CN112251416B

CN112251416B - 一种犬瘟热病毒疫苗株、疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN112251416B
Application number: CN202011126637.7A
Authority: CN
Inventors: 舒秀伟; 刘国英; 李凤艳; 王博; 陈生雷; 刘艳霞
Original assignee: Liaoning Yikang Biological Corp ltd
Current assignee: Liaoning Yikang Biological Corp ltd
Priority date: 2020-10-20
Filing date: 2020-10-20
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2040-10-20
Also published as: CN112251416A

Abstract

本发明公开了一种用于治疗、预防、减缓或控制犬瘟热的犬瘟热病毒疫苗株，其微生物保藏号是CGMCC No.19397。该疫苗株毒力低，免疫原性良好。本发明还公开了以前述犬瘟热疫苗株为免疫原的活疫苗组合物。该疫苗组合物安全有效。

Description

一种犬瘟热病毒疫苗株、疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于预防兽医领域，涉及兽用活疫苗，尤其涉及一种犬瘟热病毒疫苗株、疫苗及其制备方法。

背景技术

随着环境和人类生活饮食方式的改变，野生动物和伴侣动物与人类之间接触日益密切，因此増加了人类感染动物源性疾病的潜在风险。犬是人类重要的伴侣动物之一，与人类朝夕相伴，因此，加强对犬主要疾病的防控是当务之急。犬瘟热(CD)是由副粘病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(CDV)引起的犬科、鼬科、猫科等多种动物感染的一种急性、高度接触性传染病。本病主要侵害动物的呼吸系统、消化系统以及神经系统，具有较高的发病率和致死率，其自然感染宿主已不断扩大到多种陆生和水生动物，还存在潜在的人兽共患性，有可能成为继狂犬病之后犬传播给人的第二种疫病，引起了动物学界和医学界的广泛关注。CD不仅给饲养场带来了毁灭性的灾难，也给从事饲养、繁殖和疫病防治以及国际贸易工作者带来了前所未有的威胁。CD 呈世界性流行，目前无治疗本病的特效药物，因此，对犬瘟热疫苗的研制成为预防本病最重要的措施。

水貂犬瘟热是由副黏病毒科副黏病毒亚科麻疹病毒属的犬瘟热病毒 (CDV)引起的一种高度接触性急性病毒病。它的临床特征为双相热、呕吐、腹泻、黏膜卡他、中后期出现神经症状，少数病例的鼻和足垫可发生角质化，而且容易继发其他细菌、病毒的混合感染和二次感染，死亡率高达80％。CD 存在潜在的人兽共患性，有可能成为继狂犬病之后犬传播给人的第二种疫病，引起了动物学界和医学界的广泛关注。不仅给饲养场带来了毁灭性的灾难，也给从事饲养、繁殖和疫病防治以及国际贸易工作者带来了前所未有的威胁。

水貂犬瘟热是目前危害水貂养殖业发展最严重的急性病毒性传染病，由于该病经常引起混合感染和继发感染，有“毁灭性传染病”之称，给养貂行业造成了巨大的经济损失，严重影响着我国毛皮动物养殖业的发展。目前无治疗本病的特效药物，因此，对犬瘟热疫苗的研制成为预防本病最重要的措施。

发明内容

本发明制备的犬瘟热活疫苗，采用国内流行毒株的Vero细胞传代致弱株，毒力和免疫原性良好，病毒含量高，免疫持续时间长，疫苗安全有效。

为了解决现有技术中存在的问题，本发明第一方面提供了一种用于治疗、预防、减缓和/或控制犬瘟热的疫苗株，所述疫苗株是犬瘟热病毒疫苗株，所述犬瘟热病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.19397的病毒株，或其临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株。

本发明第二方面提供了一种用于治疗、预防、减缓和/或控制犬瘟热的疫苗组合物，所述疫苗组合物以本发明第一方面所述的疫苗株为免疫原。

在一些实施方式中，所述疫苗组合物的原料包括所述免疫原和辅料。

在一些实施方式中，所述疫苗组合物为活疫苗组合物。

在一些实施方式中，所述疫苗组合物中，所述疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为1.0×10^4.0TCID₅₀：50-150mg(比如，1.0×10^4.0TCID₅₀：60mg、 70mg、80mg、90mg、100mg、110mg、120mg、130mg、140mg)。

在一些实施方式中，所述疫苗组合物中，所述疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为1.0×10^4.0TCID₅₀：105mg。

