CN109280648B - 一种制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的方法、抗原蛋白复合物及其应用 - Google Patents

一种制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的方法、抗原蛋白复合物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109280648B
CN109280648B CN201711385744.XA CN201711385744A CN109280648B CN 109280648 B CN109280648 B CN 109280648B CN 201711385744 A CN201711385744 A CN 201711385744A CN 109280648 B CN109280648 B CN 109280648B
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
antigen
cell
culture
mink
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711385744.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN109280648A (zh
Inventor
任飞
王春霞
王彬
叶明�
闫如勋
席娜
张亭亭
吕文雪
王勇
王玉明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jl Teyan Biological Technology LLC
Original Assignee
Jl Teyan Biological Technology LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jl Teyan Biological Technology LLC filed Critical Jl Teyan Biological Technology LLC
Priority to CN201711385744.XA priority Critical patent/CN109280648B/zh
Publication of CN109280648A publication Critical patent/CN109280648A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109280648B publication Critical patent/CN109280648B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14051—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的方法、抗原蛋白复合物及其应用，属于生物制药领域。用低血清培养基悬浮F81‑TY株细胞培养驯化水貂细小病毒性肠炎病毒，驯化后的病毒接种到低血清悬浮F81‑TY株细胞培养液中，培养增殖后收获毒液，制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物。本发明使得水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物实现了从转瓶贴壁培养向大规模细胞悬浮培养的转变，这不仅简化了生产工艺，降低了生产成本，还大大提高了产品的产量和质量。

