CN117070475B - 牛轮状病毒无血清悬浮培养方法及其产品和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽用制品技术领域，尤其涉及一种牛轮状病毒无血清悬浮培养方法及其产品和应用。本发明所述牛轮状病毒无血清悬浮培养方法以猪小肠黏膜上皮细胞为宿主细胞，接毒培养，得到牛轮状病毒培养液。市面上对于牛轮状病毒敏感的细胞种类非常较少，大部分仅局限于贴壁细胞培养。本发明偶然发现，猪小肠黏膜上皮细胞具有无血清悬浮培养潜力，经常规无血清悬浮培养驯化后，能稳定连续增殖，且在牛轮状病毒的培养中表现出特殊优势：无需添加血清，即可稳定培养获得高效价BRV病毒培养液。且利用获得的病毒培养液制备得到的灭活疫苗免疫原性良好，能够有效的预防由牛轮状病毒引起的犊牛腹泻。

Description

牛轮状病毒无血清悬浮培养方法及其产品和应用

技术领域

本发明涉及兽用制品技术领域，尤其涉及一种牛轮状病毒无血清悬浮培养方法及其产品和应用。

背景技术

牛轮状病毒(Bovine rotavirus，BRV)为呼肠孤病毒科轮状病毒属，无囊膜双链RNA 病毒，直径大约60～80纳米，是一个对称的二十面体，镜下观察可以看到典型的“车轮状”，而且该病毒增殖时候需要加入胰酶消化VP4蛋白，从而提高病毒的感染性，目前该轮状病毒通过粪口或者呼吸道途径进行传播，潜伏期为 24 至 48小时，犊牛感染病毒后，会表现出特征性的临床症状，并出现严重的腹泻症状，机体严重脱水，最终导致心力衰竭和代谢性酸中毒而死亡。轮状病毒发病率较高，有时高达100%，国内尚未有商品化的疫苗。

相关研究发现，对于牛轮状病毒敏感的细胞种类非常较少，大部分仅局限于贴壁细胞培养。国内多用贴壁MA104（非洲绿源猴肾细胞）细胞扩增牛轮状病毒，但该细胞本身比较脆弱，不易成活，培养过程中也需要使用胎牛血清才可以健康生长，在工艺放大过程中出现诸多缺点。首先使用MA104细胞生产抗原，会明显提高生产的成本。另外，传统贴壁细胞在工艺放大过程中较为繁琐，也存在培养批量小、批件差异大、生产效率低下、劳动强度大、占用场地多等诸多问题。为了降低BRV抗原生产成本、提高其抗原生产效率及生产质量，使用悬浮培养工艺扩大BRV生产规模，是替代原有贴壁生产技术的最佳途径，但是由于MA104细胞自生特性，很难通过悬浮驯化工艺将其驯化为悬浮细胞，而且目前为止也未见MA104悬浮驯化研究的内容。另外，牛轮状病毒需要辅助胰酶条件下才可有效增殖，目前为止大部分悬浮细胞或多或少需要血清才能维持细胞稳定生长，但是悬浮细胞中的血清会在细胞接种病毒后影响病毒的增殖。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种牛轮状病毒无血清悬浮培养方法，该方法以猪小肠黏膜上皮细胞（SIEC）为宿主细胞，结合后续对培养条件的优化调整，可实现牛轮状病毒（BRV）的无血清悬浮培养，在不添加血清的情况下增殖牛轮状病毒，获得高效价的BRV病毒培养液。

具体地，本发明提供的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种牛轮状病毒无血清悬浮培养方法，该方法以猪小肠黏膜上皮细胞为宿主细胞，接毒培养，得到牛轮状病毒培养液。

市面上对于牛轮状病毒敏感的细胞种类非常较少，大部分仅局限于贴壁细胞培养。国内多用贴壁MA104细胞扩增牛轮状病毒，但该细胞本身比较脆弱，不易成活，培养过程中也需要使用胎牛血清才可以健康生长，在工艺放大过程中存在成本高、培养批量小、操作繁琐等问题。

本发明偶然发现，猪小肠黏膜上皮细胞具有无血清悬浮培养潜力，经常规无血清悬浮培养驯化后，能稳定连续增殖，且在牛轮状病毒的培养中表现出特殊优势：无需添加血清，即可稳定培养获得高效价BRV病毒培养液。且利用获得的病毒培养液制备得到的灭活疫苗免疫原性良好，能够有效的预防由牛轮状病毒引起的犊牛腹泻。

