CN104388394A - 水貂细小病毒弱毒疫苗株及其在制备水貂细小病毒弱毒疫苗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水貂细小病毒弱毒疫苗株及其在制备水貂细小病毒弱毒疫苗中的用途。所述水貂细小病毒弱毒疫苗株，命名为MEVB-F61，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.9560。试验表明该疫苗株作为疫苗使用时，安全、有效，可有效预防水貂细小病毒性肠炎的发生，且经过连续5代动物接种实验，证明该疫苗株无毒力返强。因此，本发明在防治水貂细小病毒性肠炎领域将具有广阔的应用前景。

Description

水貂细小病毒弱毒疫苗株及其在制备水貂细小病毒弱毒疫苗中的用途

技术领域

本发明涉及水貂细小病毒弱毒疫苗株及其应用，本发明属于兽医生物制品技术领域

背景技术

水貂细小病毒性肠炎是由细小病毒科细小病毒属水貂细小病毒引起的急性、高度接触性传染病，同水貂犬瘟热、水貂阿留申病一起被称为水貂养殖业三大疫病。该病最早于1949年由Schofield报道发现于加拿大，1952年由Wills分离并鉴定，命名为水貂肠炎病毒，目前水貂细小病毒性肠炎广泛存在于世界各个养貂国家。不同年龄和品种的水貂均有易感性，但尤以50～60日龄的仔貂和幼貂最为易感，幼貂的发病率为70％以上，死亡率高达90％；成年貂的发病率为30％左右，死亡率在30％以下。患病水貂和耐过貂是该病的主要传染源，病毒通过粪、尿、唾液等排出体外，经消化道和呼吸道传染给易感的健康貂。该病全年都可发生，常呈地方性流行。一旦传入貂场，如兽医防疫卫生措施不完善，常常导致长期存在和周期性发生流行，给养殖户带来巨大的经济损失。

我国毛皮动物养殖业从上世纪50年代起步，90年代获得蓬勃发展，现已成为畜牧业养殖的重要组成部分。目前，我国毛皮动物存栏数可达1亿只，其中水貂占一半以上，主要集中在山东、河北、吉林、辽宁、黑龙江等省份地区。对推动当地经济发展，增加农民就业和收入起到了重要的作用。水貂细小病毒性肠炎是危害水貂养殖业的最重要传染病之一，由于缺乏特效的治疗方法，目前仍以疫苗接种为主要防控手段。因此，研制出安全、有效的水貂细小病毒性肠炎的疫苗是控制水貂细小病毒性肠炎的有效方法。

目前国内市场上现有的水貂细小病毒性肠炎疫苗多为未冻干的灭活疫苗，灭活疫苗在生产过程中往往存在灭活不彻底或灭活剂(多数为甲醛)使用量超标的现象，给疫苗的下一步使用带来了极大的隐患。同时甲醛具有较大毒性，因此使用甲醛作为灭活剂对水貂具有一定毒性，往往在接种部位造成局部炎症反应，甚至是化脓、溃疡，影响水貂皮张质量，造成经济损失。同时，灭活疫苗只能调动起机体的体液免疫，无法刺激机体细胞免疫应答的产生。

因此，开发安全、有效、能够同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫反应的活疫苗是行业和市场的迫切需求，具有广阔的市场前景。

发明内容

为解决上述问题，本发明利用连续传代的方法，将细小病毒疫苗株MEVB在猫肾细胞CRFK上连续传代，并且每10～20代进行一次噬斑克隆纯化。经过61次传代，最终获得了一株对水貂安全、免疫原性良好的细小病毒致弱株MEVB-F61，用于作为制备水貂细小病毒性肠炎活疫苗的候选毒株。

所述的水貂细小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61，命名为MEVB-F61，分类命名为水貂细小病毒(Mink Enteritis Virus)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC NO.9560，保藏时间为：2014年8月13日。

同原始毒株MEVB(GenBank登陆号FJ592174)相比，弱毒株MEVB-F61的主要蛋白氨基酸及其基因序列发生了一定的突变，表现在于结构蛋白VP2第145位氨基酸由I突变为L；第300位氨基酸(主要抗原决定簇位点之一)由V突变为A；第411位氨基酸由A突变为E；第562位氨基酸由V突变为L。

将第61代病毒MEVB-F61连续5代灌胃接种抗体阴性水貂，每代连续观察14天。结果显示每代接种水貂体温、食欲、精神状态等生理指标均表现正常，未表现出任何临床症状，剖检观察接种水貂肠道无病变，说明疫苗株MEVB-F61无毒力返强现象，可用于疫苗研究。