在一些实施方式中，所述疫苗株的TCID₅₀是基于Vero细胞培养根据 Reed-Muench法计算得到的。

在一些实施方式中，所述疫苗株的培养方法包括如下步骤：

(i)将所述疫苗株接种到Vero细胞中培养，收获所述疫苗株的粗毒液；

(ii)将所述疫苗株的粗毒液纯化，得到纯化的疫苗株毒液。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，当CPE达到80％(比如，85％、 88％、92％、95％、98％)以上时，收获所述疫苗株的粗毒液。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，当CPE达到90％以上时，收获所述疫苗株的粗毒液。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，按照所述病毒量株与培养液 10^4.0TCID₅₀：15-30ml(比如，10^4.0TCID₅₀：18ml、20ml、25ml、28ml)的用量比接种。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，按照MOI＝0.005～0.01(比如，0.006、 0.007、0.008、0.009)的用量接种。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，所述培养液为含1.5-2.5v/v％(比如，1.8v/v％、2.0v/v％、2.2v/v％、2.4v/v％)新生牛血清的DMEM。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，所述培养的温度为32-34℃(比如， 32.5℃、33℃、33.5℃)。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，所述培养的pH值为7.0-7.5(比如， 7.1、7.2、7.3、7.4)。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，所述培养的DO值为40-50％(比如，42％、44％、46％、48％)。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，当所述培养为转瓶培养时，所述培养是在9-12转/小时(比如，10转/小时、11转/小时)条件下进行的。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，当所述培养为悬浮培养时，所述培养是在25-35转/分钟(比如，26转/分钟、28转/分钟、30转/分钟、32转/ 分钟、34转/分钟)条件下进行的。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，所述Vero细胞来自单层Vero细胞。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，用胰酶消化所述单层Vero细胞后接种所述疫苗株。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，对所述疫苗株的粗毒液进行无菌检验。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，所述Vero细胞的制备步骤为：将培养的Vero种子细胞扩大培养，得到扩大培养的Vero细胞。

在一些实施方式中，所述扩大培养是在36.5-37.5℃(比如，36.7℃、36.9℃、 37.1℃、37.3℃)下进行的。

在一些实施方式中，所述扩大培养是在9-12转/小时(比如，10转/小时、 11转/小时)条件下在转瓶中进行的。

在一些实施方式中，所述扩大培的养培养液为含有6-10v/v％(比如， 7v/v％、8v/v％、9v/v％)新生牛血清的DMEM。

在一些实施方式中，所述扩大培的时间为18-30h(比如，20h、22h、24h、26h、28h)。

在一些实施方式中，当所述培养为悬浮培养时，将所述扩大培养的Vero 细胞用胰酶消化之后转移到生物反应器中继续培养。

在一些实施方式中，在所述生物反应器中，所述继续培养的温度为 36-38℃(比如，36.5℃、37℃、37.5℃)。

在一些实施方式中，在所述生物反应器中，所述继续培养的pH值为 7.0-7.5(比如，7.1、7.2、7.3、7.4)。

在一些实施方式中，在所述生物反应器中，所述继续培养的DO值为 40-50％(比如，42％、44％、46％、48％)。

在一些实施方式中，在所述生物反应器中，所述继续培养是在25-35转/ 分钟(比如，26转/分钟、28转/分钟、30转/分钟、32转/分钟、34转/分钟) 条件下进行的。

在一些实施方式中，在步骤(ii)中，将所述疫苗株的粗毒液冻融1-3 次后纯化。

在一些实施方式中，在步骤(ii)中，所述纯化的方法为：用直径为 0.22-0.45μm滤膜过滤，除去细胞及细胞碎片，得到所述纯化的疫苗株毒液。

在一些实施方式中，所述纯化的疫苗株毒液中病毒含量≥10^5.0TCID₅₀/ml。

在一些实施方式中，所述辅料为冻干保护剂。

在一些实施方式中，所述冻干保护剂为包括2-3mg/mL(比如，2.2mg/mL、 2.4mg/mL、2.6mg/mL、2.8mg/mL)聚乙烯吡咯烷酮、8-12mg/mL(比如， 8.5mg/mL、9.0mg/mL、9.5mg/mL、10.0mg/mL、10.5mg/mL、11.0mg/mL、 11.5mg/mL)山梨醇、3-7mg/mL(比如，4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL) 甘氨酸、30-50mg/mL(比如，35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL)蔗糖、30-60mg/mL (比如，35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL)海藻糖的水溶液。

在一些实施方式中，所述冻干保护剂的制备方法包括如下步骤：

制备包括4-6mg/mL(比如，4.5mg/mL、5.0mg/mL、5.5mg/mL)聚乙烯吡咯烷酮、16-24mg/mL(比如，18.0mg/mL、20.0mg/mL、22.0mg/mL)山梨醇的第一水溶液；

制备包括6-14mg/mL(比如，8.0mg/mL、10.0mg/mL、12.0mg/mL)甘氨酸、60-100mg/mL(比如，65.0mg/mL、70.0mg/mL、75.0mg/mL、80.0mg/mL、 85.0mg/mL、90.0mg/mL、95.0mg/mL)蔗糖、60-120mg/mL(比如，65.0mg/mL、 70.0mg/mL、75.0mg/mL、80.0mg/mL、85.0mg/mL、90.0mg/mL、95.0mg/mL、 100.0mg/mL、105.0mg/mL、110.0mg/mL、115.0mg/mL)海藻糖的第二水溶液；