在本发明中，所述猪小肠黏膜上皮细胞可经无血清悬浮培养驯化得到。本发明对所述无血清悬浮培养驯化的方法步骤及条件参数不作特别限定，本领域常规方法即可。优选地，所述猪小肠黏膜上皮细胞选用保藏编号为CGMCC No. 45338的猪小肠黏膜上皮悬浮细胞。

在本发明较为优选的实施方式中，所述猪小肠黏膜上皮细胞可选用专利申请号202310749406.9中的猪小肠黏膜上皮悬浮细胞（SIEC-S），该细胞由SIEC细胞经无血清悬浮驯化得到，具有细胞分散好、大小均一、活细胞密度高、可无血清悬浮培养等优点。该细胞保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，命名为SIEC-S，保藏编号为CGMCCNo. 45338。经验证，保藏编号为CGMCC No. 45338的猪小肠黏膜上皮悬浮细胞对牛轮状病毒具有高敏感性，适于牛轮状病毒的无血清悬浮培养。

在本发明所述牛轮状病毒无血清悬浮培养方法中，接毒细胞液的细胞密度优选为2.0-4.0×10⁶cells/ml，更优选为2.5-3.5×10⁶cells/ml，更优选为2.8-3.2×10⁶cells/ml，更优选为3.0×10⁶cells/ml。轮状病毒在无血清悬浮培养SIEC细胞中增殖受到细胞接种密度影响，最适细胞接毒密度在3.0×10⁶cells/ml左右，按照该密度接种后，BRV增殖后效价达到10^7.5TCID₅₀/ml以上，而低于或者高于该细胞接种密度，牛轮状病毒均达不到最佳增殖效果，而且接种高密度细胞后，细胞快速翻倍生长，但是毒价非常低。

在本发明所述牛轮状病毒无血清悬浮培养方法中，接毒病毒液的病毒效价优选≥10^6.5TCID₅₀/ml，更优选≥10^7.0TCID₅₀/ml。所述接毒病毒液的体积与所述接毒细胞液的体积比优选为0.5%-5%，更优选为0.5%-2%，更优选为2%。牛轮状病毒在无血清悬浮SIEC细胞株增殖效果受到接毒量的影响，按照体积比为2%含量接入轮状病毒后，病毒增殖效果相较最好。

在本发明所述牛轮状病毒无血清悬浮培养方法中，所述牛轮状病毒培养液的收获时间优选为所述接毒培养后的60-84h，收获时间过长会导致病毒含量下降。更优选地，所述牛轮状病毒培养液的收获时间优选为所述接毒培养后的60-72h。

在本发明所述牛轮状病毒无血清悬浮培养方法优选在接毒后补加胰酶。所述补加胰酶的方式优选为：接毒后0天（接毒后0h）补加胰酶至20-30μg/ml；接毒后1天（接毒后24h）补加胰酶至45-55μg/ml。更优选地，所述补加胰酶的方式为：接毒后0天补加胰酶至24-26μg/ml；接毒后1天补加胰酶至48-52μg/ml。

常规牛轮状病毒培养在接毒后补加胰酶的方式通常为：接毒后0天（接毒后0h）补加胰酶至50μg/ml，后续不再补加胰酶。和上述常规补加胰酶的方式相比，本发明通过在接毒后0天及接毒后1天，分两次补加胰酶的方式进行牛轮状病毒培养，病毒增殖效果相较更好。

在本发明进一步优选的实施方式中，所述牛轮状病毒无血清悬浮培养方法可采用生物反应器放大培养的方式，更适于工业化生产。

其中，所述生物反应器放大培养优选按照如下培养参数：

接毒细胞液的细胞密度为0.8-1.0×10⁶cells/ml；

接毒病毒液的病毒效价≥10^6.5TCID₅₀/ml；

所述接毒病毒液的体积与所述接毒细胞液的体积比为0.5-2%；

所述牛轮状病毒培养液的收获时间为所述接毒培养后的60-84h；

接毒后补加胰酶；所述补加胰酶的方式为：接毒后0天补加胰酶至20-30μg/ml；接毒后1天补加胰酶至45-55μg/ml。

进一步优选地，所述生物反应器放大培养的培养体积为60-80L；培养pH值为7.1-7.2；溶氧浓度DO值为44-46。上述优选方式可稳定放大培养，有助于获得更高效价的牛轮状病毒液。

