CN104450559A

CN104450559A - 新的猪肺炎支原体菌株及其疫苗组合物

Info

Publication number: CN104450559A
Application number: CN201410606127.8A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 白朝勇
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: LUOYANG HUIZHONG BIOTECH CO., LTD.; Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2012-06-29
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2032-06-29
Also published as: CN104450559B

Abstract

本发明提供一株经分离鉴定为免疫原性更好的猪肺炎支原体毒株HN0613株，还提供了上述猪肺炎支原体HN0613株制备的猪肺炎支原体抗原与含有该猪肺炎支原体抗原的猪支原体肺炎疫苗。本发明还提供了一种猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体的二联组合疫苗，包含PCV2抗原(灭活的猪圆环病毒2型抗原或PCV2ORF2蛋白)、灭活的猪肺炎支原体以及疫苗佐剂。本发明的组合疫苗，可起到打一针该疫苗即可预防猪圆环病毒病和猪支原体肺炎目的，对猪肺炎支原体感染的预防保护效果。

Description

新的猪肺炎支原体菌株及其疫苗组合物

本案是发明专利申请201210224389.9的分案申请，原案申请日为2012年6月29日。

技术领域

本发明涉及一种新的猪肺炎支原体以及疫苗组合物，属于兽用疫苗领域。

背景技术

猪肺炎支原体是猪支原体肺炎的病原体。猪支原体肺炎是猪的一种慢性消耗性呼吸道病，临床感染率极高。该疾病导致持续几周的持续性咳嗽、被毛失去光泽、生长迟缓和外观不壮实。猪群一旦感染猪肺炎支原体，便难以清除，不仅严重影响猪群的生长发育，用药量增加，而且容易继发感染PRRSV(猪蓝耳病病毒)、PCV(猪圆环病毒)等，从而导致多种疫苗接种失败。猪肺炎支原体作为猪呼吸道病综合征的重要病原之一，每年的经济损失估计在2亿～2.5亿美元之间。直接或间接对养猪业造成了巨大的经济损失。

目前，世界上预防和控制猪肺炎支原体感染的有效的手段是对猪群进行疫苗免疫。大多数疫苗均为含有佐剂的全菌体灭活疫苗，通常情况下这些疫苗均能提供较好的保护作用，如改善临床症状，减少肺损伤，减少因猪肺炎支原体感染用药，提高生长效率等。目前，广泛应用的疫苗是以猪肺炎支原体J株或P株作为抗原的灭活疫苗，使用J株或P株制备的疫苗在全球很多国家销售和使用。然而，由于猪群中的流行株的变异，在临床上仍能观察到不同的猪群疫苗免疫后免疫效果方面存在差异，即存在一些免疫效果欠佳的群体。临床上观察到的这些差异原因是由于猪群中的流行株与疫苗株间存在抗原差异造成的(Villarreal等，BMC Veterinary Research2012,8:2)。有研究表明，目前猪群中流行的毒株在基因水平、蛋白水平以及毒力方面与疫苗使用的猪肺炎支原体J株或P株存在较大的差异(如文献Stakenborg等,Vet Microbiol2005,109:29-36；Calus等，Vet Microbiol2007,120:284-91.；Vicca等Vet Microbiol2003,97:177-190.；Meyns等，Prev Vet Med2004,66:265-275中所报道的内容)。上述文献资料表明，疫苗使用的猪肺炎支原体J株对猪支原体肺炎的临床预防和治疗效果欠佳。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种经分离鉴定为免疫原性更好的猪肺炎支原体毒株，并以该毒株为抗原研制保护效果更好的疫苗。

即发明人意外发现一株猪肺炎支原体毒株，该毒株具有良好的免疫原性，与当前广泛使用的猪支原体肺炎疫苗株J株相比，具有更好的免疫原性，制备成疫苗后有更好的免疫保护效果。

即，本发明的第一方面是提供一种猪肺炎支原体菌株，菌株名称为猪肺炎支原体HN0613株(Mycoplasma hyopneumoniae strainHN0613)，保藏编号为CCTCC No:M2012230，保藏单位为位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏日期：2012年6月13日，保藏地址：中国武汉·武汉大学。

本发明还提供了上述猪肺炎支原体HN0613株制备的猪肺炎支原体抗原与含有该猪肺炎支原体抗原的猪支原体肺炎疫苗。

优选地，本发明所述的猪支原体肺炎疫苗中，猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体HN0613株的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或任何其它含猪肺炎支原体HN0613株免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位抗原。更优选地，所述的猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体全菌抗原(即，灭活的猪肺炎支原体HN0613株)。

优选地，本发明所述的猪支原体肺炎疫苗中，猪肺炎支原体抗原的含量为所述的灭活的猪肺炎支原体HN0613株抗原抗原的含量为10⁷～10⁹CCU/头份(以每头份2ml计，下同)，即灭活的猪肺炎支原体抗原在灭活前猪肺炎支原体含量为10⁷～10⁹CCU/头份(2ml)；更优选地，所述的灭活的猪肺炎支原体HN0613株抗原含量为灭活前1～2×10⁸CCU/头份；最优选地，灭活的猪肺炎支原体HN0613株的含量为灭活前2×10⁸CCU/头份(2ml)。

