CN110124027B - 一种牛轮状病毒、牛冠状病毒二联灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种牛轮状病毒、牛冠状病毒二联灭活疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种预防牛轮状病毒、牛冠状病毒的二联灭活疫苗及其制备方法。本发明所述疫苗其有效成分包括牛轮状病毒和牛冠状病毒的灭活抗原，该二联灭活疫苗的抗原成分可经传代细胞系(针对牛轮状病毒与牛冠状病毒)或微载体悬浮培养(针对牛轮状病毒)进行病毒增殖，并对制苗工艺等进行了优化。疫苗安全、效力试验与抗体跟踪结果显示：使用本发明的二联灭活疫苗免疫牛后无不良反应，免疫怀孕牛后不导致流产。免疫牛都产生了免疫保护，新生犊牛可通过母乳获得高水平母源抗体。结果说明本发明的疫苗安全可靠，可用于预防犊牛腹泻的发生。

Description

一种牛轮状病毒、牛冠状病毒二联灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种牛轮状病毒、牛冠状病毒二联灭活疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品领域。
背景技术
犊牛腹泻是导致新生犊牛高死亡率的一种疾病，可造成严重的经济损失，其病原主要包括牛轮状病毒(Bovine Rotavirus,BRV)和牛冠状病毒(Bovine Coronavirus,BCV)。BRV属呼肠孤病毒科、轮状病毒属，为双股RNA病毒，多感染1月龄以内的犊牛，临床症状主要表现为水样腹泻、精神沉郁、食欲废绝、严重脱水与酸中毒。BCV属冠状病毒科、冠状病毒属，为单股正链RNA病毒，主要编码S、M、N、E和HE等5种蛋白，除导致犊牛腹泻外，亦可造成成年牛冬痢、出血性腹泻与各年龄段牛的呼吸道感染。BCV主要感染10日龄以内的犊牛，潜伏期1～2天，以排黄绿色稀便、血便为特征。BRV、BCV均能够单独引起犊牛腹泻，但当BRV、BCV混合感染或继发细菌、寄生虫感染后，可致死亡率上升，造成更严重的经济损失。
通常情况下，BRV、BCV均可在患病犊牛的新鲜粪便、肠道内容物中分离得到，BRV可通过接种恒河猴肾细胞(MA-104)进行病毒分离，BCV常接种人结肠癌细胞(HCT-8)进行病毒的分离鉴定。但由于BRV的病毒分离比较困难，需经一定浓度的胰蛋白酶等蛋白水解酶处理后才能有效感染细胞。
预防犊牛腹泻最好的措施是免疫疫苗，灭活疫苗安全性好，不存在散毒、毒力返强的风险，可用于怀孕牛的免疫，能够快速服务于市场，有广阔发展前景。
发明内容
本发明的目在于采用恒河猴肾细胞(MA-104)繁殖牛轮状病毒(BRV)，采用人结肠癌细胞(HCT-8)繁殖牛冠状病毒(BCV)，进而将上述两种病毒作为抗原制备成预防BRV和BCV的二联灭活疫苗。
本发明的技术方案
1.一种牛轮状病毒、牛冠状病毒二联灭活疫苗，其特征在于该灭活疫苗含有牛轮状病毒、牛冠状病毒的灭活抗原；
所述灭活抗原是牛轮状病毒JY株与牛冠状病毒YQ株，上述两株病毒已于2019年05月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为CGMCC No.17686、CGMCC No.17687；
所述二联灭活疫苗用于预防牛轮状病毒、牛冠状病毒感染引起的犊牛腹泻。
2.本发明所述的牛轮状病毒、牛冠状病毒二联灭活疫苗，其特征在于该疫苗制备步骤包括：
(1)细胞培养：将MA-104细胞采用贴壁与微载体培养的方式进行传代和培养；将HCT-8细胞采用贴壁培养的方式进行传代和培养；
(2)制苗用抗原的制备：将JY株牛轮状病毒生产种毒接种在MA-104细胞上，通过细胞繁殖获得制备疫苗用病毒抗原；将YQ株牛冠状病毒生产种毒接种在HCT-8细胞上，并通过细胞繁殖获得制备疫苗用病毒抗原；
(3)抗原灭活：将制备的病毒液使用灭活剂进行灭活；
(4)配苗：加入相应的佐剂后进行配苗。