本发明提供的方法使用悬浮培养技术，能够大大提高单位体积内细胞密度，使得单位体积培养液中病毒含量增高，提高病毒的生产产量和生产效率。本发明采用无血清全悬浮培养，无需血清，不仅降低了生产成本，也减少了产品杂质的引入，省略了病毒培养前细胞换液工艺，简化了病毒分纯化浓缩工艺，从而降低生产工艺的难度，降低抗原对于动物的副反应，保证产品的安全性能。本发明有效克服了大规模贴壁培养过程中受制于人员缺乏和场地小等缺点。且本发明所述方法培养的牛轮状病毒各批间质量差异小，生产的疫苗质量高。

第二方面，本发明提供了前述牛轮状病毒无血清悬浮培养方法培养得到的牛轮状病毒培养液。

该培养方法培养得到的牛轮状病毒液具有相较更高的效价，且具有良好的免疫原性。

第三方面，本发明提供了所述牛轮状病毒培养液在制备牛轮状病毒灭活疫苗中的应用。

本发明所述牛轮状病毒培养液制备得到的牛轮状病毒灭活疫苗免疫原性良好，能够有效的预防由牛轮状病毒引起的犊牛腹泻。另外，本发明所述方法有助于节约生产成本，而且还具有生产工艺简单易操作，培养环境可控、可大规模生产等优点，具有很好的经济效益和应用前景。

有益效果

本发明提供了一种牛轮状病毒无血清悬浮培养方法，该方法以猪小肠黏膜上皮细胞为宿主细胞，接毒培养，得到牛轮状病毒培养液。市面上对于牛轮状病毒敏感的细胞种类非常较少，大部分仅局限于贴壁细胞培养。本发明偶然发现，猪小肠黏膜上皮细胞具有无血清悬浮培养潜力，经常规无血清悬浮培养驯化后，能稳定连续增殖，且在牛轮状病毒的培养中表现出特殊优势：无需添加血清，即可稳定培养获得高效价BRV病毒培养液。且利用获得的病毒培养液制备得到的灭活疫苗免疫原性良好，能够有效的预防由牛轮状病毒引起的犊牛腹泻。

具体实施方式

本发明提供了一种牛轮状病毒无血清悬浮培养方法，先通过无血清悬浮培养驯化SIEC细胞，然后接毒培养，获得牛轮状病毒培养液。本发明利用SIEC无血清悬浮细胞扩大培养牛轮状病毒后，可将获得的病毒液进一步用于牛轮状病毒灭活疫苗的生产。

具体步骤如下：

（1）无血清悬浮培养驯化SIEC细胞

本发明通过定向连续驯化的方式，驯化得到一种具有无血清悬浮培养潜力的猪小肠黏膜上皮悬浮细胞：CGMCC No. 45338。该悬浮株倍增时间为24h，而且稳定连续传代，培养最大细胞浓度维持在10×10⁶个/ml，可以使用生物反应器进行大规模培养。

（2）放大待接种的适应无血清的全悬浮培养的SIEC细胞

将摇瓶中SIEC无血清悬浮细胞转入反应器中，再使用无血清CD PK15 259培养基将SIEC无血清悬浮细胞悬液稀释至密度为0.8～1.0×10⁶个/ml，调整温度为37℃、溶氧为40%-60%，pH值在7.0-7.2，转速为60-80rmp条件下培养48-52h至反应器中细胞密度达到1.8×10⁶个/ml-2.2×10⁶个/ml后可以连续传代培养，如果该细胞需要连续放大培养的话，则反应器中的细胞可以继续培养48-72h，细胞浓度可到达6～8×10⁶个/ml，再转移到更大的反应器中培养，从而实现连续放大工艺，应用于大规模抗原培养过程中。

（3）种毒的培养及制备

取生长良好的MA104贴壁细胞，待细胞长满单层后弃去原有培养液，更换为含有5ug/ml的DMEM病毒维持液，再次按照0.5%（体积比）接入牛轮状病毒（金宇保灵生物药品有限公司）后，在36～37℃培养，待细胞CPE（细胞病变效应）达到80%-85%以上时，收获病毒液作为种毒，用于牛轮状病毒无血清悬浮培养使用。