将所述第一水溶液与所述第二水溶液以1:0.8-1.2(比如，1:0.9、1.0、1.1) 的体积比混合，得到所述冻干保护剂。

在一些实施方式中，将所述第一水溶液灭菌后使用。

在一些实施方式中，将所述第一水溶液经110-120℃(比如，112℃、114℃、 116℃、118℃)灭菌后使用。

在一些实施方式中，将所述第二水溶液灭菌后使用。

在一些实施方式中，将所述第二水溶液过滤除菌后使用。

本发明第三方面提供了本发明第二方面所述疫苗组合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

将所述疫苗株制备成所述疫苗组合物。

在一些实施方式中，将所述疫苗株与所述辅料混合，得到所述疫苗组合物。

在一些实施方式中，将所述疫苗组合物干燥，得到干燥的疫苗组合物。

在一些实施方式中，所述干燥为真空冷冻干燥。

在一些实施方式中，所述冷冻真空干燥包括如下步骤：

(a)将所述疫苗组合物进行冷冻，得到冷冻的疫苗组合物；

(b)在真空条件下对所述冷冻的疫苗组合物进行温度分阶段升高的升华干燥，得到初步干燥的疫苗组合物；

(c)在真空条件下将初步干燥的疫苗组合物在常温条件下升华干燥，得到干燥的疫苗组合物。

在一些实施方式中，在步骤(a)中，将所述疫苗组合物在-50℃到-40℃ (比如，-48℃、-46℃、-44℃、-42℃)下进行冷冻。

在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述冷冻的持续时间为1.5-2.5h(比如，1.6h、1.8h、2.0h、2.2h、2.4h)。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，所述真空条件为8pa～10pa(比如，8.5pa、9.0pa、9.5pa)。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，对所述冷冻的疫苗组合物进行-30℃到-26℃(比如，-29℃、-28℃、-27℃)下的第一升华，-17℃到-13℃(比如， -16℃、-15℃、-14℃)下的第二升华和6-10℃(比如，7℃、8℃、9℃)下的第三升华。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，所述第一升华的时间为4-8h(比如，5h、6h、7h)。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，温度由-50℃到-40℃升高到-30℃到 -26℃所需时间为0.5-1.5h(比如，0.6h、0.8h、1.0h、1.2h、1.4h)。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，所述第二升华的时间为4-8h(比如，5h、6h、7h)。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，温度由-30℃到-26℃升高到-17℃到 -13℃所需时间为0.5-1.5h(比如，0.6h、0.8h、1.0h、1.2h、1.4h)。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，所述第三升华的时间为2-6h(比如，3.0h、3.5h、4.0h、4.5h、5.0h、5.5h)。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，温度由-17℃到-13℃升高到6-10℃所需时间为0.5-1.5h(比如，0.6h、0.8h、1.0h、1.2h、1.4h)。

在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述真空条件为8pa～10pa(比如， 8.5pa、9.0pa、9.5pa)。

在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述升华的温度为25-30℃(比如， 26℃、27℃、28℃、29℃)。

在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述升华的时间为1-3h(比如， 1.5h、2.0h、2.5h)。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，温度由6-10℃升高到25-30℃所需时间为0.5-1.5h(比如，0.6h、0.8h、1.0h、1.2h、1.4h)。

本发明第四方面提供了一种本发明第一方面所述的疫苗株、本发明第二方面所述的疫苗组合物，或本发明第三方面所述的制备方法在制备用于单独使用或与其他免疫制剂和/或药物联合使用以治疗、预防、减缓和/或控制犬瘟热的制剂中的用途。

在一些实施方式中，所述犬瘟热是犬科动物犬瘟热、鼬科动物犬瘟热或猫科动物犬瘟热。

在一些实施方式中，所述犬瘟热是水貂犬瘟热、犬犬瘟热或狐狸犬瘟热。

附图说明

图1为待鉴定犬瘟热病毒分离培养的照片。

图2为待鉴定犬瘟热病毒分离株电镜照片。

图3为本发明犬瘟热活疫苗(CDV D2株)的生产工艺路线图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

定义：

临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株：针对本发明所请求保护的病毒株，很明显，没有突变的传代病毒株属于实质上相同的病毒株，其临床致病性与免疫原性没有变化是指没有实质性变化。由于检测操作条件，动物品种、年龄、性别、健康状况等体现的差别以及可预期的系统误差属于没有实质性变化，属于临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株。另外，病毒株传代多次后不可避免引入微小的突变，当突变发生在非编码序列区或者编码区的同义突变或者不影响病毒株致病性和免疫原性的突变(比如，可能是两个结构域之间的连接氨基酸残基，或者位于蛋白质高级结构内部因不与免疫细胞接触而不影响致病性或免疫原性的微小突变的残基)，这些微小的突变仍属于非实质性突变，应当视为临床致病性与免疫原性没有变化的突变病毒株。比如，本发明生物保藏号为CGMCC No.19397的病毒株的Vero细胞系传代病毒株，其临床致病性与免疫原性没有实质性变化，则属于临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株。

本发明的TCID₅₀是根据Reed-Muench法计算得到的。

犬瘟热强毒CDV-v株：由辽宁益康生物股份有限公司内部分离的毒株， ID₅₀数据是通过临床健康比格犬测定得到的。

DMEM，购自GIBCO，批号：1928536；新生牛血清，购自Bovogen Biologicals PtyLtd，批号：1507D；胰蛋白酶，购自GIBCO，批号：1902509。

Vero细胞，购自中国兽医药品监察所，由辽宁益康生物制品有限公司保存。

本发明所指现行《中国兽药典》为《中华人民共和国兽药典》2015版三部，中国农业出版社出版。

本发明犬瘟热活疫苗(CDV D2株)的生产工艺路线图参见图3。

实施例1.犬瘟热病毒原始毒株的获取

(1)病例

辽宁省辽阳市一家犬专业合作社犬场的幼犬发病，症状为：高热、精神沉郁、有涕和眼屎、后期出现神经症状。根据症状判断，疑似患有犬瘟热。

(2)病毒分离

取患病犬脑组织，将脑组织用灭菌生理盐水冲洗3次，按1g组织：10ml 的比例将脑组织加入灭菌冷生理盐水，放入组织搅拌机中，以10000～ 12000r/min充分捣碎脑组织，反复在-15℃以下冻融3次后，用3层灭菌纱布过滤2次，收集滤液，并以12000r/min 4℃下离心30分钟，收集上清，加入过滤除菌的终浓度为1000IU/ml青霉素、1000μg/ml链霉素，分装，得到组织液a。