因此，进一步的，本发明还提出了所述的水貂细小病毒弱毒疫苗株在制备预防水貂细小病毒性肠炎药物中的应用。

其中，优选的，所述的药物为水貂细小病毒性肠炎活疫苗。

一种水貂细小病毒性肠炎活疫苗，其特征在于其有效成分包括本发明所述的水貂细小病毒弱毒疫苗株。优选的，疫苗成品中细小病毒滴度(TCID₅₀)≥10^5.5/头份。

所述的水貂细小病毒性肠炎活疫苗，是通过以下步骤制备得到：

将本发明所述的水貂细小病毒弱毒疫苗株按培养体积的0.1％～2％同步接种于CRFK细胞上，置35℃转瓶机内进行培养，待细胞病变达到80％时通过反复冻融的方法收获病毒液，进行病毒含量、纯净性检测，将检验合格的制苗用病毒液加入适量冻干保护剂，分装、冻干，保存于-15～-20℃，即为水貂细小病毒性肠炎活疫苗。

其中，优选的，经检验合格的制苗用病毒液病毒滴度(TCID₅₀)≥10^6.5/ml。

相较于现有技术，本发明的有益效果体现在：

作为单苗使用时，安全、有效，接种疫苗后可保护水貂免于细小病毒检验用强毒的攻击，一次免疫接种3周和3个月后，水貂对细小病毒的保护率均为100％；一次免疫接种6个月和9个月后，水貂对细小病毒的保护率分别为95％和85％。因此，该疫苗株可有效预防水貂细小病毒性肠炎的发生。且经过连续5代动物接种实验，证明该疫苗株无毒力返强。因此，将该疫苗的免疫期定为6个月，在-8～-10℃的保存期定为12个月，-15～-20℃的保存期定为15个月。

具体实施例

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1水貂细小病毒MEVB的传代致弱

1、水貂细小病毒MEVB的传代致弱

(1)将水貂细小病毒疫苗株MEVB以同步接毒的方法接种在猫肾细胞CRFK上进行病毒扩增培养，每日观察细胞病变情况，待细胞病变达到80％左右时即可通过反复冻融的方法收获病毒，标记为MEVB-F1(第1代)。

(2)将第1代病毒MEVB-F1按照上面所述的方法接种、收获病毒，标记为MEVB-F2(第2代)。使用同样的方法，将病毒传代到61代，标记为MEVB-F61。

(3)当水貂细小病毒MEVB连续传代到第10代(MEVB-F10)时，对病毒进行克隆噬斑纯化。其方法为：将待纯化的病毒作10倍比稀释至10^-7，取10^-3～10^-75个稀释度病毒悬液0.1ml，与CRFK细胞同步接种于6孔培养板，并设未接毒细胞对照孔。置培养箱(35℃、5％CO₂)中培养，待细胞完全贴壁后，去掉培养液，用无血清MEM清洗2次，加入预热至37℃的低熔点营养琼脂3mL/孔，室温冷却凝固，置培养箱培养3～5d，每天观察噬斑。选择最高稀释度病毒接种孔，挑取相对独立的单个噬斑，标记为F+1代(即F11代)。挑出的带有病毒的低熔点琼脂噬斑用细胞培养液重悬，与CRFK细胞同步接种于6孔培养板，继续传代，标记为F+2代(即F12代)。从F+3代(即F13代)开始仍用细胞培养瓶进行传代，此后病毒每传10～20代进行一次噬斑克隆纯化。

2、水貂细小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61的遗传变异分析

同原始毒株MEVB(GenBank登陆号FJ592174)相比，弱毒株MEVB-F61的主要蛋白氨基酸及其基因序列发生了一定的突变，表现在于结构蛋白VP2第145位氨基酸由I突变为L；第300位氨基酸(主要抗原决定簇位点之一)由V突变为A；第411位氨基酸由A突变为E；第562位氨基酸由V突变为L。

3.水貂细小病毒致弱株MEVB-F61毒力返强试验

(1)第1代毒力返强试验使用第61代病毒MEVB-F61灌胃接种抗体阴性水貂(10ml/只，10⁷TCID₅₀/ml),同时设不接种阴性对照。

(2)将前1代接种动物第4～8天排泄物混合到一起，经PBS重悬、氯仿抽提后，取上清作为下一代毒力返强试验的接种物，灌胃接种量为10ml/只，连续接种5代。

(3)每次接种病毒后连续14天观察水貂的体温、食欲、精神状态等生理指标，并剖检观察接种水貂肠道病变情况。

(4)结果表明，连续5代动物回归试验中接种水貂体温、食欲、精神状态等生理指标均表现正常，未表现出任何临床症状，剖检观察接种水貂肠道无病变，说明疫苗株MEVB-F61未发生毒力返强，可用于疫苗研究。

所述的水貂细小病毒弱毒疫苗株MEVB-F61保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC NO.9560，保藏时间为：2014年8月13日。

实施例2水貂细小病毒性肠炎活疫苗的制备

(1)将疫苗株MEVB-F61按培养体积的0.1％～2％同步接种于CRFK细胞上，置35℃转瓶机内进行培养，待细胞病变达到80％左右时即可通过反复冻融的方法收获病毒液。按照上述方法制备5批疫苗，进行病毒含量、纯净性检测。结果表明，5批疫苗的病毒滴度(TCID₅₀)≥10^6.5/ml，说明疫苗株MEVB-F61生产性能良好，适合工业大规模生产。