（4）牛轮状病毒在SIEC无血清悬浮细胞的接种方法

SIEC无血清悬浮细胞培养，加入无血清CD PK15 259培养基培养，使细胞浓度达到4×10⁶个/ml～6×10⁶个/ml时，离心去上清，重悬细胞，调整细胞密度到2.8×10⁶个/ml-3.2×10⁶个/ml用于接毒。

接毒量按照体积比为主（V/V），按照病毒与细胞培养基的体积比为0.5/100-5/100之间接种，优选的体积比为5/1000-2/100。

病毒接种需要添加胰蛋白酶，添加方式接毒时一次性加入50ug/ml胰蛋白酶，或者接毒当天添加25ug/ml胰蛋白酶，48h后再次添加25ug/ml胰蛋白酶，优选分两次来添加胰蛋白酶。

接毒的培养液按照时间取样，由接毒后24h-96h进行取样并收获一部分，检测培养液的病毒滴度，优化后病毒收获时间为60-72h。

（5）牛轮状病毒悬浮培养放大

按照步骤（2）的方法使用生物反应器对SIEC无血清悬浮细胞进行放大培养，使用无血清培养基调整细胞密度到2.0×10⁶个/ml-3×10⁶个/ml，按照体积比（V/V）为5/1000-2/100接种牛轮状病毒，接毒的同时添加25ug/ml的胰蛋白酶，待培养24h后再次添加25ug/ml，接毒后细胞密度恒定在4.0-5.0×10⁶个/ml范围内，细胞活率维持在90%以上，接毒后72h-80h收获病毒液，滴度最高能达到10^8.00TCID₅₀/ml，而且接毒收获时间为60-72h之间，收获后的病毒滴度能稳定达到10^7.50TCID₅₀/ml。

（6）牛轮状病毒灭活疫苗的制备技术：

将步骤（5）中得到的病毒液使用500Kda（GE）中空纤维浓缩柱进行纯化浓缩，浓缩使用2-5%的甲醛进行灭活处理44-48h后，将上述的灭活抗原液与油乳佐剂按照体积比（1:0.8-1.2）配制牛轮状病毒灭活疫苗。

基于以上方案，本发明提供了一种牛轮状病毒无血清悬浮培养方法及其产品和应用。

本发明提供的方法通过无血清悬浮细胞培养扩大依赖胰酶病毒，为依赖胰酶病毒扩大增殖提供了一种新型有效的研发思路。解决了生产BRV抗原过程中难以彻底清除细胞培养所携带血清的技术问题。

本发明通过对接毒细胞密度、接毒量、接毒胰酶添加方式等技术特征的优化，提供了一种利用SIEC无血清悬浮细胞扩大培养牛轮状病毒的最佳工艺，攻克了牛轮状病毒仅通过贴壁生产工艺来获得抗原的技术难题，通过本发明所述方法，使得依赖胰酶牛轮状病毒可以稳定增殖，并且获得高病毒含量的病毒液。

与传统贴壁生产工艺或者低血清悬浮培养工艺相比，本发明提供的牛轮状病毒无血清悬浮培养工艺能够节省大量的生产成本，而且可以避免培养过程中血清清除，简化了培养工艺过程，降低生产工艺的难度，进而提升产能。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。

实施例1 SIEC无血清悬浮株的复苏与传代鉴定

SIEC-S CGMCC NO.45338悬浮株复苏：

首先将CD PK15 259培养基预热到37℃，取冻存SIEC悬浮细胞株，置于37℃水浴中，快速摇动，确保细胞能够快速融化，将吸取细胞液转移至已经装有30-40ml预热好的CDPK15259培养基的离心管中，并反吸1ml于细胞冻存管中，清洗冻存管壁后，将其转移到离心管中，将离心管于800rpm-1200rpm条件下离心5min后，弃上清，加入20-25ml预热的CD PK15259营养液，缓慢吹打沉淀，重悬细胞，并且调整细胞浓度为0.8-1.0×10⁶个/ml左右。