将前述组织液a接种到Vero细胞上进行分离培养，培养液为含2v/v％新生牛血清的DMEM，接种量为1v/v％，置37℃、含5％CO₂培养箱中，观察，盲传4代均未观察到任何可见的细胞病变，在盲传至第5代时，细胞出现了蛛网状细胞病变(如图1)，在此基础上，进一步扩大1代，共培养收集200ml 细胞培养液a，作为毒种备用，大部分加入蔗糖脱脂奶保护剂后冻干保存。将细胞培养液a中所含的病毒称作毒株a。

将前述细胞培养液a用无血清DMEM细胞培养液作10倍系列稀释，取 10^-1～10^-8稀释度，分别接种已长成良好单层、弃去细胞培养液的96孔Vero 细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照8孔。置33℃、含5％CO₂培养箱吸附1小时后，每孔补加含4％新生牛血清的DMEM 细胞培养液0.1ml，置33℃、含5％CO₂培养箱培养观察6日，每日观察CPE 情况。根据Reed-Muench法计算TCID₅₀。结果病毒含量为10^5.5TCID₅₀/0.1ml。

(3)形态观察

用磷钨酸对步骤(2)的细胞培养液a上清中毒株a染色再负染染色，透射电镜观察，从形态上观察判断，形态多样，多呈椭圆形，有囊膜，上有圆形纤突，其中一个的照片参见图2，毒株a为犬瘟热病毒。

(4)分子生物学鉴定

针对犬瘟热病毒血凝素蛋白H基因片段，设计如下序列的引物F1a和 R1a，对细胞培养液a上清中毒株a进行RT-PCR检测，然后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带大小为335bp，符合犬瘟热H基因的长度，进一步判断，毒株a为犬瘟热病毒。

F1a：5′-GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3′

R1a：5′-CTTGAGCTTTCGACCCTTC-3′

(5)特异性试验

通过0.1ml犬瘟热病毒抗血清(中和效价不低于1:128)、犬细小病毒抗血清(中和效价不低于1:64)、犬病毒性肝炎病毒抗血清(中和效价均不低于1:128)、狂犬病病毒抗血清(中和效价不低于40IU/ml)和健康犬阴性血清(阴性血清为未免疫任何疫苗的4月龄健康犬的血清)(前述血清由军事兽医研究所病毒室惠赠)分别与0.1ml细胞培养液a孵育，病毒对照孔采用0.1ml 相同的病毒液不加任何血清，然后接种入已长成良好单层的Vero细胞，培养液为含2v/v％新生牛血清的DMEM，置37℃、含5％CO₂培养箱中，观察5 日，除了犬瘟热病毒抗血清孵育的病毒液接种的细胞及未做接种的正常细胞没有产生细胞病变以外，其他组细胞均产生了细胞病变。说明所分离获得的病毒为犬瘟热病毒。由此可知，毒株a为犬瘟热病毒。

(6)回归试验

将步骤(2)的细胞培养液a(含毒株a)用灭菌生理盐水稀释到病毒含量为10^4.0TCID₅₀/ml，接种2～3月龄CDV抗体阴性(SN＜1:2)的健康幼犬4 只，接种量为2.0ml，接种方式为：腹腔注射，接种后观察时间为28天，犬症状为：3只接种犬眼分泌物和鼻分泌物过多，4只犬发热至38.9℃～39.6℃，没有发生死亡，病程持续5天后康复，未出现第二次发热，4只饲养方式一致的未注射病毒的对照犬均未发病。这些症状为典型的犬瘟热症状，由此可以判断毒株a为犬瘟热病毒。

(7)确诊

经前面的检测鉴定综合判定，毒株a为犬瘟热病毒。

实施例2.犬瘟热病毒毒株的驯化与毒株生化、遗传的改变的测试

(1)病毒传代培养

将实施例1的细胞培养液a(含毒株a)在Vero细胞上连续传代培养至 150代，具体步骤如下：将已长成单层的Vero细胞，弃去生长液(成分为：含2v/v％新生牛血清的DMEM)，按5v/v％接种量接种实施例1的细胞培养液a，置33℃含5％CO₂培养箱吸附1小时，加入含2v/v％新生牛血清的DMEM 细胞维持液，置33℃含5％CO₂培养箱培养5～6日，当90％以上细胞出现CPE 时收获子代病毒，连续传代150代，将第150代命名为D2株。

(2)病毒存活性测试

将120、135、150代毒种分别用无血清DMEM细胞培养液作10倍系列稀释，采取实施例1步骤(2)相同的方法计算得到：120、135、150代致弱毒病毒含量分别为10^6.30TCID₅₀/ml、10^6.12TCID₅₀/ml、10^6.00TCID₅₀/ml。依照感染能力测量的病毒含量逐渐减少，也说明病毒的毒力在逐渐减弱。

(3)病毒安全性试验

取100、120、135、150代病毒细胞培养液，用灭菌生理盐水分别稀释为 10^5.0TCID₅₀/ml，皮下接种2月龄以上健康易感犬5只，每只4.0ml，分多点注射，同时设置4只不接种对照犬，隔离观察21日，分别记录各组犬的临床表现，具体情况参见表1。