(2)制备冻干保护剂

将明胶、水解乳蛋白和蔗糖溶解于水中，按照质量百分比计，使明胶的终浓度为2～7％，水解乳蛋白的终浓度为10-25％，蔗糖终浓度为15～30％，于116℃、30min高压灭菌后得到。

(3)将收获的病毒液与冻干保护剂按照体积比为3:1混合，定量分装于无菌的安瓶内，加盖置于冻干机内预冻、干燥。

(4)疫苗成品进行病毒滴度、纯粹性检验，水貂细小病毒滴度≥105.5/头份。

实施例3水貂细小病毒性肠炎活疫苗安全性试验

取检验合格的水貂细小病毒性肠炎活疫苗3批(实施例2方法制备)，后肢肌肉接种抗体阴性水貂，分别进行单剂量(10^5.5/头份)、单剂量重复和超剂量(10倍)接种，同时设不接种疫苗水貂作为对照。疫苗接种后，连续14天观察水貂的体温、食欲、精神状态等生理指标，并剖检观察接种水貂肠道病变情况。试验结果表明，疫苗单剂量、单剂量重复和超剂量接种后，水貂各项生理指标均正常，未表现出任何临床症状，剖检观察接种水貂肠道无病变。说明水貂细小病毒性肠炎活疫苗对水貂安全。

实施例4水貂细小病毒性肠炎活疫苗效力及免疫期试验

(1)取检验合格的水貂细小病毒性肠炎活疫苗3批(实施例2方法制备)，后肢肌肉接种(10^5.5/头份)抗体阴性水貂，同时设接种CRFK细胞培养液对照组，免疫后每月采血、分离血清，用于血凝抑制试验。

(2)试验动物接种3周、3个月、6个月和9个月后，使用细小病毒检验用强毒对水貂进行攻击，剂量为10ml，含100个半数致死量(LD₅₀)，灌胃接种。每天观察攻毒水貂体温、食欲、精神状态等生理指标。

(3)结果表明，接种后3周、3个月水貂对细小病毒的保护率为100％，接种水貂各项生理指标均正常，无任何临床症状出现；接种后6个月水貂对细小病毒的保护率为95％；接种后9个月水貂对细小病毒的保护率为85％。因此，将该疫苗的免疫期定为6个月。对照组水貂均表现出体温升高，剧烈腹泻，排出混有肠粘膜的水样稀便或管型便，且经检验血液中白细胞明显减少。

以上结果表明本发明的疫苗株及其疫苗对于强毒的攻击可产生较好的保护作用，可有效预防水貂细小病毒性肠炎的发生，是水貂细小病毒性肠炎活疫苗的良好候选毒株。

实施例5水貂细小病毒性肠炎活疫苗的保存期测定

取检验合格的水貂细小病毒性肠炎活疫苗3批(实施例2方法制备)保存于-8～-10℃和-15～-20℃，分别于保存的第3、6、9、12、15、18和24个月取样，进行性状、真空度、剩余水分、病毒滴度检测。结果表明，3批疫苗在-8～-10℃保存12个月性状为白色疏松团块，加入稀释液后迅速溶解，真空度和剩余水分均在要求范围内，细小病毒的病毒滴度(TCID₅₀)分别为：10^5.76/ml、10^5.65/ml和10^5.67/ml；而保存于-15～-20℃15个月后性状仍为白色疏松团块，加入稀释液后迅速溶解，真空度和剩余水分均在要求范围内，细小病毒的病毒滴度(TCID₅₀)分别为：10^5.76/ml、10^5.71/ml、和10^5.58/ml。高于疫苗的免疫要求(细小病毒滴度≥10^5.5/头份)，因此将该疫苗在-8～-10℃的保存期定为12个月，-15～-20℃的保存期定为15个月。

Claims (7)

1.水貂细小病毒弱毒疫苗株，命名为MEVB-F61，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.9560。

2.权利要求1所述的水貂细小病毒弱毒疫苗株在制备预防水貂细小病毒性肠炎药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的药物为水貂细小病毒性肠炎活疫苗。

4.一种水貂细小病毒性肠炎活疫苗，其特征在于其有效成分包括权利要求1所述的水貂细小病毒弱毒疫苗株。

5.如权利要求4所述的水貂细小病毒性肠炎活疫苗，其特征在于疫苗成品中细小病毒滴度TCID₅₀≥10^5.5/头份。

6.一种制备权利要求4所述的水貂细小病毒性肠炎活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

将权利要求1所述的水貂细小病毒弱毒疫苗株按培养体积的0.1％～2％同步接种于CRFK细胞上，置35℃转瓶机内进行培养，待细胞病变达到80％时通过反复冻融的方法收获病毒液，进行病毒含量、纯净性检测，将检验合格的制苗用病毒液加入冻干保护剂，分装、冻干，保存于-15～-20℃，即为水貂细小病毒性肠炎活疫苗。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于经检验合格的制苗用病毒液病毒滴度TCID₅₀≥10^6.5/ml。