本发明有益效果
本发明涉及一种预防牛轮状病毒、牛冠状病毒的二联灭活疫苗及其制备方法。本发明所述疫苗其有效成分包括牛轮状病毒和牛冠状病毒的灭活抗原，该二联灭活疫苗的抗原成分可经传代细胞系(针对牛轮状病毒JY株与牛冠状病毒YQ株)或微载体悬浮培养(针对牛轮状病毒JY株)进行病毒增殖，并对制苗工艺等进行了优化。疫苗安全、效力试验与抗体跟踪结果显示：使用本发明的二联灭活疫苗免疫牛后无不良反应，免疫怀孕牛后不导致流产。免疫牛都产生了免疫保护，新生犊牛可通过母乳获得高水平母源抗体。结果说明本发明的疫苗安全可靠，可用于预防犊牛腹泻的发生。
本发明涉及的生物材料资源信息
本发明制苗用毒株：牛轮状病毒JY株、牛冠状病毒YQ均为本申请人在我国国内分离获得，该两株病毒已于2019年05月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为CGMCCNo.17686、CGMCC No.17687。MA-104细胞系与HCT-8细胞系均购于中国科学院细胞库(中国科学院细胞库，上海市岳阳路320号，邮编：200031)。
附图说明
图1家兔体温趋势图，图中显示安检家兔的体温变化在正常范围之内。
图2犊牛体温趋势图，图中显示安检犊牛的体温变化在正常范围之内。
图3干奶牛体温趋势图，图中显示安检干奶牛的体温变化在正常范围之内。
本发明具体实施方式
1.BRV-JY株、BCV-YQ株的分离鉴定
(1)本发明所用毒株BRV-JY株于2016年分离自疑似发病犊牛的粪便，接种MA-104细胞后5～7天可产生细胞病变。根据BRV VP6基因保守序列设计一对特异性引物，引物序列如下：
BRV-P1：5’-ttgatgggta cgatgtggct-3’20(序列1)
BRV-P2：5’-ctggtgtcat atttggtggt ct-3’22(序列2)
RT-PCR后扩增出382bp特异性片段(序列3)。
Figure BDA0002104186550000031
(2)BCV-YQ株于2016年分离自疑似发病犊牛的粪便，接种HCT-8细胞72h后出现明显病变。根据BCV保守区域设计一对特异性引物，引物序列如下：
BCV-P1：5’-cagcaaccat caggagggaa t-3’21(序列4)
BCV-P2：5’-gcggtcctgt tccaagatag t-3’21(序列5)
RT-PCR后扩增出244bp特异性片段(序列6)。
Figure BDA0002104186550000032
2.抗原制备
(1)利用转瓶贴壁培养MA-104细胞制备BRV-JY株抗原
1)培养细胞：首先复苏MA-104细胞到细胞瓶中，生长48h左右，经EDTA-胰酶细胞分散液消化，按照体积比1:3～1:4的比例进行传代。加无血清的DMEM培养液(pH值为7.0)进行转瓶培养，细胞长满90％～100％时，用于继续传代或接种病毒。
2)制苗用抗原(病毒液)的制备：取生长良好的上述MA-104细胞，用PBS洗2～3次，将BRV-JY株按照(V/V)0.1％～0.5％的接毒量进行接种。加无血清的DMEM培养液(pH值为7.0)进行培养。5～7天后细胞80％出现CPE时将转瓶置于-20℃反复冻融2～3次，收获细胞培养病毒液作为生产用毒种。
(2)利用微载体悬浮培养技术培养MA-104细胞制备BRV-JY株抗原
1)细胞复苏及传代培养：复苏MA-104细胞到细胞瓶中，生长48h左右，经EDTA-胰酶细胞分散液消化，按照体积比1:3～1:4的比例进行传代。细胞长满90％～100％时，用PBS洗涤2～3次，加入胰酶-EDTA溶液消化，收集细胞并计数，每升培养基中加入3～5g微载体Cytodex I(购自GE公司)，按照每个微载体添加15～20个细胞的比例进行细胞接种。
2)生物反应器培养接种细胞：向生物反应器中加入细胞培养基(Gibco公司DMEM高糖培养基，无血清)，微载体投放量为3～5g/L，调节各项指标，溶氧量为35％、温度为36.7℃、搅拌速度为50～60r/min、pH为7.15～7.40；每个微载体上细胞数达到150个以上时，排出反应器中培养基，用PBS洗涤收集在容器中的微载体，并排出PBS，反复2～3次。