SIEC悬浮株传代：

将复苏SIEC悬浮细胞转移至摇瓶中，将其放入摇床培养，培养条为，35-37℃，5%CO₂，100rpm/min-130rmp/min，持续培养72h，期间每天计数和取样，测定细胞密度和活率，待细胞密度达到4.0×10⁶个/ml左右时，细胞活力达到95%以上，进行细胞传代，按照相同方式连续传代，观察细胞如果能按照以上方式持续稳定生长，并持续传3代以上，则该细胞液可以用做后期牛轮状病毒悬浮培养使用。

实施例2 不同细胞接种密度对牛轮状病毒在无血清悬浮的SIEC细胞株增殖培养影响

本实施例中，各材料来源如下所示：

病毒：效价不低于10^7.0TCID₅₀/ml的牛轮病毒（金宇保灵生物制品有限公司）。

细胞：无血清全悬浮培养的SIEC细胞株，其中接毒使用细胞代次为细胞工作库复苏后的3-20代之内。

无血清培养基： CD PK15 259无血清培养基。

从液氮罐中取出冻存的无血清悬浮的SIEC细胞株，按照实施例1中方法对其复苏并传代2-3次后，待细胞能稳定生长且细胞浓度达到4-6.0×10⁶cells/ml后，1500r/min离心5min后弃掉上清液，使用营养液重悬细胞沉淀并计数，调整细胞浓度分别到2.0×10⁶cells/ml、3.0×10⁶cells/ml和4.0×10⁶cells/ml后，之后分别接种2%的牛轮状病毒株置于37℃，含5%CO₂ 恒温摇床中培养，按照接毒同时补加胰酶浓度到25ug/ml，接毒后第1天再次补加胰酶浓度到50ug/ml，并且于68-72h进行取样，并检测样品中的BRV的效价。

取样后，进行BRV效价检测，结果如下所示：

表1.不同细胞接毒密度对BRV在无血清悬浮的SIEC细胞株增殖培养影响

上表结果显示，轮状病毒在无血清悬浮培养SIEC细胞株中增殖是受到细胞接种密度影响，最适细胞接毒密度为3.0×10⁶cells/ml，按照该密度接种后，BRV增殖后效价为10^6.75TCID₅₀/0.1ml，而低于或者高于该细胞接种密度，牛轮状病毒均达不到最佳增殖效果，而且接种高密度细胞后，细胞快速生长，但是毒价非常低，所以3.0×10⁶cells/ml为最佳接种密度。

实施例3 不同接毒量对牛轮状病毒在无血清悬浮的SIEC细胞株增殖培养影响

本实施例中，各材料来源如下所示：

病毒：由实施例2中收获的效价不低于10^7.0TCID₅₀/ml的牛轮病毒，是由金宇保灵生物制品有限公司鉴定并保存的。

细胞：无血清全悬浮培养的SIEC细胞株，其中接毒使用细胞代次为细胞工作库复苏后的3-20代之内。

无血清培养基： CD PK15 259无血清培养基。

从液氮罐中取出冻存的无血清悬浮的SIEC细胞株，按照实施例1中方法对其复苏并传代2-3次后，待细胞能稳定生长且细胞浓度达到4-6.0×10⁶cells/ml后，1500r/min离心5min后弃掉上清液，使用营养液重悬细胞沉淀并计数，调整细胞浓度到3.0×10⁶cells/ml后，取牛轮状病毒液，按照病毒液与细胞培养液体积比为5‰、2%和5%接入牛轮状病毒，置于37℃，含5%CO₂ 恒温摇床中培养。按照接毒同时补加胰酶浓度到25ug/ml，接毒后第1天再次补加胰酶浓度到50ug/ml，按照上述相同方式进行3次重复实验，并且培养后68-72h进行取样，并检测样品中的BRV的效价。

取样后，进行BRV效价检测，结果如下所示：

表2.不同细胞接毒密度对BRV在无血清悬浮的SIEC细胞株增殖培养影响

表2的接毒量结果显示：牛轮状病毒在无血清悬浮SIEC细胞株增殖效果受到接毒量的影响，按照体积比为2%含量接入轮状病毒后，病毒增殖效果最好，其效价在10^{6.50- 7.00}TCID₅₀/0.1ml之间，而且接毒量太高或者太低对于病毒增殖效果均一般，因此后续的牛轮状病毒接种最佳接毒量为按照培养液体积比为2%，而且牛轮状病毒悬浮培养驯化按照上述接种方式进行。