Description

一种制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的方法、抗原 蛋白复合物及其应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种抗原蛋白复合物的制备方法、抗原蛋白复合物及其应用。
背景技术
水貂细小病毒肠炎是由细小病毒引起水貂一种急性、烈性和高度接触性传染病，主要以剧烈腹泻为主要特征。毛皮动物养殖危害最大的三大传染病之一。给养殖业带来了巨大的经济损失。F81细胞即猫肾传代细胞，广泛用于病毒抗原制备的研究。传统F81细胞为贴壁依赖性生长的细胞，生产疫苗时用10升或者15升转瓶进行贴壁培养细胞再制备病毒抗原复合物。在生产水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物时，首先是用含10％新生牛血清细胞培养液将种子细胞多次传代扩大培养到一定瓶数时，再将培养液弃掉，接种相应的水貂细小病毒后，换加含2％新生牛血清的细胞维持液，待病毒增殖使细胞病变达一定程度后，收获全部病毒液，冻融后进行灭活、乳化等工艺制备抗原复合物。传统转瓶工艺过程繁琐复杂周期长、劳动强度大、费工费力，且质量不稳定，批间差异大，制备的病毒抗原复合物注射动物后副反应较高。
发明内容
为克服上述生产水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物过程繁琐复杂周期长、劳动强度大、费工费力，且质量不稳定，批间差异大，制备的病毒抗原复合物注射动物后副反应较高等问题，本发明提供一种使用低血清悬浮培养F81-TY株细胞制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的方法、抗原蛋白复合物及其应用。
首先，本发明的目的是筛选和驯化一株适应低血清悬浮F81-TY株细胞培养的水貂细小病毒适应株用于水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的生产。
本发明的技术方案为：用低血清培养基悬浮F81-TY株细胞培养驯化水貂细小病毒性肠炎病毒，驯化后的病毒接种到低血清培养液培养的F81-TY株细胞培养液，培养增殖后收获毒液，制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物。
上述方法具体包括以下步骤：
1.F81-TY株细胞复苏；2.将步骤1得到的复苏后的F81-TY株细胞用低血清培养液进行放大培养，得到F81-TY株细胞培养液；3.水貂细小病毒性肠炎病毒进行低血清培养基悬浮F81-TY株细胞培养驯化，筛选出驯化的水貂细小病毒性肠炎病毒；4.接种步骤3得到的驯化后水貂细小病毒性肠炎病毒至步骤2得到的F81-TY株细胞培养液，增殖后收获毒液；5.利用步骤4得到的毒液制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物；所述步骤按照步骤1、2、3、4、5的顺序进行，或按照步骤3、1、2、4、5的顺序进行。
所述步骤1的具体方法为：
取液氮冻存的F81-TY株悬浮培养型细胞，置于37℃水浴中快速解冻并接种于含有低血清悬浮培养液400mL的摇瓶中，血清浓度1-5％，置于37℃、60rpm、5％(v/v)CO2摇床培养72小时，细胞密度达3.0×106个/mL以上，细胞活力≧95％得到复苏后的F81-TY株细胞。
所述步骤2的具体方法为：
A)把步骤1得到的复苏后的F81-TY株细胞按照与培养液体积比1:4接种于装有低血清培养液的摇瓶中，于37℃5％CO2摇床培养72小时，60r/min；当悬浮细胞数量不低于3.0×106个/mL，细胞活力≧95％时，得到摇瓶生长的细胞悬浮液；将摇瓶生长的细胞悬浮液直接接种到齐志BC-7L型(工作体积5L)生物反应器，接种体积为1000-2000mL，补加低血清培养液至5.0L，反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为60-75rpm，温度37℃、PH 7.1，培养36小时后溶氧设定为50％，继续培养36小时后的细胞培养液细胞密度不低于2.5×106个/mL，细胞活力≧95％；B)将步骤A)中得到的细胞培养液3.5L转移至型号为齐志BC-14L型(工作体积10L)生物反应器，补加低血清培养液至10L，反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为75-85rpm，温度37℃、PH 7.1、溶氧70％，继续培养72小时进行台盼蓝染色法计数及活力检测，活细胞密度不低于2.5×106个/mL时得到可用作接毒的细胞培养液；
BC-7L型(工作体积5L)生物反应器剩余细胞培养液1.5L补加培养液至5L，按步骤A)方法继续培养，作为细胞种子连续培养。
所述步骤3的具体方法为：
1)将步骤2A)中获得的摇瓶生长的细胞悬浮液离心，1000rpm、10min，倒掉上清液，用少量低血清培养液吹打细胞沉淀使细胞呈单个散在状态，补加低血清培养液至细胞悬浮液原有体积，加入5-10％(v/v)的由贴壁F81细胞培养增殖的水貂细小病毒性肠炎病毒毒种(106.0TCID50)；2)于37℃5％(v/v)CO2摇床培养48小时，每12小时取样检测其病毒效价及血凝效价，检测悬浮细胞条件下的原病毒敏感性；3)将步骤2)中第48小时收获的病毒液按步骤1)重复接毒，接毒剂量为细胞悬浮液体积的5％，按步骤2)条件培养，每12小时取样检测其病毒效价及血凝效价；4)将步骤3)第48小时收获的病毒液按步骤1)重复接毒，接毒剂量为细胞悬浮液体积的5-10％，按步骤2)条件培养，每12小时取样检测其病毒效价及血凝效价；5)将步骤4)第48小时收获的病毒液按步骤1)重复接毒，接毒剂量为细胞悬浮液体积的5％，按步骤2)条件培养，每12小时取样检测其病毒效价及血凝效价；筛选出一株病毒效价及血凝效价最高且稳定的病毒株，即为驯化的水貂细小病毒性肠炎病毒悬浮毒株，命名为MEVB-X,并于2017年11月28日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC NO.14884，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
所述步骤4的具体方法为：
取步骤2B)得到的可用作接毒的细胞培养液，按细胞培养液体积的5-10％比例接入步骤3筛选得到的驯化的水貂细小病毒性肠炎病毒MEVB-X，培养条件为反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为75-85rpm，温度37℃、PH 7.1、溶氧70％，每12小时取样进行台盼蓝染色法细胞计数及活力检查，培养72h-96h后，活细胞密度低于5×105个/mL或细胞活性≦50％后，在无菌条件下收获病毒液。并用血凝抑制实验、TCID50检测病毒效价。