3)繁殖毒种：将BRV-JY株按照0.1％～0.5％的接毒量加入到生物反应器中，改变搅拌速度进行均匀接种，然后加入细胞培养基(Gibco公司DMEM高糖培养基，无血清)进行病毒繁殖，控制反应器中培养条件：溶氧量为25％、温度为36.7℃、搅拌速度为60r/min、pH为7.4。培养结束后分别收集病毒液。
(3)利用HCT-8细胞制备BCV-YQ株
1)培养细胞：首先复苏HCT-8细胞到细胞瓶中，生长48h左右，经EDTA-胰酶细胞分散液消化，按照体积比1:3～1:4的比例进行传代。加无血清的DMEM培养液(pH值为7.0)进行转瓶培养，细胞长满90％～100％时，用于继续传代或接种病毒。
2)制苗用抗原(病毒液)的制备：取生长良好的上述HCT-8细胞，用PBS洗2～3次，将BCV-YQ株按照(V/V)0.2％～0.5％的接毒量进行接种。加无血清的DMEM培养液(pH值为7.0)进行培养。72h后细胞80％出现CPE时将转瓶置于-20℃反复冻融2～3次，收获细胞培养毒液作为生产用毒种。
(3)病毒液灭活
制备的病毒液按照《中国兽药典》附录进行纯净性检验，应无细菌、霉菌、支原体，且BRV-JY株病毒含量≥107.0TCID50/ml，BCV-YQ株病毒含量≥107.5TCID50/ml。使用甲醛或BEI灭活，检验合格后，进行乳化配苗。
将检验合格的BRV-JY株、BCV-YQ株病毒，分别置于不同容器内，加入工作浓度为0.2％的甲醛或2％的BEI，30℃～37℃，灭活16～28h，BRV-JY株灭活样品取样按0.5％接种量接种MA-104细胞，BCV-YQ株灭活样品取样按0.5％接种量接种HCT-8细胞，分别盲传三代，进行灭活检测。
(4)乳化配苗
将分别制得的BRV-JY株、BCV-YQ株病毒灭活抗原按一定比例混合，使得每剂量疫苗中，灭活前两种抗原含量BRV-JY株≥107.0TCID50/ml，BCV-YQ株≥107.5TCID50/ml。将抗原缓缓注入佐剂中，按抗原:佐剂体积比1:2进行混合乳化，配制成二联灭活疫苗。
3.疫苗成品检验
(1)无菌检验按《中国兽药典》附录(中华人民共和国兽药典二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016年，本发明称《中国兽药典》)进行，应符合规定。
(2)安全性试验
1)替代动物试验：试验选用1.5～2.0kg的健康家兔7只，其中免疫组5只，对照组2只，免疫组家兔各颈部皮下注射疫苗1.0ml，对照组家兔各颈部皮下注射细胞培养物1.0ml，连续观察7天并每天下午定点测量体温，应不出现死亡及不良反应，无临床异常表现，体温正常。
选用350～400g健康豚鼠7只，其中免疫组5只，对照组2只，免疫组豚鼠各颈部皮下注射疫苗0.5ml，对照组豚鼠各颈部皮下注射细胞培养物0.5ml，连续观察7天，应不出现死亡及不良反应，无临床异常表现。
2)本体动物试验：试验选用2月龄BRV、BCV抗原、抗体双阴性(抗原阴性为RT-PCR检测为阴性，抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4)的健康易感犊牛4头，其中免疫组2头，对照组2头，免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗4.0ml，对照组牛各颈部肌肉注射细胞培养物4.0ml。连续观察14天，应不出现死亡及不良反应，无临床异常表现，体温正常。
选用BRV、BCV抗原、抗体双阴性(抗原阴性为RT-PCR检测为阴性，抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4)的干奶牛4头，其中免疫组2头，对照组2头，免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗4.0ml，对照组牛各颈部肌肉注射细胞培养物4.0ml。连续观察至试验牛产犊，应不出现死亡、流产及其他不良反应，无临床异常表现，体温正常。