表1.不同世代病毒毒力测定结果

表1的数据说明，病毒传135代已经失去了毒力，因此，传150代毒力会更弱，可能能够安全地用作活疫苗。

(4)免疫原性与免疫保护测试

将135代、150代毒种细胞培养液分别用灭菌的生理盐水稀释为 10^4.0TCID₅₀/ml，分别皮下注射接种5只6周龄犬瘟热病毒抗体阴性临床健康犬，同时设5只不接种病毒犬做对照组，免疫后21日采集血液分离血清，采用中和试验进行血清中和抗体效价测定，步骤为：以为含量为10^4.0TCID₅₀/ml 的实施例1步骤(2)的细胞培养液a(含毒株a)作为抗原(含200TCID₅₀)，对血清进行2倍稀释使用，通过接种Vero细胞观察CPE来判断免疫效果，根据Reed-Muench法计算抗体效价。

采集血液之后，用CDV-v株分别通过腹腔注射途径对免疫组和对照组犬各接种5.0ml(含量2ID₅₀/ml)，隔离饲养观察28日，记录临床表现，详情参见表2。

表2.免疫原性测定结果

由此可见，本发明所分离的犬瘟热病毒传代135代后，毒力消失，免疫原性良好。

(5)无菌检验：

随机抽取致弱的第150代冻存的犬瘟热病毒毒种(D2株)5支，按现行《中国兽药典》附录进行检验。

结果：TG培养基、GA培养基和GP培养基培养的5支毒种均无菌生长。

(6)支原体检验：

采用支原体培养基。随机取致弱的第150代冻存的犬瘟热病毒毒种(D2 株)，按现行《中国兽药典》附录进行检验。

结果：琼脂固体平板培养无“煎蛋”状支原体菌落。

阳性对照(猪鼻支原体)：固体培养基呈“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基颜色变黄pH6.35，呈酸性。

阴性对照：固体培养基无“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基pH7.48。

(7)外源病毒检验

以150代毒种(D2株)为模板，针对犬细小病毒VP2基因、犬病毒性肝炎病毒纤突蛋白基因做PCR扩增，针对犬副流感病毒N基因、狂犬病病毒N基因、犬瘟热病毒H基因做RT-PCR扩增，结果仅针对犬瘟热病毒H 基因扩增结果为阳性。

(8)致弱毒的特异性鉴定

取150代致弱毒用无血清DMEM稀释为200TCID₅₀/0.1ml，采用实施例1步骤(5)相同的方法测定病毒特异性，结果：除了犬瘟热病毒抗血清孵育的病毒液接种的细胞及未做接种的正常细胞没有产生细胞病变以外，其他组细胞均产生了细胞病变。说明D2株病毒为犬瘟热病毒。

(9)致弱毒的基因序列分析

利用犬瘟热病毒H基因全长(1735bp)序列的上、下游引物F2a、R2a，对致弱的第120代和150代病毒进行核酸扩增，测序，对序列进行比较。结果二者同源性为99.3％。

F2a：5’-ATGCTCTCCTACCAAGATAAGGTG-3’

R2a：5’-TCAAGGTTTTGAACGGTTACATGAG-3’

将传代致弱的第150代毒种作为犬瘟热活疫苗制备的候选毒株。

(10)微生物保藏

本发明将所分离并驯化的犬瘟热病毒D2株提交专利程序认可保藏机构保藏，其微生物保藏号是CGMCC No.19397的犬瘟热病毒D2株；分类命名为：犬瘟热病毒；保藏时间是：2020年3月30日：保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该病毒株称作犬瘟热病毒D2株、 CDV D2株、D2株。

实施例3.犬瘟热病毒疫苗的制备

(1)犬瘟热病毒株(D2株)的转瓶培养

(a)细胞扩大培养：将培养的Vero种子细胞扩大至转瓶中进行培养，培养液为含有8v/v％新生牛血清的DMEM，37℃温度下，控制转速10～11转 /小时，培养24小时。

(b)接种：取生长良好的Vero细胞单层转瓶，弃去培养液，按5v/v％接种量接种生产种毒实施例2所制备的犬瘟热病毒D2株(含量 10^4.0TCID₅₀/ml)，置33℃吸附1小时，加入含2v/v％新生牛血清的DMEM细胞维持液，置33℃温度下旋转培养，转速10～11转/小时。

(c)收获：逐日观察细胞病变，当CPE达到90％以上时，收获病毒培养液，-20℃冻融2次。同时抽样进行无菌检验和病毒含量测定。保证无菌后进行后续步骤。

(d)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。

(e)病毒含量：采取实施例1步骤(2)相同的方法测定病毒含量，保证病毒含量≥10^5.0TCID₅₀/ml。

(f)纯化：通过直径为0.22μm滤膜过滤处理步骤(c)所得病毒培养液，得到去除细胞及碎片的D2株犬瘟热病毒液。

(2)犬瘟热病毒株(D2株)的悬浮培养

(a)细胞的制备：取复苏培养的Vero细胞扩大至转瓶中进行培养，培养液为含有8v/v％新生牛血清的DMEM，37℃温度下，控制转速10～11转/ 小时。待细胞生长至致密单层后用240USP U/mg的胰蛋白酶消化分散，细胞活力不低于95％时，按2.0～10.0×10⁵细胞/ml接种密度将Vero细胞转移至生物反应器中，载体用量为2～5g/L，设定反应器细胞培养的参数(温度37±0.5℃， pH值7.2±0.1，DO值45±5％，转速为30r/min)。每间隔24h取样进行细胞观察、计数。