所述步骤5的具体方法为：
a)灭活：步骤4得到的毒液，过滤除去细胞碎片，按原毒液总体积的0.2％加入甲醛，充分混匀，置于37℃下灭活24h，期间振摇2-3次，每次10min；得到灭活液；
半成品检验：
无菌检验：先将步骤4收获的病毒液以组为单位分别取样，按《中国兽药典》(2005年第三部)附录15页进行，应无菌生长。
灭活检验：取上述步骤a)所得的灭活液5倍稀释后，加入终浓度为0.1％的亚硫酸氢钠，在37℃下作用24h后，分别接种4瓶正常猫肾传代细胞，每瓶接种0.4mL，置37℃下培养，24h后弃掉培养基，补加新的培养基，继续培养3日后再传代1次，细胞应不出现病变，收获培养液血凝试验呈现阴性，判定灭活合格。
b)配制：将灭活液和氢氧化铝胶按9:1(v/v)比例混合，并按终体积百分比0.01％加入硫柳汞，充分混匀，得到水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物。
所述低血清培养液，为含体积百分比1-5％的新生牛血清的F81细胞专用低血清悬浮培养液。所述低血清培养液的制备方法为：
(1)取50L包装的F81细胞专用低血清悬浮培养基干粉溶解于注射用水中，每包50L包装的培养基干粉配制成培养基的终体积为50L，本步骤中注射用水的体积为终体积的80-90％，搅拌至澄清；
(2)将所述步骤(1)中得到的溶液用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调PH至7.0，并用注射用水将溶液体积补充至终体积；
(3)将所述步骤(2)中得到的溶液加入终体积1-5％体积的新生牛血清后0.2微米滤膜过滤除菌，分装备用，于2-8℃保存。
本发明还提供上述方法制备得到的抗原蛋白复合物。
另外本发明还提供前述抗原蛋白组合物在制备诱导对水貂细小病毒性肠炎病毒的免疫应答的药物中的应用。
本发明的有益效果为：
①悬浮技术制备抗原复合物研究中，病毒增殖与收获时间与悬浮技术应用并没有相关性。本发明发现低血清悬浮培养F81-TY株细胞在水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物生产中的应用，使靶病毒快速增殖，收毒时间较传统转瓶工艺提前了24h，缩短了该抗原复合物的生产周期。悬浮培养F81-TY株细胞在水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物生产中的应用，有望终结水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的转瓶时代。
②本发明通过实验参数的调整，筛选出一株适应低血清悬浮F81-TY株细胞培养的水貂细小病毒适应株用于水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的生产。解决了传统贴壁细胞制备的病毒在悬浮细胞工艺中不易感，不增殖的弊端。为悬浮工艺在水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物制备中的应用解决了技术难点。
③本发明选用低血清悬浮F81-TY株细胞系代替传统贴壁F81细胞制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物，解决了因转瓶贴壁细胞生长瓶间、批间差异大而导致产品质量批间差异大的问题，并且为将来下游纯化工艺提供了有利条件。保证了产品质量均一稳定。
④本发明选用低血清悬浮F81-TY株细胞系代替传统贴壁F81细胞制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物，降低了血清浓度，节约生产成本的同时，减少了产品因血清因素带来的副反应。提高了产品的安全性。
⑤本发明选用低血清悬浮F81-TY株细胞系代替传统贴壁F81细胞制造水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物，细胞易于放大培养，操作简单，污染率低。使得水貂细小病毒性肠炎疫苗生产的周期缩短，人工减少，年产量增加，效益显著。
⑥本发明选用低血清悬浮F81-TY株细胞系代替传统贴壁F81细胞制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物，减少了培养基的使用量，收获的病毒液的量就是消耗的培养基量，而传统转瓶工艺消耗的培养基的量是收获病毒液的2倍。节约了生产成本。
本发明涉及的微生物资源信息
本发明涉及的细胞为：低血清悬浮细胞F81-TY株。系引进于郑州爱科生物科技有限公司。
本发明涉及的微生物为：水貂细小病毒性肠炎病毒MEVB-X悬浮株，系申请人将经典MEVB株经悬浮细胞连续传代，获得的低血清悬浮适应毒株。命名为MEVB-X悬浮株。于2017年11月28日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC NO.14884，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。
附图说明：
图1低血清悬浮培养F81-TY株24h细胞照片(100×)
图2低血清悬浮培养F81-TY株48h细胞照片(100×)
图3低血清悬浮培养F81-TY株72h细胞照片(100×)
六、具体实施方式
下列实施例中的实验方法和所用的试剂，如无特别说明，均为常规方法和常规试剂。
材料：
F81-TY株细胞株：F81-TY株低血清悬浮细胞，由郑州爱科生物科技有限公司提供。
病毒：水貂细小病毒性肠炎病毒MEVB株(贴壁细胞培养获得)，由吉林特研生物技术有限责任公司保藏。
干粉培养基：由郑州爱科生物科技有限公司提供，名称：F81细胞专用低血清悬浮培养基干粉，货号：F-6011-D。
新生牛血清(简称血清)：内蒙古金源康新生牛血清，批号：20170110。
制备低血清培养液：
(1)取50L包装的F81细胞低血清悬培养基干粉溶解于注射用水中，每包50L包装的培养基干粉配制成培养基的终体积为50L，本步骤中注射用水的体积为终体积的80-90％，搅拌至澄清；
(2)将所述步骤(1)中得到的溶液用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调PH至6.8-7.0，并用注射用水将溶液体积补充至终体积；
(3)将所述步骤(2)中得到的溶液加入终体积1-5％体积的新生牛血清后0.2微米滤膜过滤除菌，分装备用，于2-8℃保存。