(3)效力试验
1)中和抗体检测法：试验选用350～400g健康豚鼠10只(BRV、BCV血清中和抗体效价≤1:4)，其中免疫组5只，对照组5只，免疫组豚鼠各腿部肌肉注射疫苗0.2ml，对照组豚鼠各腿部肌肉注射细胞培养物0.2ml，21天后同样方式加强免疫，二免后21天心脏采血测定中和抗体水平，应至少4只豚鼠的BRV、BCV中和抗体效价≥1:64。
2)牛体免疫攻毒法：试验选用2月龄BRV、BCV抗原、抗体双阴性(抗原阴性为RT-PCR检测为阴性，抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4)的健康易感犊牛20头，其中免疫组10头，攻毒对照组10头，免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗2.0ml，21天后同样方式加强免疫，二免后21天将免疫牛随机分为BRV和BCV组，每组5头。BRV组连同攻毒对照牛5头，共计10头牛进行BRV强毒攻毒，每头牛口服20ml BRV强毒(病毒含量≥107.0TCID50/ml)；BCV组连同攻毒对照牛5头，共计10头牛进行BCV强毒攻毒，每头牛口服15ml BCV强毒(病毒含量≥107.5TCID50/ml)。攻毒后连续观察14天，每天下午定点测量体温，观察临床症状并采集肛拭子进行病原检测与病毒分离。BRV与BCV攻毒对照牛均应至少3头发病，免疫组牛均应至少4头保护。
(4)新生犊牛抗体跟踪试验
选用BRV、BCV抗原、抗体双阴性(抗原阴性为RT-PCR检测为阴性，抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4)的干奶牛10头，其中免疫组5头，对照组5头，免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗2.0ml，对照组牛各颈部肌肉注射细胞培养物2.0ml，21天后同样方式加强免疫。试验牛产犊后，对未吃初乳的新生犊牛采血，检测BRV、BCV中和抗体效价。在犊牛出生后60天采血，检测BRV、BCV中和抗体效价。BRV、BCV中和抗体效价应≥1:64。
实施例
以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。
实施例1——牛轮状病毒、牛冠状病毒二联灭活疫苗(JY株+YQ株)的制备
1.利用转瓶贴壁制备BRV-JY株、BCV-YQ株抗原
(1)培养细胞：分别复苏种细胞MA-104和HCT-8到细胞瓶中，生长48h左右，经EDTA-胰酶细胞分散液消化，按照体积比1:4的比例进行传代。加无血清的DMEM培养液(pH值为7.0)进行转瓶培养，细胞长满90％～100％时，用于继续传代或接种病毒。
(2)制苗用抗原(病毒液)的制备：取生长良好的上述MA-104细胞，用PBS洗2～3次，将BRV-JY株按照(V/V)0.5％的接毒量进行接种。加无血清的DMEM培养液(pH值为7.0)进行培养。5～7天后细胞80％出现CPE时将转瓶置于-20℃反复冻融2～3次，收获细胞培养病毒液作为生产用毒种。
取生长良好的上述HCT-8细胞，用PBS洗2～3次，将BCV-YQ株按照(V/V)0.5％的接毒量进行接种。加无血清的DMEM培养液(pH值为7.0)进行培养。72h后细胞80％出现CPE时将转瓶置于-20℃反复冻融2～3次，收获细胞培养病毒液作为生产用毒种。
2.利用微载体悬浮培养技术制备BRV-JY株抗原
(1)培养细胞：复苏MA-104细胞到细胞瓶中，生长48h左右，经EDTA-胰酶细胞分散液消化，按照体积比1:4的比例进行传代。细胞长满90％～100％时，用PBS洗涤2～3次，加入胰酶-EDTA溶液消化，收集细胞并计数，每升培养基中加入4g微载体Cytodex I(购自GE公司)，按照每个微载体添加15～20个细胞的比例进行细胞接种。
