CN113832068B - 链球菌菌株及防治猪链球菌病的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及动物医学技术领域，尤其涉及链球菌菌株及防治猪链球菌病的疫苗。本发明提供了筛选获得的猪链球菌2型，猪链球菌7型及猪链球菌9型，三种菌种不论是单独制备疫苗，还是混合制备疫苗，都能对猪链球菌产生较强的保护能力。特别是以它们制备三价苗，彼此之间不产生干扰，且能够安全有效的对三种病原菌的攻击起到良好保护作用。

Description

链球菌菌株及防治猪链球菌病的疫苗
技术领域
本发明涉及动物医学技术领域，尤其涉及链球菌菌株及防治猪链球菌病的疫苗。
背景技术
猪链球菌病(Swine Streptococxosis)是由链球菌(Streptococcus suis，SS)引起的一种猪的急性、热性传染性疾病。自然条件下，不同年龄、品种和性别的猪均对本病易感，常见的有急性出血性败血症、化脓性淋巴结炎、脑膜炎以及关节炎。其中，以败血症和脑膜炎的危害最大，在某些特定诱因作用下，发病猪群的死亡率。
根据细胞壁荚膜多糖(CPS)的不同，可将猪链球菌分为35个血清型。但是并非所有的血清型都有致病性，大多数致病性血清在1～9型，其中犹疑血清型2、7和9型比较常见，且毒力较强。
猪链球菌病是国家规定的二类动物疫病，秋冬季节散发，危害严重，因此必须做好防治工作。预防猪链球菌病的主要措施是接种疫苗。目前，市售商品疫苗只有针对猪链球菌2型和7型的二价苗，但其不能对毒力同样较强的猪链球菌9型起到预防作用。而为了对多种类型的猪链球菌起到预防作用，只能对猪只进行多次接种，对猪只的应激较大。
因此研发能同时预防猪链球菌2型，猪链球菌7型及猪链球菌9型三种病原菌导致疾病的三联苗是本领域亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供链球菌菌株及防治猪链球菌病的疫苗。该菌株灭活制得的疫苗对猪链球菌病具有良好的免疫作用。
保藏编号为CGMCC No.22747的猪链球菌2型菌株。
保藏编号为CGMCC No.22748的猪链球菌7型菌株。
保藏编号为CGMCC No.22749的猪链球菌9型菌株。
本发明提供的猪链球菌分离自发病猪只及死亡猪只的脑、肺脏、气管、心血、关节液等，研究表明，本发明所述的菌株能够安全的引起动物的免疫，从而产生良好的保护作用。
本发明所述菌株中至少一种，在制备预防猪链球菌病的疫苗中的应用。
本发明提供了预防猪链球菌病的疫苗，其由至少一种灭活的菌株和辅料制得。
所述辅料包括佐剂；所述佐剂为MONTANIDE Gel02。
所述疫苗中，灭活菌株总体积与佐剂的体积比为90:10。
所述辅料还包括稀释剂；
所述稀释剂包括水和8.00g/L氯化钠、0.28g/L氯化钾、0.24g/L磷酸二氢钾、0.24g/L磷酸氢二钠，其pH值为7.3±1；
本发明所述疫苗中灭活的菌株的浓度皆为3×109CFU/ml。
一些实施例中，本发明所述的疫苗中，包括灭活的保藏编号为CGMCC No.22747的猪链球菌2型菌株。
具体实施例中，该疫苗包括：
成份 体积分数
6.7×1011CFU/ml的S4807菌悬液的灭活产物 0.45％
MONTANIDE Gel02 10％
无菌PBS 88.42％
总计 100％
另一些实施例中，本发明所述的疫苗中，包括灭活的保藏编号为CGMCC No.22748的猪链球菌7型菌株。
具体实施例中，该疫苗包括：
成份 体积分数
5.6×1011CFU/ml的S8980菌悬液的灭活产物 0.55％
MONTANIDE Gel02 10％
无菌PBS 88.42％
总计 100％
另一些实施例中，本发明所述的疫苗中，包括灭活的保藏编号为CGMCC No.22749的猪链球菌9型菌株。
具体实施例中，该疫苗包括：
成份 体积分数
5.2×1011CFU/ml的S1802菌悬液的灭活产物 0.58％
MONTANIDE Gel02 10％
无菌PBS 88.42％
总计 100％
一些实施例中，本发明所述的疫苗中，包括灭活的保藏编号为CGMCC No.22747的猪链球菌2型菌株和灭活的保藏编号为CGMCC No.22748的猪链球菌7型菌株。
具体实施例中，该疫苗包括：
成份 体积分数
6.7×1011CFU/ml的S4807菌悬液的灭活产物 0.45％