实施例4 不同收获时间对牛轮状病毒在无血清悬浮的SIEC细胞株增殖培养影响

本实施例中，各材料来源如下所示：

病毒：由实施例2中收获的效价不低于10^7.0TCID₅₀/ml的牛轮病毒，是由金宇保灵生物制品有限公司鉴定并保存的。

细胞：无血清全悬浮培养的SIEC细胞株，其中接毒使用细胞代次为细胞工作库复苏后的3-20代之内。

无血清培养基：CD PK15 259无血清培养基。

从液氮罐中取出冻存的无血清悬浮的SIEC细胞株，按照实施例1中方法对其复苏并传代2-3次后，待细胞能稳定生长且细胞浓度达到4-6.0×10⁶cells/ml后，1500r/min离心5min后弃掉上清液，使用营养液重悬细胞沉淀并计数，调整细胞浓度到3.0×10⁶cells/ml后，取牛轮状病毒液，按照病毒液与细胞培养液体积比为2%接入牛轮状病毒，置于37 ℃，含5%CO₂ 恒温摇床中培养。按照接毒同时补加胰酶浓度到25ug/ml，接毒后第1天再次补加胰酶浓度到50ug/ml，并且培养后24h、48h、60h、72h、84h和96h进行取样，并检测样品中的BRV的效价。

取样后，进行BRV效价检测，结果如下所示：

表3 不同病毒收获时间的病毒检验结果（TCID50）

结果显示，不同时间内取样BRV效价见上表，最佳病毒收获时间为病毒接入后72h，其效价为10^7.00TCID₅₀/0.1ml，在60h病毒含量在不断增加，在84h后病毒含量出现下降趋势，所以设定最佳的收获时间为 60h-72h之间，而且牛轮状病毒悬浮培养驯化收获时间也按照上述最佳时间点设置。

实施例5 不同胰酶补加方式对牛轮状病毒在无血清悬浮的SIEC细胞株增殖培养影响

本实施例中，各材料来源如下所示：

病毒：由实施例2中收获的效价不低于10^7.0TCID₅₀/ml的牛轮病毒，是由金宇保灵生物制品有限公司鉴定并保存的。

细胞：无血清全悬浮培养的SIEC细胞株，其中接毒使用细胞代次为细胞工作库复苏后的3-20代之内。

无血清培养基：CD PK15 259无血清培养基。

从液氮罐中取出冻存的无血清悬浮的SIEC细胞株，按照实施例1中方法对其复苏并传代2-3次后，待细胞能稳定生长且细胞浓度达到4-6.0×10⁶cells/ml后，1500r/min离心5min后弃掉上清液，使用营养液重悬细胞沉淀并计数，调整细胞浓度到3.0×10⁶cells/ml后，取牛轮状病毒液，按照病毒液与细胞培养液体积比为2%接入牛轮状病毒，将接种后细胞分为2份，均置于37 ℃，含5%CO₂ 恒温摇床中培养，进行不同胰酶补加方式，其一份是接毒后0h一次性补加胰酶到50ug/ml，另一份胰酶补加方式与实施例4是一致的。培养后68-72h进行取样，并检测样品中的BRV的效价。

取样后，进行BRV效价检测，结果如下所示：

表4.不同胰酶补加方式对牛轮状病毒在无血清悬浮的SIEC细胞株增殖培养影响

由上表可以看出来，BRV在无血清悬浮的SIEC细胞株增殖效果随着胰酶补加方式不同，也具有一定的差异，通过以上2种不同胰酶补加方式，结果显示，采用第2种胰酶补加方式，其病毒增殖的效果会更好，其效价能够达到10^7.00TCID₅₀/0.1ml，因此后续的牛轮状病毒悬浮接种实验按照第2种方式进行胰酶的补加。