仪器设备：
离心机，HITACHI CT-16RX型；悬浮细胞培养瓶(500mL；1000mL)郑州爱科生物提供；磁力搅拌器USA BELLCO公司产品
实施例一
1.F81-TY株细胞复苏
取液氮冻存的F81-TY株低血清悬浮培养型细胞冻存管，每支冻存管的细胞数至少为3.0×106个/mL，置于37℃水浴中快速解冻并接种含体积百分比1-5％牛血清的400毫升低血清培养液，于摇瓶中置于37℃5％CO2摇床培养72小时，60r/min。培养72小时后，得到复苏后的F81-TY株细胞，悬浮细胞数量可达3.0×106个/mL。
2.低血清培养液进行放大培养F81-TY株细胞培养液
A)把步骤1得到的悬浮细胞按照与培养液体积比1:4传代于4个摇瓶中，每瓶补加低血清培养液至400毫升，于37℃5％CO2摇床培养72小时，60r/min。悬浮细胞数量不低于3.0×106，细胞活力≧95％，得到摇瓶生长的细胞悬浮液，将摇瓶生长的细胞悬浮液直接全部(1600mL)接种到齐志BC-7L型(工作体积5L)生物反应器，补加低血清培养液至5.0L，反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为60rpm，温度37℃、PH 7.1，培养36小时后溶氧设定为50％，继续培养36小时后细胞密度不低于2.5×106个/mL，细胞活力≧95％。B)将步骤A)中得到的细胞培养液3.5L转移至型号为齐志BC-14L型(工作体积10L)生物反应器，补加低血清培养液至10L，反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为75-85rpm，温度37℃、PH 7.1、溶氧70％，继续培养72小时进行台盼蓝染色法计数及活力检测，活细胞密度不低于2.5×106个/mL时得到可用作接毒的细胞培养液；
BC-7L型(工作体积5L)生物反应器剩余细胞培养液1.5L补加培养液至5L，按步骤A)方法继续培养，为细胞种子连续培养。
3.水貂细小病毒性肠炎病毒进行低血清培养基悬浮F81-TY株细胞培养驯化，筛选出驯化的水貂细小病毒性肠炎病毒
1)将步骤2A)中获得的摇瓶生长的细胞悬浮液离心，1000rpm、10min，倒掉上清液，用少量低血清培养液吹打细胞沉淀使细胞呈单个散在状态，补加低血清培养液至细胞悬浮液原有体积，加入5％(v/v)的由贴壁F81细胞培养增殖的水貂细小病毒性肠炎病毒毒种(106.0TCID50)；
2)于37℃5％(v/v)CO2摇床培养48小时，每12小时取样检测其病毒效价及血凝效价；步骤1)、2)重复进行3次，检测悬浮细胞条件下的原病毒敏感性。
3)将步骤2)中第48小时收获的病毒液按步骤1)重复接毒，接毒剂量为细胞悬浮液体积的5％，按步骤2)条件培养，每12小时取样检测其病毒效价及血凝效价；
4)将步骤3)第48小时收获的病毒液按步骤1)重复接毒，接毒剂量为细胞悬浮液体积的5％，按步骤2)条件培养，每12小时取样检测其病毒效价及血凝效价；
5)将步骤4)第48小时收获的病毒液按步骤1)重复接毒，接毒剂量为细胞悬浮液体积的5％，按步骤2)条件培养，每12小时取样检测其病毒效价及血凝效价；如此连续接毒驯化5代，筛选出一株病毒效价及血凝效价最高且稳定的病毒株，即为驯化的水貂细小病毒性肠炎病毒悬浮毒株，命名为MEVB-X。
悬浮病毒株的检测：上述步骤中涉及到的病毒效价检测及血凝效价检测的具体步骤为：
①病毒效价检测：将上述适应于F81-TY株低血清悬浮细胞的待检病毒液用无血清MEM营养液(Gibco产品)作10倍系列稀释，取10-3～10-6共4个稀释度，同步接种于已加入100微升/孔F81-TY株贴壁细胞的96孔微量细胞培养板，每个稀释度设8个重复，同时设8个复孔为正常细胞对照。将接种好的96孔微量细胞培养板置于37℃5％CO2恒温培养箱培养96小时，记录细胞病变效应情况，按Reed-Muench法计算TCID50。
②红细胞凝集效价测定：将病毒液用PBS做2倍系列稀释(50ul病毒液+50ulPBS),加入等量1％猪红细胞，同时设红细胞对照。震荡混匀后，20～30℃孵育15～30分钟后检测结果，使50％红细胞凝集的最高稀释度最为终点。
驯化结果：
按以上方法制备出3批贴壁细胞制备的病毒的悬浮培养病毒待检毒液2)-1-3和3批低血清悬浮细胞培养水貂细小病毒待检病毒液5)-1-3；
病毒效价检测结果见表1；
表1各批次水貂细小病毒效价检测结果
批次 12h 24h 36h 48h 60h 72h
步骤2)-1批次 10<sup>4.50</sup> 10<sup>4.43</sup> 10<sup>4.37</sup> 10<sup>4.37</sup> 10<sup>4.25</sup> 10<sup>4.25</sup>
步骤2)-2批次 10<sup>4.50</sup> 10<sup>4.50</sup> 10<sup>4.25</sup> 10<sup>4.13</sup> 10<sup>4.25</sup> 10<sup>4.25</sup>
步骤2)-3批次 10<sup>4.50</sup> 10<sup>4.50</sup> 10<sup>4.31</sup> 10<sup>4.19</sup> 10<sup>4.25</sup> 10<sup>4.25</sup>
步骤5)-1批次 10<sup>4.50</sup> 10<sup>4.82</sup> 10<sup>5.25</sup> 10<sup>6.12</sup> 10<sup>5.75</sup> 10<sup>5.25</sup>
步骤5)-2批次 10<sup>4.82</sup> 10<sup>5.31</sup> 10<sup>5.88</sup> 10<sup>6.31</sup> 10<sup>6.12</sup> 10<sup>5.75</sup>
步骤5)-3批次 10<sup>5.25</sup> 10<sup>5.88</sup> 10<sup>6.31</sup> 10<sup>6.50</sup> 10<sup>6.25</sup> 10<sup>5.88</sup>
血凝价检测结果见表2；
表2各批次水貂细小病毒血凝价检测结果
批次 12h 24h 36h 48h 60h 72h
步骤2)-1批次 2<sup>5</sup> 2<sup>5</sup> 2<sup>4</sup> 2<sup>4</sup> 2<sup>4</sup> 2<sup>3</sup>
步骤2)-2批次 2<sup>6</sup> 2<sup>6</sup> 2<sup>5</sup> 2<sup>4</sup> 2<sup>5</sup> 2<sup>4</sup>
