发明的PRV/PEDV二联灭活疫苗免疫效力实验结果与单苗基本一致，仔猪都能得到保护。
实施例8猪体内的抗体消长规律对比实验
1、猪伪狂犬病疫苗抗体消长对比实验
选取PRV中和抗体效价不高于1:2的实验猪20头，每组5头，分为4组，第一组选择本发明实施例4制备的二联苗免疫；第二组选用市售猪伪狂犬灭活疫苗(鄂 A株)(批号：190501，购自武汉科前生物股份有限公司)免疫，第三组选用市售猪伪狂犬活疫苗(HB98株)免疫(批号：190602，购自武汉科前生物股份有限公司)，第四组为生理盐水空白对照。一免后14d，进行二免，免疫后，分别于14d、28d、 42d、56d、90d采血，分离血清后，gB-ELISA试剂盒检测猪伪狂犬病毒gB抗体，各时间段平均值见表6(抗体消长趋势图见图2)。
表6猪伪狂犬gB抗体各时间段平均值
分组 免疫前 14d 28d 42d 56d 90d
组一 1.063 0.5078 0.1823 0.1032 0.0818 0.0802
组二 1.085 0.5124 0.3065 0.158 0.105 0.092
组三 1.096 0.5385 0.3334 0.182 0.129 0.115
组四 1.056 1.048 1.032 1.053 1.081 1.051
结果表明，本发明制备的二联苗和商品苗在免疫28d后都能产生较高的抗体水平，而空白对照组抗体仍为阴性。
2、猪流行性腹泻病疫苗抗体消长对比实验
选取PEDV中和抗体效价不高于1:2的实验猪20头，每组5头，分为4组，第一组选择本发明实施例4制备的二联苗免疫；第二组选用市售猪流行性腹泻灭活疫苗(CV777株)(批号：190601，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)免疫，第三组选用市售猪流行性腹泻疫苗(AJ1102株)免疫(批号：190702，购自武汉科前生物股份有限公司)，第四组为空白对照。一免14d后，进行二免，免疫后，分别 14d、28d、42d、56d、90d采血，分离血清后，IgG-ELISA试剂盒检测PEDV IgG 抗体，阳性对照OD450≥0.6，阴性对照OD450≤0.1，OD450≥0.38为阳性，OD450＜ 0.2为阴性，各时间段平均值见表7(抗体消长趋势图见图3)。
表7猪流行性腹泻IgG抗体各时间段平均值
分组 免疫前 14d 28d 42d 56d 90d
组一 0.0758 0.395 0.586 0.591 0.598 0.602
组二 0.0883 0.367 0.572 0.582 0.589 0.593
组三 0.0953 0.338 0.558 0.576 0.583 0.591
组四 0.0852 0.0745 0.0638 0.0825 0.0895 0.0789
结果表明，本发明制备的二联苗和商品苗在免疫28d后都能产生较高的抗体水平，而空白对照组抗体仍为阴性。
本发明提供猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒抗原的无血清悬浮培养制备方法，将猪伪狂犬病病毒灭活病毒液与猪流行性腹泻病毒灭活病毒液按比例混合，再加入佐剂充分乳化制得猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗。该疫苗免疫保护率高、稳定性好、产量高、安全可靠，为PRV和PEDV的防控提供有效手段。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒二联灭活疫苗，其特征在于，所述二联灭活疫苗是将猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒分别接种至易感细胞进行培养，收获病毒，灭活后按比例混合，然后加入佐剂制备得到的；
所述猪伪狂犬病病毒为XF-1株，所述猪流行性腹泻病毒为2b KQ02株，保藏号为CCTCCNO:V202006。
2.根据权利要求1所述的二联灭活疫苗，其特征在于，收获的猪伪狂犬病病毒的病毒液滴度不低于108TCID50/0.1mL，猪流行性腹泻病毒的病毒液滴度不低于107TCID50/0.1mL。
3.根据权利要求2所述的二联灭活疫苗，其特征在于，两种病毒液灭活后按等体积混合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的二联灭活疫苗，其特征在于，所述佐剂为ISA201。
5.权利要求1-4任一项所述二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在生物反应器中悬浮培养ST细胞，用猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒分别接种培养好的ST细胞，继续培养，待细胞病变达80％以上时分别收获病毒，加入BEI灭活病毒；
2)灭活后的两种病毒按比例混合后，加入佐剂混匀。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，细胞培养条件为：37℃，pH7.2～7.4，DO值40％～60％，反应器搅拌转速为80～100rpm。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，用于悬浮培养ST细胞的培养基配方为：葡萄糖6000-8000mg/L，丙氨酸100-180mg/L，L-谷氨酰胺300-400mg/L，精氨酸200-300mg/L，天冬氨酸100-150mg/L，天冬酰胺300-450mg/L，半胱氨酸一水合物10-50mg/L，谷氨酸50-150mg/L，异亮氨酸100-300mg/L，亮氨酸100-150mg/L，赖氨酸盐酸盐100-350mg/L，蛋氨酸35-90mg/L，苯丙氨酸10-60mg/L，脯氨酸80-155mg/L，丝氨酸100-200mg/L，苏氨酸150-250mg/L，色氨酸100-150mg/L，酪氨酸二钠盐30-100mg/L，缬氨酸100-185mg/L，胱氨酸盐酸盐50-85mg/L，组氨酸盐酸盐50-150mg/L，赖氨酸50-500mg/L，甘氨酸50-90mg/L，氯化镁40-150mg/L，无水氯化钙100-150mg/L，氯化钠5000-7500mg/L，磷酸氢二钠10-45mg/L，六水氯化镁50-80mg/L，无水硫酸镁2-65mg/L，氯化钾40-350mg/L，一水磷酸二氢钠20-50mg/L，七水合硫酸锌0.1-0.7mg/L，九水合硝酸0.01-0.6mg/L，亚硒酸钠0.01-0.03mg/L，五水硫酸铜0.0001-0.003mg/L，硫酸亚铁0.01-0.2mg/L生物素0.012-0.24mg/L，维生素C1-12mg/L，氯化胆碱0.5-5mg/L，叶酸0.2-5mg/L，烟酰胺5-8mg/L，盐酸吡哆醇5-8mg/L，泛酸钙0.065-0.4mg/L磷酸吡哆醛0.06-0.3mg/L，核黄素0.08-0.6mg/L，钴胺素0.04-3mg/L，盐酸硫胺素0.05-0.5mg/L，肌醇5-8mg/L亚油酸0.1-0.3mg/L，大豆卵磷脂15-20mg/L，胆固醇6-10mg/L，腐胺0.04-0.8mg/L和乙醇胺1-30mg/L。
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