5.6×1011CFU/ml的S8980菌悬液的灭活产物 0.55％
MONTANIDE Gel02 10％
无菌PBS 88.42％
总计 100％
另一些实施例中，本发明所述的疫苗中，包括灭活的保藏编号为CGMCC No.22748的猪链球菌7型菌株和灭活的保藏编号为CGMCC No.22749的猪链球菌9型菌株。
具体实施例中，该疫苗包括：
成份 体积分数
5.2×1011CFU/ml的S1802菌悬液的灭活产物 0.58％
5.6×1011CFU/ml的S8980菌悬液的灭活产物 0.55％
MONTANIDE Gel02 10％
无菌PBS 88.42％
总计 100％
另一些实施例中，本发明所述的疫苗中，包括灭活的保藏编号为CGMCC No.22749的猪链球菌9型菌株和灭活的保藏编号为CGMCC No.22747的猪链球菌2型菌株。
具体实施例中，该疫苗包括：
另一些实施例中，本发明所述的疫苗中，包括灭活的保藏编号为CGMCC No.22749的猪链球菌9型菌株、灭活的保藏编号为CGMCC No.22748的猪链球菌7型菌株和灭活的保藏编号为CGMCC No.22747的猪链球菌2型菌株。
具体实施例中，该疫苗包括：
成份 体积分数
5.6×1011CFU/ml的S8980菌悬液的灭活产物 0.55％
5.2×1011CFU/ml的S1802菌悬液的灭活产物 0.58％
6.7×1011CFU/ml的S4807菌悬液的灭活产物 0.45％
MONTANIDE Gel02 10％
无菌PBS 88.42％
总计 100％
本发明所述疫苗的制备方法，包括：将所述菌株中至少一种灭活后，与缓冲液和佐剂混合，制得疫苗。
所述菌株灭活前，经培养和浓缩的步骤：
所述培养包括：将活化后的菌种分别加入牛血清，搅拌转速为100r/m～1000r/m，维持溶解氧DO值为40％～60％，pH值为7.2±0.2，培养6～12小时获得菌液；
所述浓缩包括：将培养后的菌液离心，收集菌体后以稀释剂重悬至各菌株的活菌数分别为1×1011CFU/ml～10×1011CFU/ml；
所述灭活包括：在菌液中加入甲醛，至体积分数为0.1％，37℃放置24h进行灭活，期间每3～4小时搅拌一次。
所述活化包括：一级菌种繁殖：冻干菌用TSA液体培养基稀释，分别划线接种与TSB固体培养基(含10％胎牛血清)中，37℃培养24小时，选择灰白色透明状小菌落接种于TSB固体培养基(含10％胎牛血清)，37℃培养18～24小时作为一级种子。二级种子的繁殖：用TSA液体培养基冲洗一级种子的TSB固体培养基培养物，接种于含有10％胎牛血清的TSA培养基，37℃培养16～18小时，经检验纯粹后即为二级种子。
本发明提供了筛选获得的猪链球菌2型，猪链球菌7型及猪链球菌9型，三种菌种不论是单独制备疫苗，还是混合制备疫苗，都能对猪链球菌产生较强的保护能力。特别是以它们制备三价苗，彼此之间不产生干扰，且能够安全有效的对三种病原菌的攻击起到良好保护作用。
生物保藏说明
生物材料：猪链球菌2型为S4807株，分类命名：猪链球菌Streptococcus suis，于2021年06月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22747；
生物材料：猪链球菌7型为S8980株，分类命名：猪链球菌Streptococcus suis，于2021年06月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22748；
生物材料：猪链球菌9型为S1802株，分类命名：猪链球菌Streptococcus suis，于2021年06月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22749。
具体实施方式
本发明提供了链球菌菌株及防治猪链球菌病的疫苗，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：菌株的分离
1.病料
采集养猪场发生呼吸困难、败血症、关节炎及神经症状的发病猪及死亡猪的脑、肺脏、气管、心血、关节液等。
2.细菌的分离培养
无菌操作，将疑似猪链球菌病的病料均匀涂布于含有10％胎牛血清的TSA固体培养基上。37℃温箱中培养24h后。挑选可疑单个链球菌菌落纯化。
3.血清型鉴定