实施例6 牛轮状病毒在无血清悬浮的SIEC细胞株中连续传代驯化

本实施例中，各材料来源如下所示：

病毒：由实施例2中牛轮状病毒收获液的效价不低于10^7.0TCID₅₀/ml，是由金宇保灵生物制品有限公司鉴定并保存的。

细胞：无血清全悬浮培养的SIEC细胞株，其中接毒使用细胞代次为细胞工作库复苏后的3-20代之内。

无血清培养基：CD PK15 259无血清培养基。

从液氮罐中取出冻存的无血清悬浮的SIEC细胞株，按照实施例1中方法对其复苏并传代2-3次后，待细胞能稳定生长且细胞浓度达到4-6.0×10⁶cells/ml后，1500r/min离心5min后弃掉上清液，使用营养液重悬细胞沉淀并计数，调整细胞浓度到3.0×10⁶cells/ml后，取牛轮状病毒液，按照病毒液与细胞培养液体积比为2%接入牛轮状病毒，置于37 ℃，含5%CO₂ 恒温摇床中培养，接毒同时补加胰酶浓度到25ug/ml，接毒后第1天再次补加胰酶浓度到50ug/ml，按照以上方式培养BRV，连续传代3次后，即F5、F6、F7代病毒，培养后68-72h进行取样，并检测样品中的BRV的效价。

取样后，进行BRV效价检测，结果如下所示：

表5.牛轮状病毒在无血清悬浮的SIEC细胞株中连续传代驯化

从表中结果看出，随着在无血清悬浮的SIEC细胞株中连续传代驯化，牛轮状病毒能够很好的适应该细胞，按照2%接毒后，完成收获液检测后发现，毒价稳定在10^6.5以上，而且随之连续传代，毒价有稳定上升的趋势，所以选择无血清悬浮的SIEC细胞株作为培养牛轮状病毒靶细胞具有非常广阔的应用价值。

实施例7 采用生物反应器放大培养BRV

悬浮SIEC细胞工作种细胞1-2支，离心后加入CD PK15 259转于摇瓶中，在37℃，含有5%CO₂的摇床培养48h-72h后调整细胞浓度到0.8-1.0×10⁶个/ml，随后将其转入15L生物反应器中（eppendorf）中，调节温度为37℃，pH为7.2，DO为45，条件下继续培养3-4天后，待细胞浓度达到8-10×10⁶个/ml后，转入100L生物反应器中，加入CD PK15 259溶液调节细胞浓度到0.8-1.0×10⁶个/ml，100L反应器中最佳培养体积为60-80L，调节温度为37℃，pH为7.4，DO为45，按照维持液的2%接入生产种毒F9，设定培养参数（pH为7.2、DO为45，温度为 37℃）进行悬浮培养，待细胞浓度达到6-8×10⁶个/ml后，沉降细胞，使用CD PK15 259溶液调整细胞浓度到2.8~3.2×10⁶个/ml，接毒同时补加胰酶浓度到25ug/ml，接毒后第1天再次补加胰酶浓度到50ug/ml，继续培养待培养到60-72h后收获病毒液，并检测样品中的BRV的效价。

牛轮状病毒放大培养后取样，并对BRV效价检测、收获后细胞活力和细胞密度检测后，结果如下所示：

由上表可知，将无血清悬浮SIEC细胞，由摇瓶到15L再到100L生物反应器放大培养工艺，将放大到100L的无血清悬浮SIEC细胞接种BRV，并按照相同的方法重复培养3批抗原，均可以获得毒力较强的病毒培养液，培养结束后细胞活力依然非常高，但是细胞浓度却均维持在4.2-4.5 ×10⁶个/ml之间，没有大幅度的增殖，而且病毒的滴度维持在10^{7.5- 8.0}TCID₅₀/ml。通过上述结果可知，本发明提供的无血清悬浮SIEC细胞株，可以采用生物反应器扩大培养BRV，而且接毒时无需进行换液操作，BRV能够在细胞中稳定增殖，放大到100L反应器接毒并且培养72h左右后，最终获得了质量较高的病毒液，为生产优质疫苗提供有效保证。

实施例8 牛轮状病毒灭活疫苗的制备

病毒液纯化浓缩：将实施例7中的牛轮状病毒液，离心收集上清液，浓缩7-10倍备用。

牛轮状病毒浓缩液灭活、乳化及分装保存：向浓缩病毒液中加入灭活液，加入油乳佐剂，37℃混合搅拌30min后，制得油乳剂疫苗，4℃过夜分装，并且加盖密封后，4℃可以长期保存。

牛轮状病毒灭活疫苗的检测

外观：乳白色略带粘滞性乳状液。

剂型：水包油包水型。

稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不多于0.5ml。

黏度：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。

装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。

无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

安全检验：选取2月龄BRV健康易感牛（牛轮状病毒中和抗体效价不高于1:8，抗原为阴性）的犊牛5头，肌肉注射疫苗4ml（2头份），连续观察14日。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