(b)接毒与收获：待生物反应器中Vero细胞长成致密单层，细胞密度达到3.0×10⁶细胞/ml，沉淀排出培养液，按照MOI＝0.005～0.01接种实施例2 所制备的犬瘟热病毒D2株，补加含2v/v％新生牛血清的DMEM细胞维持液进行病毒培养，设定反应器病毒培养的参数(温度33±0.5℃，pH值7.2±0.1， DO值45±5％，转速为30r/min)，培养96～120h或细胞病变达到90％以上时收获，-20℃冻融2次，同时抽样进行无菌检验和病毒含量测定。配苗前将检验合格的病毒抗原溶液通过无菌离心或过滤去除载体及细胞碎片。

(c)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。

(d)病毒含量：采取实施例1步骤(2)相同的方法测定病毒含量，保证病毒含量≥10^5.0TCID₅₀/ml。

(e)纯化：通过直径为0.22μm滤膜过滤处理步骤(b)所得病毒培养液，得到去除细胞及碎片的D2株犬瘟热病毒液。

(3)冻干保护剂的配制

冻干保护剂的配制包括：(a)稳定剂大分子部分：用100ml注射用水溶解分装后，116℃高压灭菌30分钟。其成分包括：0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、 2g山梨醇。(b)稳定剂小分子部分：用100ml注射用水溶解后滤过除菌。其成分包括：1g甘氨酸、8.3g蔗糖、9.2g海藻糖。(c)配苗时，将上述两部分溶液按1:1体积比混合后，得到冻干保护剂。

(4)疫苗的配制

将转瓶培养或悬浮培养得到的检验合格并纯化后的犬瘟热病毒病毒液 (使用灭菌生理盐水稀释到含量10^4.0TCID₅₀/ml)及灭菌的稳定剂按1:1体积比例混合均匀，定量分装。每头份包括1ml犬瘟热病毒原液和1ml冻干保护剂，每头份疫苗中的病毒含量不低于10^4.0TCID₅₀，分装后，迅速进行冷冻真空干燥，加盖密封，贴签。

冷冻干燥的步骤如下：

(i)在制品未装箱之前，干燥箱的搁板温度降到0℃左右，制品装箱后，干燥箱的搁板继续进行降温，搁板温度的设定为-45℃，此过程需运行时间1 小时，在此温度下保持2小时，使制品完全冻牢，共计3小时。

(ii)在产品预冻结束前1小时，冷阱开始降温，当冷阱温度达到-40～-50℃时，启动真空泵组进行抽真空，使冻干箱压力降至8pa～10pa，准备进行制品第一阶段升华干燥。

(iii)在开始第一阶段升华时，搁板温度为-28℃，升华界面不超过其崩解温度，冻干箱压力不超过18pa。第一阶段升华干燥的时间分三个阶段：搁板温度-40℃升高到-28℃，此过程需运行1小时，在此温度保持6小时；由搁板温度-28℃升高到-15℃，此过程需运行1小时；升华干燥时间6小时，由搁板温度-15℃升高到8℃，此过程需运行1小时；升华干燥时间4小时，第一阶段干燥结束，共计19小时。

(iv)解析干燥阶段：第二阶段升华干燥时，使制品温度达到28℃左右，此过程需运行1小时，在此温度保持时间为2小时，使制品水分含量达到 1～4％，冻干过程结束。

(5)成品检验

将转瓶培养和悬浮培养得到的各三批疫苗分别进行下面的测试。

(i)疫苗物理状态观察

6批三联苗均海绵状疏松团块，易与甁壁脱离，加灭菌生理盐水后迅速溶解。

(ii)无菌检验：

按现行《中国兽药典》附录进行检验。

结果：TG培养基、GA培养基和GP培养基培养的6批三联苗均无菌生长。

(iii)支原体检验：

采用支原体培养基。按现行《中国兽药典》附录进行检验。

结果：琼脂固体平板培养6批三联苗均无“煎蛋”状支原体菌落。

(iv)外源病毒检验

分别以6批三联苗的核酸为模板，针对犬细小病毒VP2基因、犬病毒性肝炎病毒纤突蛋白基因做PCR扩增，针对犬副流感病毒N基因、狂犬病病毒N基因、犬瘟热病毒H基因做RT-PCR扩增，结果仅针对犬瘟热病毒H 基因扩增结果为阳性。

实施例4.疫苗安全性的测定

将前述根据实施例3的方法通过转瓶培养所得病毒所制备的3批犬瘟热活疫苗分别用灭菌生理盐水稀释成5头份/ml的注射液，通过一次单剂量、单剂量重复、一次超剂量接种注射液进行安全性试验，每组5只2月龄临床健康水貂。

一次单剂量测试中，接种方式为皮下注射，接种剂量为1头份/只。

单剂量重复测试中，接种方式为皮下注射，接种剂量为1头份/只，间隔 14日重复接种一次，接种剂量为1头份/只，共接种2次。

一次超剂量测试中，接种方式为皮下注射，接种剂量为10头份/只。

5只未接种的健康水貂做对照，相同条件下饲养。

观察每次接种后14日内水貂的状态，结果表明，3批犬瘟热活疫苗如上各方式接种的水貂全部健活，与健康对照组水貂健康状况无明显差异，精神良好，行为未见异常，粪便正常，采食、饮水未见异常，体温正常，体重正常，注射局部吸收良好、未见红肿、无硬结，肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胆囊未见异常。因此，本发明所制备的犬瘟热活疫苗接种水貂安全，可供临床预防犬瘟热使用。