按照下表的引物序列及PCR程序进行血清型的鉴定。
表1
4.菌种保存
将鉴定正确的猪链球菌2型命名为S4807株；猪链球菌7型为S8980株；猪链球菌9型为S1802株。将鉴定正确的猪链球菌加入脱脂奶粉进行冻干保存。
实施例2：猪链球菌2型、7型及9型抗原制备
1.菌株来源
所选用的猪链球菌2型为S4807株，保藏号为CGMCC No.22747。
所选用的猪链球菌7型为S8980株，保藏号为CGMCC No.22748。
所选用的猪链球菌9型为S1802株，保藏号为CGMCC No.22749。
2.疫苗半成品的制备及检验
2.1生产用种子批制备
2.1.1一级种子的繁殖
将S4807株、S8980株及S1802株冻干菌用TSA液体培养基稀释，分别划线接种与TSB固体培养基(含10％胎牛血清)中，37℃培养24小时，选择灰白色透明状小菌落接种于TSB固体培养基(含10％胎牛血清)，37℃培养18～24小时作为一级种子。
2.1.2二级种子的繁殖
用TSA液体培养基冲洗一级种子的TSB固体培养基培养物，接种于含有10％胎牛血清的TSA培养基，37℃培养16～18小时，经检验纯粹后即为二级种子。
2.2制苗用菌夜的制备
疫苗菌株以1％接种量在发酵罐中接入二级种子菌液，加入牛血清，设置搅拌转速为100～1000r/m，维持溶解氧DO值为40％～60％，pH值在7.2±0.2，培养6～12小时，收获菌夜做纯粹性检验后，置2～8℃保存备用。
2.3浓缩
2.3.1将收获的菌夜进行离心，弃去上清获得沉淀，加入原有体积1/10的无菌PBS进行悬浮，然后进行活菌计数。
表2制备的浓缩抗原及含量
抗原 灭活前含量(CFU/ml)
猪链球菌2型为S4807株 6.7×1011CFU/ml
猪链球菌7型为S8980株 5.6×1011CFU/ml
猪链球菌9型为S1802株 5.2×1011CFU/ml
2.4灭活
分别取检验合格的猪链球菌2型、猪链球菌7型及猪链球菌9型菌夜，按照菌夜体积总量缓慢加入总浓度为0.1％的甲醛溶液(V/V)，放37℃灭活，间隔3～4小时搅拌一次，24小时后取出。取样进行灭活检验和无菌检验，结果无菌生长。
实施例3疫苗制备
1佐剂准备
MONTANIDE Gel02(法国SEPPIC)，121℃高压灭菌30分钟备用。
2稀释剂的配置
无菌的PBS(0.01M，pH＝7.3±1)缓冲液：在900ml纯化水中加入8.00g氯化钠、0.28g氯化钾、0.24g磷酸二氢钾、0.24g磷酸氢二钠。然后定容至1L，121℃高压灭菌30分钟备用。
4配苗
取实施例1制备的猪链球菌2型、猪链球菌7型及猪链球菌9型浓缩灭活抗原，加入每个型菌液浓度为3×109CFU/ml，灭菌的PBS(0.01M，pH＝7.3±1)缓冲液补充至所需体积，然后将总抗原与MONTANIDE Gel02按照90：10(V/V)混合，以300～800r/min搅拌20～40分钟。
具体制备如下：
疫苗A
表3
成份 体积百分比％(V/V)
猪链球菌2型S4807株 0.45％
猪链球菌7型S8980株 0.55％
猪链球菌9型S1802株 0.58％
Gel02 10％
无菌PBS 88.42％
总计 100％
疫苗B
表4
成份 体积百分比％(V/V)
猪链球菌2型S4807株 0.45％
Gel02 10％
无菌PBS 89.55％
总计 100％
疫苗C
表5
成份 体积百分比％(V/V)
猪链球菌7型S8980株 0.55％
Gel02 10％
无菌PBS 89.45％
总计 100％
疫苗D
表6
成份 体积百分比％(V/V)
猪链球菌9型S1802株 0.58％
Gel02 10％
无菌PBS 89.42％
总计 100％
实施例4安全检验
1试验方案
1.1材料：疫苗A、疫苗B、疫苗C、疫苗D
1.2方法：选取3～4周龄仔猪25头，随机分为5组，每组5头。第1～4组分别颈部肌肉注射超剂量疫苗A～D，4ml/头，第5组为对照组不免疫，连续观察14日。
2试验结果
表7
对取3～4周龄仔猪进行超剂量注射结果如表7，结果显示，疫苗A～D，采食、精神、体温均正常，注射部位无不良反应，无其他可见异常临床表现；剖杀后，各脏器无异常病变。表明疫苗安全无副反应。
实施例4有效性检验
1.试验方案
1.1材料：疫苗A、疫苗B、疫苗C、疫苗D