(2)生物反应器培养接种细胞：向生物反应器中加入细胞培养基(Gibco公司DMEM高糖培养基，无血清)，微载体投放量为4g/L，调节各项指标，溶氧量为25％、温度为36.7℃、搅拌速度为60r/min、pH为7.40；每个微载体上细胞数达到150个以上时，排出反应器中培养基，用PBS洗涤收集在容器中的微载体，并排出PBS，反复2～3次。
(3)制苗用抗原(病毒液)的制备：将BRV-JY株按照0.5％的接毒量加入到生物反应器中，改变搅拌速度进行均匀接种，然后加入细胞培养基(Gibco公司DMEM高糖培养基，无血清)进行病毒繁殖，控制反应器中培养条件：溶氧量为25％、温度为36.7℃、搅拌速度为60r/min、pH为7.40。培养结束后分别收集病毒液。
3.病毒液灭活
制备的病毒液按照《中国兽药典》附录进行纯净性检验，无细菌、霉菌、支原体。
病毒液病毒含量如表1。
表1病毒含量测定结果
Figure BDA0002104186550000071
结果显示BRV-JY株病毒含量不低于107.0TCID50/ml，BCV-YQ株病毒含量不低于107.5TCID50/ml。将上述病毒液用BEI灭活，检验合格后，进行乳化配苗。
(1)BEI配制：将0.4mol/L BEA和0.4mol/L NaOH按体积比1:1混合，37℃环化1h，生成BEI，调节pH至7.2～7.6。
(2)灭活及检验：将检验合格的BRV-JY株、BCV-YQ株分别置于不同容器内，加入工作浓度为2％的BEI，37℃，灭活16h，BRV-JY株灭活样品取样按0.5％接种量接种MA-104细胞，BCV-YQ株灭活样品取样按0.5％接种量接种HCT-8细胞，分别盲传三代，进行灭活检测。
(3)中和：灭活完全后，加入终浓度为0.03M的硫代硫酸钠进行中和。
4.乳化配苗
将分别制得的BRV-JY株、BCV-YQ株病毒灭活抗原按一定比例混合，使得每剂量疫苗中，灭活前抗原含量BRV-JY株不低于107.0TCID50/ml，BCV-YQ株不低于107.5TCID50/ml。将抗原缓缓注入白油佐剂中，按抗原：佐剂体积比1:2进行混合乳化，配制成二联灭活疫苗。
实施例2——牛轮状病毒、牛冠状病毒二联灭活疫苗(JY株+YQ株)的成品检验
1.无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。上述检验结果见表2。
表2物理性状、无菌检验结果
Figure BDA0002104186550000081
2.安全检验：
(1)替代动物检验：试验选用1.5～2.0kg的健康家兔7只，其中免疫组5只，对照组2只，免疫组家兔各颈部皮下注射疫苗1.0ml(两点注射，0.5ml/点)，对照组家兔各颈部皮下注射细胞培养物1.0ml(两点注射，0.5ml/点)，连续观察7天并每天下午定点测量体温，均健活，免疫组腿部注射部位触摸无异样，无腹泻等症状，精神、采食正常，体温均不高于40.0℃。选用350～400g健康豚鼠7只，其中免疫组5只，对照组2只，免疫组豚鼠各颈部皮下注射疫苗0.5ml(两点注射，0.25ml/点)，对照组豚鼠各颈部皮下注射细胞培养物0.5ml(两点注射，0.25ml/点)，连续观察7天，均健活，免疫组颈部皮下触摸无硬块，无腹泻等症状，精神、采食正常。
(2)本动物检验：试验选用2月龄BRV、BCV抗原、抗体双阴性(抗原阴性为RT-PCR检测为阴性，抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4)的健康易感犊牛4头，其中免疫组2头，对照组2头，免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗2.0ml，对照组牛各颈部肌肉注射细胞培养物2.0ml。连续观察14天，均健活，颈部肌肉注射部位触摸无异样，无腹泻等症状，精神、采食正常，体温均不高于40.0℃。