步骤2)-3批次 2<sup>6</sup> 2<sup>5</sup> 2<sup>4</sup> 2<sup>3</sup> 2<sup>4</sup> 2<sup>3</sup>
步骤5)-1批次 2<sup>7</sup> 2<sup>8</sup> 2<sup>9</sup> 2<sup>10</sup> 2<sup>7</sup> 2<sup>6</sup>
步骤5)-2批次 2<sup>8</sup> 2<sup>8</sup> 2<sup>9</sup> 2<sup>9</sup> 2<sup>7</sup> 2<sup>7</sup>
步骤5)-3批次 2<sup>8</sup> 2<sup>10</sup> 2<sup>10</sup> 2<sup>11</sup> 2<sup>9</sup> 2<sup>10</sup>
低血清悬浮细胞培养水貂细小病毒三个批次的血凝效价及病毒效价均在接毒48小时出现峰值，在增殖至第3代时收获病毒液的病毒效价及血凝效价均高于直接接种由贴壁F81-TY株细胞培养增殖的MEVB病毒株的病毒液。因此，MEVB病毒株在低血清悬浮细胞中增殖第3代第48小时收取的病毒液，已适应于F81-TY株低血清悬浮细胞的水貂细小病毒病毒株，即驯化的水貂细小病毒性肠炎病毒，将其命名为MEVB-X株，达到规程要求，可做为生产毒种。
毒种检验标准：
筛选得到的驯化的水貂细小病毒悬浮株应符合下列标准
病毒含量将毒种用细胞维持液作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7四个稀释度，每个稀释度接种4孔，每孔0.1mL，补充含F81-TY株细胞的营养液0.9mL，置37℃培养并观察3-4日，计算TCID50，每毫升病毒含量应不低于106.5TCID50。
红细胞凝集价毒种对猪红细胞凝集价应≥1:64。
毒力毒种口服3-10月龄健康水貂5只，每只15mL，应4只以上水貂发病。
免疫原性按照本规程制成抗原蛋白复合物(灭火前病毒含量≥106.0TCID50)后，肌肉接种2-10月龄健康水貂3只，每只1mL，21日后连同条件相同的对照组水貂3只，口服攻毒水貂细小病毒SMPV-11株(肠道毒)10mL，观察10日，免疫水貂应全部获得保护，对照水貂全部发病，出现典型症状。
特异性1:100稀释的毒种与1:10倍稀释的水貂细小病毒特异性血清等量混合，37℃中和1h后，接种F81-TY株细胞4孔，同时设病毒对照组，培养观察4日，试验组应不出现细胞病变CPE，对照组应全部出现CPE。
纯净度毒种应无细菌、霉菌(按现行《中国兽药典》附录进行)、支原体(按现行《中国兽药典》附录进行)及外源病毒污染。
基础种子代数6-14代。
检验用强毒为水貂细小病毒SMPV-11株(肠道毒)脏器病毒，由中国农业科学院特产研究所鉴定、保管和供应。
效检用强毒标准：
对水貂的半数感染量(ID50)将水貂细小病毒强毒SMPV-11株(肠道毒)，用生理盐水进行10倍系列稀释，取10-1、10-2、10-3三个稀释度，每个稀释度口服3-10月龄健康水貂4只，每只10mL，观察10日，计算ID50，SMPV-11株(肠道毒强毒对水貂的ID50应≤10-2.00。
外源病毒检验毒种应无外援病毒污染
毒种保存：
基础毒种保存悬浮细胞培养湿毒种-70℃保存期为3年；-70℃以下冻干毒种保存期为5年。
强毒毒种保存脏器毒种在-70℃以下，保存期为4年。
筛选得到的毒种按上述毒种标准鉴定。符合标准的毒种作为生产用种子。
4.接毒与收毒
取步骤2B)得到的可用作接毒的细胞培养液，按细胞培养液体积的10％比例接入步骤3筛选得到的驯化的水貂细小病毒性肠炎病毒MEVB-X，培养条件为反应器参数设定三路气体，分别为空气、氧气和二氧化碳，转速为75-85rpm，温度37℃、PH 7.1、溶氧70％，每12小时台盼蓝染色法细胞计数及活力检查，培养72h后，在无菌条件下收获病毒液，并用血凝抑制实验、TCID50检测病毒效价。
按以上方法重复制备五批病毒液并检测，批号分别为XF-1、XF-2、XF-3、XF-4、XF-5。细胞密度及细胞活力结果见表3。
表3细胞密度及细胞活力检测结果
细胞密度 细胞活力
摇瓶生长72h后 ≧3.0×10<sup>6</sup> ≧95％
反应器(5L) ≧2.5×10<sup>6</sup> ≧95％
反应器(10L) ≧2.5×10<sup>6</sup> ≧95％
表4病毒效价及血凝效价
样品批号 病毒效价 血凝效价
XF-1 10<sup>6.63</sup> 2<sup>10</sup>
XF-2 10<sup>6.50</sup> 2<sup>11</sup>
XF-3 10<sup>6.47</sup> 2<sup>9</sup>
XF-4 10<sup>6.53</sup> 2<sup>10</sup>
XF-5 10<sup>6.57</sup> 2<sup>10</sup>
制备的五批病毒液病毒效价及血凝效价均能稳定达到且超过制苗要求，可用于下一步抗原蛋白复合物的生产。
用于下一步抗原蛋白复合物生产的毒液按以下方法进行病毒含量检测：
将毒种用细胞维持液作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7四个稀释度，每个稀释度接种4孔，每孔0.1mL，补充含F81-TY株细胞的营养液0.9mL，置37℃培养并观察3-4日，计算TCID50，每毫升病毒含量应不低于106.0TCID50。
5.制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物
a)灭活步骤4得到的毒液，过滤除去细胞碎片，按原毒液总体积的0.2％加入甲醛，充分混匀，置于37℃下灭活24h，期间振摇2次，每次10min；得到灭活液。
半成品检验：
无菌检验：先将步骤4收获的病毒液以组为单位分别取样，按《中国兽药典》(2005年第三部)附录15页进行，应无菌生长。
灭活检验：取上述步骤a)所得的灭活液5倍稀释后加入终浓度为0.1％的亚硫酸氢钠，在37℃下作用24h后，分别接种正常猫肾传代细胞4瓶，每瓶0.4mL，置37℃下培养，24h后弃掉培养液，更换新培养液，继续培养3日后再传代1次，细胞应不出现病变，收获培养液血凝试验呈现阴性，判定灭活合格。
b)配制与分装：将灭活液和氢氧化铝胶按9:1(v/v)比例混合，并按终体积0.01％加入硫柳汞，充分混匀后，定量分装，密封，得到抗原蛋白复合物。
按以上本发明技术方案制备三批抗原蛋白复合物，批号分别为20171001、20171002和20171003。
成品检验：
物理性状：本品为淡粉红色均匀混悬液，静止后，上层为粉红色澄清液体，下层为淡粉红色沉淀，摇匀后，即成均匀混悬液。(结果见表5)