实施例5.疫苗免疫效力与保护测试

疫苗：本发明实施例3的方法制备的犬瘟热活疫苗(CDV D2株)，三个独立制备的批次，与实施例4相同。

受试动物：2月龄临床健康水貂。

攻毒用强毒株：犬瘟热强毒CDV-v株。

方法：2月龄临床健康水貂15只，随机分组，每组5只，取01批、02 批和03批疫苗，每头份疫苗用1ml灭菌生理盐水稀释后使用，每组分别以1 头份/只剂量皮下注射一个批次的疫苗，另设5只不免疫的水貂作为空白对照，在同条件下进行饲养。

免疫后21日，各组分别采血，根据现行《中国兽药典》的方法，采用中和试验方法测定犬瘟热病毒血清中和抗体效价，步骤为：以实施例2的方法做制备的犬瘟热病毒D2株作为抗原(含200TCID₅₀)，对各份血清分别进行 2倍稀释使用，通过接种Vero细胞观察CPE来判断免疫效果，根据 Reed-Muench法计算抗体效价。

采集血液之后，立即进行强毒攻击。各免疫组和对照组每只水貂腹腔注射CDV-v株强毒，注射量为5.0ml(含量2ID₅₀/ml)，连续观察28日，记录各免疫组和对照组发病、死亡数量。结果参见表3。

表3.血清中和抗体和攻毒保护结果

结果：01批、02批和03批血清中和抗体效价平均值为分别为1:438.68、 1:396.79、1:402.56，攻毒后免疫组均5/5保护；对照组均5/5死亡。

由此可见，本发明所制备的犬瘟热活疫苗(CDV D2株)用于预防水貂犬瘟热能起到很好的保护效果。

由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

Claims

1.一种用于治疗、预防、减缓和/或控制犬瘟热的疫苗株，所述疫苗株是犬瘟热病毒疫苗株，所述犬瘟热病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.19397的病毒株。

2.一种用于治疗、预防、减缓和/或控制犬瘟热的疫苗组合物，所述疫苗组合物以权利要求1所述的疫苗株为免疫原。

3.如权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物的原料包括所述免疫原和辅料。

4.如权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物为活疫苗组合物。

5.如权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中，所述疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为1.0×10^4.0TCID₅₀：50-150mg。

6.如权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中，所述疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为1.0×10^4.0TCID₅₀：105mg。

7.如权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗株的TCID₅₀是基于Vero细胞培养根据Reed-Muench法计算得到的。

8.如权利要求2-7中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗株的培养方法包括如下步骤：

（i）将所述疫苗株接种到Vero细胞中培养，收获所述疫苗株的粗毒液；

（ii）将所述疫苗株的粗毒液纯化，得到纯化的疫苗株毒液。

9.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，在步骤（i）中，当CPE达到80%以上时，收获所述疫苗株的粗毒液。

10.如权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，在步骤（i）中，当CPE达到90%以上时，收获所述疫苗株的粗毒液。

11.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，在步骤（i）中，按照所述病毒株与培养液10^4.0TCID₅₀：15-30ml的用量比接种。

12.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，在步骤（i）中，按照MOI=0.005~0.01的用量接种。

13.如权利要求11所述的疫苗组合物，其特征在于，在步骤（i）中，所述培养液为含1.5-2.5v/v%新生牛血清的DMEM。

14.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，在步骤（i）中，所述培养的温度为32-34℃。

15.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，在步骤（i）中，所述培养的pH值为7.0-7.5。

16.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，在步骤（i）中，所述培养的DO值为40-50%。

17.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，在步骤（i）中，当所述培养为转瓶培养时，所述培养是在9-12转/小时条件下进行的。

18.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，在步骤（i）中，当所述培养为悬浮培养时，所述培养是在25-35转/分钟条件下进行的。

19.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，在步骤（i）中，所述Vero细胞来自单层Vero细胞。

20.如权利要求19所述的疫苗组合物，其特征在于，在步骤（i）中，用胰酶消化所述单层Vero细胞后接种所述疫苗株。

21.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，在步骤（i）中，对所述疫苗株的粗毒液进行无菌检验。

22.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，在步骤（i）中，所述Vero细胞的制备步骤为：将培养的Vero种子细胞扩大培养，得到扩大培养的Vero细胞。

23.如权利要求22所述的疫苗组合物，其特征在于，所述扩大培养是在36.5-37.5℃下进行的。

24.如权利要求22所述的疫苗组合物，其特征在于，所述扩大培养是在9-12转/小时条件下在转瓶中进行的。

25.如权利要求22所述的疫苗组合物，其特征在于，所述扩大培的养培养液为含有6-10v/v%新生牛血清的DMEM。

26.如权利要求22所述的疫苗组合物，其特征在于，所述扩大培的时间为18-30h。

27.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，当所述培养为悬浮培养时，将扩大培养的Vero细胞用胰酶消化之后转移到生物反应器中继续培养。

28.如权利要求27所述的疫苗组合物，其特征在于，在所述生物反应器中，所述继续培养的温度为36-38℃。

29.如权利要求27所述的疫苗组合物，其特征在于，在所述生物反应器中，所述继续培养的pH值为7.0-7.5。

30.如权利要求27所述的疫苗组合物，其特征在于，在所述生物反应器中，所述继续培养的DO值为40-50%。

31.如权利要求27所述的疫苗组合物，其特征在于，在所述生物反应器中，所述继续培养是在25-35转/分钟条件下进行的。

32.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，在步骤（ii）中，将所述疫苗株的粗毒液冻融1-3次后纯化。