选用BRV、BCV抗原、抗体双阴性(抗原阴性为RT-PCR检测为阴性，抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4)的干奶牛4头，其中免疫组2头，对照组2头，免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗2.0ml，对照组牛各颈部肌肉注射细胞培养物2.0ml。连续观察至试验牛产犊，无腹泻等症状，无流产发生，体温均不高于40.0℃。安全检验结果及体温变化见表3、图1～3。
表3安全检验结果
Figure BDA0002104186550000091
3.效力检验
(1)中和抗体检测法试验选用350～400g健康豚鼠10只(BRV、BCV血清中和抗体效价≤1:4)，其中免疫组5只，对照组5只，免疫组豚鼠各腿部肌肉注射疫苗0.2ml，对照组豚鼠各腿部肌肉注射细胞培养物0.2ml，21天后同样方式加强免疫，二免后21天心脏采血测定中和抗体水平，4只豚鼠的BRV中和抗体效价≥1:64、5只豚鼠的BCV中和抗体效价≥1:64，具体结果见表4。
表4效力(豚鼠)检测结果
Figure BDA0002104186550000092
(2)牛体免疫攻毒法试验选用2月龄BRV、BCV抗原、抗体双阴性(抗原阴性为RT-PCR检测为阴性，抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4)的健康易感犊牛20头，其中免疫组10头，攻毒对照组10头，免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗2.0ml，21天后同样方式加强免疫，二免后21天将免疫牛随机分为BRV和BCV组，每组5头，各组单独饲养。BRV组连同攻毒对照牛5头，共计10头牛进行BRV强毒攻毒，每头牛口服20ml BRV强毒(病毒含量≥107.0TCID50/ml)；BCV组连同攻毒对照牛5头，共计10头牛进行BCV强毒攻毒，每头牛口服15ml BCV强毒(病毒含量≥107.5TCID50/ml)。攻毒后连续观察14天，每天下午定点测量体温，观察临床症状并采集肛拭子进行病原检测与病毒分离。结果见表5和表6。
表5 BRV效力(牛)检测结果
Figure BDA0002104186550000101
注：符合体温升高、腹泻、肛拭子带毒中的两项即判为发病。
表6 BCV效力(牛)检测结果
Figure BDA0002104186550000102
注：符合体温升高、腹泻、肛拭子带毒中的两项即判为发病。
实施例3——新生犊牛抗体跟踪试验
选用BRV、BCV抗原、抗体双阴性(抗原阴性为RT-PCR检测为阴性，抗体阴性即血清中和抗体效价≤1:4)的干奶牛10头，其中免疫组5头，对照组5头，免疫组牛各颈部肌肉注射疫苗2.0ml，对照组牛各颈部肌肉注射细胞培养物2.0ml，21天后同样方式加强免疫。试验牛产犊后，对未吃初乳的新生犊牛采血，检测BRV、BCV中和抗体效价。在犊牛出生后60天采血，检测BRV、BCV中和抗体效价。免疫牛产犊的新生犊牛，4/5BRV中和抗体效价≥1:64，4/5BCV中和抗体效价≥1:64，结果见表7。
表7新生犊牛抗体跟踪结果
Figure BDA0002104186550000111
结果表明，使用BRV、BCV二联灭活疫苗免疫牛后，能够有效抵抗强毒株的攻击，对BRV、BCV强毒株的保护率分别为80％、80％，且新生犊牛可通过母源抗体获得高水平的BRV、BCV抗体，至少维持2个月。
序列表
<110> 齐鲁动物保健品有限公司
<120> 一种牛轮状病毒、牛冠状病毒二联灭活疫苗及其制备方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(BRV-P1)
<400> 1
ttgatgggta cgatgtggct 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物(BRV-P2)