1.2方法：选取3～4周龄仔猪50头，随机分为10组，每组5头。第1、4、7组分别颈部肌肉注射疫苗A，2ml/头，首免后14日，以相同的方式进行二次免疫；第2组颈部肌肉注射疫苗B，2ml/头，首免后14日，以相同的方式进行二次免疫；第5组颈部肌肉注射疫苗C，2ml/头，首免后14日，以相同的方式进行二次免疫；第8组颈部肌肉注射疫苗D，2ml/头，首免后14日，以相同的方式进行二次免疫；第3、6、9组为对照组不免疫攻毒对照组，颈部肌肉注射无菌PBS，2ml/头，14日，以相同的方式进行二次注射；第10组为不免疫不攻毒组。二次免疫后21日，用猪链球菌2型为S4807株攻击第1～3组，静脉注射1个致死剂量；用猪链球菌7型为S8980株攻击第4～6组，静脉注射1个致死剂量；用猪链球菌9型为S1802株攻击第7～9组，静脉注射1个致死剂量。第10组为空白对照组；攻毒后观察其临床症状及死亡情况，计算不同疫苗的保护率，
表8
2.试验结果
2.1安全性本发明疫苗A～D接种猪之后，采食、精神、体温均正常，注射部位无不良反应，采食、精神、体温均正常，注射部位无不良反应，无其他可见异常临床表现(表9)。
表9
2.2有效性
仔猪二次免疫后21日分别用猪链球菌2型为S4807株、猪链球菌7型为S8980株及猪链球菌9型为S1802株，静脉注射1个致死剂量，结果如表10。
表10
动物分组 头数 疫苗编号 发病数(头) 死亡(头) 保护
1 5 疫苗A 1/5 0/5 4/5
2 5 疫苗B 1/5 0/5 4/5
3 5 PBS 5/5 5/5 0/5
4 5 疫苗A 0/5 0/5 5/5
5 5 疫苗C 0/5 0/5 5/5
6 5 PBS 5/5 4/5 0/5
7 5 疫苗A 0/5 0/5 5/5
8 5 疫苗D 0/5 0/5 5/5
9 5 PBS 5/5 4/5 0/5
10 5 / 0/5 0/5 /
结论：
不论是三价苗还是针对单一病原菌的疫苗都能够实现良好的保护作用。其中，三价苗对三种病毒皆存在良好的保护作用，彼此之间未产生干扰。例如，三价苗对猪链球菌2型达到4/5保护，对猪链球菌7型和9型分别达到5/5保护。说明，本发明猪链球菌病三价灭活疫苗可有效抵御猪链球菌2型、7型及9型的攻击。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.预防猪链球菌病的疫苗，其特征在于，由灭活的猪链球菌2型、7型、9型菌株和辅料制得；
所述猪链球菌2型菌株的保藏编号为CGMCC No.22747；
所述猪链球菌7型菌株的保藏编号为CGMCC No.22748；
所述猪链球菌9型菌株的保藏编号为CGMCC No.22749。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，疫苗中灭活的猪链球菌菌株的浓度皆为3×109CFU/ml。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于，所述辅料包括佐剂；所述佐剂为MONTANIDE Gel02，所述灭活的菌株总体积与佐剂的体积比为90:10。
4.根据权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于，所述辅料还包括稀释剂；
所述稀释剂包括水和8.00g/L氯化钠、0.28g/L氯化钾、0.24g/L磷酸二氢钾、0.24g/L磷酸氢二钠，其pH值为7.3±1。
5.权利要求1~4任一项所述疫苗的制备方法，其特征在于，包括：将所述猪链球菌2型、7型、9型菌株灭活后，与缓冲液和佐剂混合，制得疫苗。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，
所述猪链球菌2型、7型、9型菌株灭活前，经培养和浓缩的步骤：
所述培养包括：将活化后的菌种分别加入牛血清，搅拌转速为 100 r/m ~1000r/m，维持溶解氧 DO 值为 40%~60%，pH 值为 7.2±0.2，培养6~12小时获得菌液；
所述浓缩包括：将培养后的菌液离心，收集菌体后以稀释剂重悬至各菌株的活菌数分别为1×1011CFU/ml ~10×1011CFU/ml；
所述灭活包括：在菌液中加入甲醛，至体积分数为0.1%，37℃放置24h进行灭活，期间每3~4小时搅拌一次。
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