无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无细菌生长。(结果见表5)
表5物理性状、无菌检验结果
Figure GDA0003274441820000111
安全检验用2-10月龄健康水貂5只(水貂细小病毒HI抗体效价≤1:4)，每只肌肉接种抗原复合物5mL(5个免疫剂量)，分点注射，观察10日，精神、食欲、体温与粪便应无异常变化。(结果见表6)
表6抗原复合物安全检验结果
批号 检测结果 判定
20171001 水貂5/5检项无异常 合格
20171002 水貂5/5检项无异常 合格
20171003 水貂5/5检项无异常 合格
效力检验：
免疫攻毒用2-10月龄健康水貂3只，每只各肌肉接种抗原蛋白复合物1mL，21日后连同条件相同的对照组水貂3只，各口服100个ID50SMPV-11株(肠道毒)强毒，观察7日，对照组水貂应全部发病，免疫组水貂全部健活为合格。(结果见表7)
表7效力检测结果
Figure GDA0003274441820000112
水貂细小病毒性肠炎临床发病标准：
水貂细小病毒性肠炎临床发病标准的判定：⑴体温升高，达40℃以上持续1-2天；⑵精神沉郁，呕吐，食欲减退或废绝，喝欲增加；⑶激烈腹泻，排除混有血液、粘液的水样便或混有肠黏膜的稀便，有的出现“管型便”；⑷血液中白细胞明显减少。
对比例
采用三种不同方法进行水貂细小病毒的培养，分别进行HA效价和病毒含量TCID50的测定，结果如下表8。
1、高血清F81-TY株转瓶贴壁细胞毒：病毒在转瓶中的培养将1瓶MEM培养基培养至72h且长满致密单层的转瓶F81-TY株细胞，弃掉培养液，经PBS洗涤，胰酶消化后，用消化终止液收集细胞，按1：3比例接种于事先加入过滤除菌的含有8％-10％新生牛血清的1000mL细胞培养液中。混匀后上转机，置于37℃条件下温室培养，转速7-14转/min。细胞生长72h后，长满致密单层，弃去细胞培养液，按体积比1.5-3％接种细小病毒，并补加含2-5％新生牛血清的细胞维持液1000mL，温室37℃转机培养。接毒后培养68h-72h，细胞病变达到75％-85％时，细胞拉网呈岛屿状时收获病毒，冻融后进行HA效价和TCID50检测。按此方法制备三批，批号分别为TB201701、TB201702、TB201703。
2、微载体悬浮培养F81-TY株细胞毒：病毒在生物反应器Cytodex-1微载体悬浮培养F81-TY株细胞中的培养将转瓶培养72h后，细胞长满致密单层的细胞经PBS洗涤、胰酶消化后，收集细胞液。反应器洗刷，组装，电极校准及保压实验合格后，2L PBS液预处理5gCytodex-1微载体，高压灭菌。以初始细胞密度5.1×105cells/mL，接种生物反应器。设定反应器参数：温度36℃、CO2含量4.8％，pH7.0～7.2、DO 50％、搅拌速率50～70rpm，开启反应器自动控制。当细胞于微载体颗粒表面长满致密单层，细胞平均密度达2.49×106cells/mL时，以一定感染复数MOI为0.01接种MEVB株。定时取样检测HA效价和病毒含量TCID50。按此方法制备三批，批号分别为ZT201704、ZT201705、ZT201706。
3、低血清F81-TY株生物反应器悬浮细胞毒：方法同实施例1步骤1-4，制备三批，批号分别为XF201707、XF201708、XF201709。
表8不同方法进行水貂细小病毒(MEVB株)培养样品检测结果
Figure GDA0003274441820000121
Figure GDA0003274441820000131
三种细胞培养方式制备病毒抗原复合物的综合对比分析，结果如下表9
表9三种细胞培养方式制备病毒抗原复合物的综合对比分析结果
对比项目 转瓶培养 微载体悬浮培养 全悬浮培养
细胞生长方式 贴壁 贴壁+悬浮 全悬浮
生产工艺难易度 复杂 复杂 简单
细胞密度 1.0*10<sup>6</sup>个/mL 5.0*10<sup>6</sup>个/mL 3.0*10<sup>6</sup>个/mL
血清浓度 8％～10％ 8％～10％ 1～5％
半成品病毒滴度 10<sup>6.5</sup>TCID<sub>50</sub> 10<sup>7.0</sup>TCID<sub>50</sub>(含载体) 10<sup>6.5</sup>TCID<sub>50</sub>
纯化工艺难易度 中等 复杂(去载体) 简单
副反应程度 低 低 极低
批间差异 高 中等 低
生产效率 低 低 高
人工需求 20人以上 8-10人 8-10人
综合成本 中 高 低
采用F81-TY株细胞转瓶贴壁培养制备病毒抗原。细胞培养阶段往往需要加入较高浓度新生牛血清(8-10％)，待细胞长满单层后需要弃去培养液，经PBS洗涤，胰酶消化后换用新生牛血清浓度为2-5％的细胞维持液，不仅工艺繁琐，且由于操作熟料程度不同导致细胞传代生长情况好坏不一，接毒后病毒增殖快慢不同，最后影响产品质量的均一稳定性。另外，高浓度血清的使用不仅增加了生产成本，且血清中杂蛋白在后期分离纯化工作中很难去除，接种后副反应大。另外，血清中可能存在外源病毒和支原体，增加了产品的生物安全风险。由于转瓶细胞生长面积有限，不利于细胞放大培养，且需要足够的温室与转机，占地多，人工多。
采用生物反应器微载体悬浮培养F81-TY株细胞制备病毒抗原。第一，血清浓度高，具体同2.1实验方法所述，存在成本高、副反应大及生物安全风险等不利因素。第二，微载体的市场价格比较昂贵，且国产微载体质量参差不齐，只能依靠国外进口，使得生产成本进一步提高。第三，微载体生物反应器消化放大难以很好的控制，细胞经胰酶作用后，生长远不如第一次培养，不利于规模化放大生产，多数企业采取转瓶细胞直接接种大体积反应器，大量的转瓶消化操作，无疑增加了污染的风险。第四，虽然微载体半成品效价较高，但由于微载体在后期纯化中较难除净，效价也会有很大损失，一般在0.5个滴度左右，使得微载体生物反应器培养受到很大的限制。
采用生物反应器低血清悬浮培养F81-TY株细胞制备病毒抗原。第一，自动化程度高，需要人员少，且可以采用具有工业化价值的低血清(1-5％)培养基，抗原成本比较优势显著。第二，低血清悬浮培养可大大减少血清中杂蛋白等热源物质，降低了产品后期纯化的难度及副反应的发生几率，使产品更具有安全性。第三，悬浮培养F81-TY株细胞，细胞增殖良好，易于放大培养，收毒时间较其他培养方式提前，缩短了生产周期，同时降低劳动强度。第四，降低培养基使用量，收获的病毒液的量就是消耗培养基的量，而其他工艺消耗培养基的量是收获病毒液的2倍。第五，不论HA效价还是TCID50均不低于其他两种培养工艺，达到生产规程要求。第六，该方法制备的病毒抗原复合物安全有效，对水貂病毒性肠炎起到了保护作用，具有较好的市场应用和推广前景。