<400> 2
ctggtgtcat atttggtggt ct 22
<210> 3
<211> 382
<212> DNA
<213> VP6基因保守区域片段(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 3
ttgatgggta cgatgtggct caatgcggga tcagaaattc aggtcgctgg attcgactat 60
tcatgtgcaa ttaacgcacc agctaatacg caacaatttg agcatattgt acagcttcga 120
agggtattga ctacagctac aataactctt ttacccgatg ctgaaagatt tagttttcca 180
agagtgatta tttcagcaga tggagcgact acatggtatt ttaatccagt gattcttaga 240
ccaaataacg ttgaagttga gtttctacta aacgggcaga ttattaatac ttaccaagca 300
agatttggga cgatcgtcgc aagaaatttt gatacaatta gattgtcatt tcagttgatg 360
agaccaccaa atatgacacc ag 382
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(BCV-P1)
<400> 4
cagcaaccat caggagggaa t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物(BCV-P2)
<400> 5
gcggtcctgt tccaagatag t 21
<210> 6
<211> 244
<212> DNA
<213> 牛冠状病毒基因保守区域片段(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 6
cagcaaccat caggagggaa tgttgtaccc tactattctt ggttctctgg aattactcag 60
tttcaaaagg gaaaggagtt tgaatttgca gagggacaag gtgtgcctat tgcaccagga 120
gtcccagcta ctgaagctaa agggtactgg tacagacaca acagacgttc ctttaaaaca 180
gccgatggca accagcgtca attgctgcca cgatggtatt tttactatct tggaacagga 240
ccgc 244

Claims (1)

1.一种牛轮状病毒、牛冠状病毒二联灭活疫苗，其特征在于，该灭活疫苗含有牛轮状病毒、牛冠状病毒的灭活抗原；
所述灭活抗原是牛轮状病毒JY株与牛冠状病毒YQ株分别制备的，上述两株病毒已于2019年05月16日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号分别为CGMCC No.17686、CGMCCNo.17687；
所述二联灭活疫苗用于预防牛轮状病毒和牛冠状病毒感染引起的犊牛腹泻；
该疫苗的制备步骤包括：
（1）细胞培养：将恒河猴肾细胞MA-104采用贴壁培养与微载体培养的方式进行传代和培养；将人结肠癌细胞HCT-8采用贴壁培养的方式进行传代和培养；
（2）制苗用抗原制备：将JY株牛轮状病毒接种在MA-104细胞上，通过细胞繁殖获得制备疫苗用病毒抗原；将YQ株牛冠状病毒接种在HCT-8细胞上，并通过细胞繁殖获得制备疫苗用病毒抗原；
（3）抗原灭活：将制备的病毒液使用灭活剂BEI进行灭活；
（4）配苗：加入相应的佐剂后进行配苗。
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