效力检验-免疫攻毒法：选取3日龄内的新生犊牛（牛轮状病毒中和抗体效价不高于1:8，BRV抗原检测为阴性）10头，随机分为2组。第一组5头肌肉注射疫苗2ml，免疫后30日同样方法加强免疫1次；另一组5头牛不接种疫苗作为对照。对两组新生犊牛进行攻毒，每头牛接种10ml牛轮状病毒（病毒含量应不低于10^7.00TCID₅₀/0.1ml），口服灌喂。连续观察7-10日，攻毒对照组牛应至少4头发病，免疫攻毒组牛应至少4头保护。

使用实施例7中的BRV病毒液，按照本实施例方法配制相应的牛轮状病毒灭活疫苗，通过安全性及效力检验结果显示，上述疫苗中抗原的免疫原性好，且稳定安全，能够有效预防因牛轮状病毒导致犊牛腹泻的疾病发生。

无血清悬浮的SIEC细胞株相比目前对于传统培养MA104贴壁细胞培养牛轮状病毒，该细胞倍增时间短（约24h左右），增殖密度高，能达到10×10⁶个/mL，所以在轮状病毒悬浮中工艺放大过程中不存在技术问题，这样可以大大缩减抗原的生产时间，提高了病毒疫苗的生产效率，而且悬浮培养后病毒效价与贴壁培养几乎一致，滴度较高，收获后的抗原无需使用高倍数的复杂的浓缩纯工艺即可使用，这大大节省成本，高效快速的为市场提供优质产品，为畜禽产业保驾护航，最大限度保护了养殖户的经济利益。

无血清悬浮的SIEC细胞株已经完全实现了无血清全悬浮培养技术，对于传统的低血清悬浮培养技术以及微载体培养的培养基中需要添加血清的培养方式，SIEC细胞株在培养牛轮状病毒时无需添加血清，从而有效节省疫苗生产成本，也摆脱了由于低血清悬浮细胞接毒前需要清除血清工艺的限制，从而实现了真正意义上的大规模培养生产，另外由于工艺全程均不需要使用血清，从而大大降低了同源病原物及杂质的引入，简化产品后期纯化过程，大大提高了产品的安全性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.牛轮状病毒无血清悬浮培养方法，其特征在于，以猪小肠黏膜上皮细胞为宿主细胞，接毒培养，得到牛轮状病毒培养液；

其中，所述猪小肠黏膜上皮细胞选用保藏编号为CGMCC No. 45338的猪小肠黏膜上皮悬浮细胞；接毒后补加胰酶；所述补加胰酶的方式为：接毒后0天补加胰酶至20-30μg/ml；接毒后1天补加胰酶至45-55μg/ml。

2.根据权利要求1所述牛轮状病毒无血清悬浮培养方法，其特征在于，所述猪小肠黏膜上皮细胞经无血清悬浮培养驯化。

3.根据权利要求1或2所述牛轮状病毒无血清悬浮培养方法，其特征在于，接毒细胞液的细胞密度为2.0-4.0×10⁶cells/ml。

4.根据权利要求3所述牛轮状病毒无血清悬浮培养方法，其特征在于，接毒病毒液的病毒效价≥10^6.5TCID₅₀/ml。

5.根据权利要求4所述牛轮状病毒无血清悬浮培养方法，其特征在于，接毒病毒液的病毒效价≥10^7.0TCID₅₀/ml；且所述接毒病毒液的体积与所述接毒细胞液的体积比为0.5-5%。

6.根据权利要求5所述牛轮状病毒无血清悬浮培养方法，其特征在于，所述牛轮状病毒培养液的收获时间为所述接毒培养后的60-84h。

7.根据权利要求1或2所述牛轮状病毒无血清悬浮培养方法，其特征在于，采用生物反应器放大培养：

接毒细胞液的细胞密度为0.8-1.0×10⁶cells/ml；

接毒病毒液的病毒效价≥10^6.5TCID₅₀/ml；

所述接毒病毒液的体积与所述接毒细胞液的体积比为0.5%-2%；

所述牛轮状病毒培养液的收获时间为所述接毒培养后的60-84h；

接毒后补加胰酶；所述补加胰酶的方式为：接毒后0天补加胰酶至20-30μg/ml；接毒后1天补加胰酶至45-55μg/ml。