Claims (2)

1.一种水貂细小病毒性肠炎病毒悬浮毒株，其特征在于，所述水貂细小病毒性肠炎病毒悬浮毒株命名为MEVB-X，并于2017年11月28日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC NO.14884。
2.一种权利要求1所述的水貂细小病毒性肠炎病毒悬浮毒株在制备诱导对水貂细小病毒性肠炎病毒的免疫应答的药物中的应用。
CN201711385744.XA 2017-12-20 2017-12-20 一种制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的方法、抗原蛋白复合物及其应用 Active CN109280648B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711385744.XA CN109280648B (zh) 2017-12-20 2017-12-20 一种制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的方法、抗原蛋白复合物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711385744.XA CN109280648B (zh) 2017-12-20 2017-12-20 一种制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的方法、抗原蛋白复合物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109280648A CN109280648A (zh) 2019-01-29
CN109280648B true CN109280648B (zh) 2021-11-30

Family

ID=65185599

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711385744.XA Active CN109280648B (zh) 2017-12-20 2017-12-20 一种制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的方法、抗原蛋白复合物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109280648B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114317405B (zh) * 2021-12-21 2023-08-29 广东省华晟生物技术有限公司 无血清全悬浮培养型f81细胞系及其构建方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102000327A (zh) * 2010-12-01 2011-04-06 齐鲁动物保健品有限公司 一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法
CN104388394A (zh) * 2014-10-22 2015-03-04 中国农业科学院特产研究所 水貂细小病毒弱毒疫苗株及其在制备水貂细小病毒弱毒疫苗中的用途
CN105031639A (zh) * 2015-07-09 2015-11-11 吉林特研生物技术有限责任公司 一种水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎二联疫苗及其制备方法与应用
CN105816872A (zh) * 2016-04-26 2016-08-03 中国农业科学院特产研究所 水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗制备方法及用其制备的疫苗