33.如权利要求32所述的疫苗组合物，其特征在于，在步骤（ii）中，所述纯化的方法为：用直径为0.22-0.45µm滤膜过滤，除去细胞及细胞碎片，得到所述纯化的疫苗株毒液。

34.如权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述纯化的疫苗株毒液中病毒含量≥10^5.0TCID₅₀/ml。

35.如权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述辅料为冻干保护剂。

36.如权利要求35所述的疫苗组合物，其特征在于，所述冻干保护剂为包括2-3mg/mL聚乙烯吡咯烷酮、8-12mg/mL山梨醇、3-7mg/mL甘氨酸、30-50mg/mL蔗糖、30-60mg/mL海藻糖的水溶液。

37.如权利要求36所述的疫苗组合物，其特征在于，所述冻干保护剂的制备方法包括如下步骤：

制备包括4-6mg/mL聚乙烯吡咯烷酮、16-24mg/mL山梨醇的第一水溶液；

制备包括6-14mg/mL甘氨酸、60-100mg/mL蔗糖、60-120mg/mL海藻糖的第二水溶液；

将所述第一水溶液与所述第二水溶液以1:0.8-1.2的体积比混合，得到所述冻干保护剂。

38.如权利要求37所述的疫苗组合物，其特征在于，将所述第一水溶液灭菌后使用。

39.如权利要求38所述的疫苗组合物，其特征在于，将所述第一水溶液经110-120℃灭菌后使用。

40.如权利要求37所述的疫苗组合物，其特征在于，将所述第二水溶液灭菌后使用。

41.如权利要求40所述的疫苗组合物，其特征在于，将所述第二水溶液过滤除菌后使用。

42.权利要求2-41中任一项所述的疫苗组合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

将所述疫苗株制备成所述疫苗组合物。

43.如权利要求42所述的制备方法，其特征在于，将所述疫苗株与辅料混合，得到所述疫苗组合物。

44.如权利要求43所述的制备方法，其特征在于，将所述疫苗组合物干燥，得到干燥的疫苗组合物。

45.如权利要求44所述的制备方法，其特征在于，所述干燥为冷冻真空干燥。

46.如权利要求45所述的制备方法，其特征在于，所述冷冻真空干燥包括如下步骤：

（a）将所述疫苗组合物进行冷冻，得到冷冻的疫苗组合物；

（b）在真空条件下对所述冷冻的疫苗组合物进行温度分阶段升高的升华干燥，得到初步干燥的疫苗组合物；

（c）在真空条件下将初步干燥的疫苗组合物在常温条件下升华干燥，得到干燥的疫苗组合物。

47.如权利要求46所述的制备方法，其特征在于，在步骤（a）中，将所述疫苗组合物在-50℃到-40℃下进行冷冻。

48.如权利要求46所述的制备方法，其特征在于，在步骤（a）中，所述冷冻的持续时间为1.5-2.5h。

49.如权利要求46所述的制备方法，其特征在于，在步骤（b）中，所述真空条件为8pa~10pa。

50.如权利要求46或47所述的制备方法，其特征在于，在步骤（b）中，对所述冷冻的疫苗组合物进行-30℃到-26℃下的第一升华，-17℃到-13℃下的第二升华和6-10℃下的第三升华。

51.如权利要求50所述的制备方法，其特征在于，在步骤（b）中，所述第一升华的时间为4-8h。

52.如权利要求50所述的制备方法，其特征在于，在步骤（b）中，温度由-50℃到-40℃升高到-30℃到-26℃所需时间为0.5-1.5h。

53.如权利要求50所述的制备方法，其特征在于，在步骤（b）中，所述第二升华的时间为4-8h。

54.如权利要求50所述的制备方法，其特征在于，在步骤（b）中，温度由-30℃到-26℃升高到-17℃到-13℃所需时间为0.5-1.5h。

55.如权利要求50所述的制备方法，其特征在于，在步骤（b）中，所述第三升华的时间为2-6h。

56.如权利要求50所述的制备方法，其特征在于，在步骤（b）中，温度由-17℃到-13℃升高到6-10℃所需时间为0.5-1.5h。

57.如权利要求46所述的制备方法，其特征在于，在步骤（c）中，所述真空条件为8pa~10pa。

58.如权利要求46所述的制备方法，其特征在于，在步骤（c）中，所述升华的温度为25-30℃。

59.如权利要求46所述的制备方法，其特征在于，在步骤（c）中，所述升华的时间为1-3h。

60.如权利要求58所述的制备方法，其特征在于，在步骤（b）中，温度由6-10℃升高到25-30℃所需时间为0.5-1.5h。

61.如权利要求1所述的疫苗株、权利要求2-41中任一项所述的疫苗组合物，或权利要求42-60中任一项所述的制备方法在制备用于单独使用或与其他免疫制剂和/或药物联合使用以治疗、预防、减缓和/或控制犬瘟热的制剂中的用途。

62.如权利要求61所述的用途，其特征在于，所述犬瘟热是犬科动物犬瘟热、鼬科动物犬瘟热或猫科动物犬瘟热。

63.如权利要求62所述的用途，其特征在于，所述犬瘟热是水貂犬瘟热、犬犬瘟热或狐狸犬瘟热。