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3562387A (en) * 1967-12-01 1971-02-09 Mogul Corp Mink virus enteritis vaccine and method for the production thereof
CN104258386B (zh) * 2014-09-12 2016-09-07 齐鲁动物保健品有限公司 一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合
CN104587460B (zh) * 2014-12-25 2016-09-21 华威特（江苏）生物制药有限公司 水貂病毒性肠炎、犬瘟热二联活疫苗及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102000327A (zh) * 2010-12-01 2011-04-06 齐鲁动物保健品有限公司 一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法
CN104388394A (zh) * 2014-10-22 2015-03-04 中国农业科学院特产研究所 水貂细小病毒弱毒疫苗株及其在制备水貂细小病毒弱毒疫苗中的用途
CN105031639A (zh) * 2015-07-09 2015-11-11 吉林特研生物技术有限责任公司 一种水貂犬瘟热和细小病毒性肠炎二联疫苗及其制备方法与应用
CN105816872A (zh) * 2016-04-26 2016-08-03 中国农业科学院特产研究所 水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗制备方法及用其制备的疫苗

Also Published As

Publication number Publication date
CN109280648A (zh) 2019-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107460156B (zh) 无血清全悬浮mdck细胞株及其在生产流感病毒中的应用
CN111041002B (zh) 猪流行性腹泻病毒变异株2a、2b二价灭活疫苗及其制备方法
CN108220227A (zh) 一种通过全悬浮传代细胞系悬浮培养新城疫病毒的方法
CN109913404A (zh) 鸡传染性法氏囊病毒活疫苗的制备方法
CN104258386B (zh) 一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合
CN109679927B (zh) 猪塞内加谷病毒、猪塞内加谷病毒灭活疫苗的制备方法、猪塞内加谷病毒灭活疫苗和应用
CN107823639B (zh) 牛病毒性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法
CN112126628B (zh) 山羊痘病毒的增殖方法、山羊痘活疫苗及其制备方法和应用
CN109280648B (zh) 一种制备水貂细小病毒性肠炎抗原蛋白复合物的方法、抗原蛋白复合物及其应用
CN109010814B (zh) 副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体二联灭活疫苗的生产方法
CN116218763A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒株的全悬浮细胞培养方法
CN106237324B (zh) 一种使用全悬浮技术生产猪传染性胃肠炎疫苗的方法
CN113755368B (zh) 一株福建鸡滑液囊支原体及其培养基
CN105749266B (zh) 一种水貂出血性肺炎、肉毒梭菌中毒症二联灭活疫苗及其制备方法
CN111073863B (zh) 猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法
CN106867973A (zh) 一种使用全悬浮技术生产猪伪狂犬病疫苗的方法
CN109280649B (zh) 一种制备水貂犬瘟热抗原蛋白复合物的方法、抗原蛋白复合物及其应用
CN114107171A (zh) 鹅视网膜上皮细胞系及其构建方法与应用
CN109750004A (zh) 一株貉细小病毒性肠炎病毒ln株、貉细小病毒性肠炎灭活疫苗及其制备方法
CN113117068A (zh) 一种兽用牛流行热灭活疫苗及其规模化生产方法
CN106318899B (zh) 一株牛睾丸传代细胞株的建立及其应用
CN106085947B (zh) Mdck克隆细胞株及其应用
CN117414419B (zh) 猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒三联灭活疫苗制备方法及其应用
CN109908337A (zh) 鸡痘活疫苗的制备方法及其产品
CN109602900A (zh) 鸡马立克氏病毒活疫苗的制备方法及其产品

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: Method for preparing mink parvovirus enteritis antigen protein complex, antigen protein complex and application thereof

Effective date of registration: 20220901

Granted publication date: 20211130

Pledgee: Industrial Bank Co.,Ltd. Changchun Branch

Pledgor: JL TEYAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY LLC

Registration number: Y2022220000064

PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right
PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right

Date of cancellation: 20230905

Granted publication date: 20211130

Pledgee: Industrial Bank Co.,Ltd. Changchun Branch

Pledgor: JL TEYAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY LLC

Registration number: Y2022220000064

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: A method for preparing mink parvovirus enteritis antigen protein complex, antigen protein complex and its application

Effective date of registration: 20230907

Granted publication date: 20211130

Pledgee: Industrial Bank Co.,Ltd. Changchun Branch

Pledgor: JL TEYAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY LLC

Registration number: Y2023220000087