优选地，本发明所述的猪支原体肺炎疫苗中，还包括疫苗佐剂，所述佐剂指包含一种或多种物质的组合物，能够增强猪肺炎支原体的免疫原性和功效的物质。优选地，本发明所述的疫苗佐剂为Gel01(法国SCIPPIC)、氢氧化铝胶、矿物油、可代谢油、卡波姆(Carbomer)、蜂胶、ISA206(法国SCIPPIC)、ISA760VG(法国SCIPPIC)的一种或几种的组合。更优选地，本发明所述的疫苗佐剂为卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、Gel01(法国SCIPPIC)、铝胶；最优选地，发明所述的疫苗佐剂为Gel01(法国SCIPPIC)。

如本发明后续实施例所证明的，本发明的猪肺炎支原体HN0613株抗原制备的猪支原体肺炎疫苗，相对于猪肺炎支原体J株和P株的疫苗，可以更有效地预防和治疗猪肺炎支原体引起的猪支原体肺炎及相关疾病。

此外，发明人还意外地发现，本发明的猪肺炎支原体HN0613株抗原与其他的猪病原体抗原的配合更好，包括但不限于以下的猪病原体抗原：猪圆环病毒2型抗原、猪流感病毒(SIV)抗原、猪生殖呼吸综合征抗原(PRRSV)、副猪嗜血杆菌(HPS)抗原、猪伪狂犬病毒(PRV)抗原、猪波氏杆菌抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原，与本发明的本发明的猪肺炎支原体HN0613株抗原与其他的猪病原体抗原相互无干扰；特别地令人惊奇的是，当本发明的猪肺炎支原体HN0613株抗原与猪圆环病毒2型的抗原相配合时，不仅两种抗原之间无干扰，而且相对于两种抗原独立制备的疫苗(即猪肺炎支原体单苗和猪圆环病毒2型单苗)而言，免疫效力均有了显著地提高。

基于上述认识，本发明的另一方面是提供了一种预防或治疗猪圆环病毒2型(PCV2)、猪肺炎支原体感染的抗原组合物，其包含至少一种猪圆环病毒2型抗原和至少一种猪肺炎支原体抗原。

本发明的预防和治疗猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体感染的疫苗组合物中，包含：灭活的猪圆环病毒2型或PCV ORF2蛋白、灭活的猪肺炎支原体以及疫苗佐剂。

猪圆环病毒2型抗原是指含有至少一种PCV2抗原形式的任何组合物，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗PCV2感染的免疫应答。优选地，所述PCV2抗原是PCV2全病毒、优选为灭活的PCV2全病毒、含有PCV2免疫原性氨基酸序列(如ORF2蛋白)的嵌合病毒，任何其它至少含PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他成分。PCV2抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原：如梅里亚公司(Merial)的辉瑞公司(Pfizer)的PCV2；哈尔滨维科生物技术开发公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)；福州大北农生物技术有限公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗(DBN-SX07株)和基因工程亚单位疫苗(如勃林格殷格翰公司(Boehringer-Ingelheim)的Ingelvac)。

因PCV2基因组大小为1767bp或1768bp，不同毒株之间核苷酸序列同源性较高，均在90％以上，因此PCV2SH株(GenBank登录号为AY686763)、PCV2LG株(GenBank登录号为HM038034)、PCV2DBN-SX07-2(GenBank登录号为HM641752)均在本发明之内。

优选地，本发明中猪圆环病毒2型抗原为灭活全病毒抗原，优选PCV2SH株，保藏号为CGMCC No.23890，公开于专利文献CN101240264A。

优选地，本发明所述的灭活的猪圆环病毒2型每剂量或每头份含量灭活前为3×10^5.0～10^8.0TCID₅₀/头份，更优选本发明所述的灭活的猪圆环病毒2型含量为灭活前1×10^6.0TCID₅₀/头份。

优选地，本发明中猪圆环病毒2型抗原为含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他成份，更优选地，猪圆环病毒2型抗原为PCV2亚单位抗原，最优选地，猪圆环病毒2型抗原为PCV2 ORF2蛋白。其中，本发明PCV2 ORF2蛋白，优选序列表SEQNO1.DNA序列编码的蛋白或序列表SEQ NO2.氨基酸序列的蛋白或与其同源性在75％以上优选80％、更优选90％的蛋白能达到本发明目的的蛋白序列。本发明对PCV2 ORF2蛋白没有特别的限制，只要其具有保留对PCV2的免疫原性，任何PCV2 ORF2蛋白都可用作本文所述PCV2ORF2 DNA和/或多肽的来源。

优选地，所述PCV2 ORF2蛋白的含量为2～20μg/头份，优选5μg/头份。

猪肺炎支原体抗原是指含有灭活的猪肺炎支原体抗原，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪肺炎支原体感染的免疫应答。猪肺炎支原体包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株。优选地，所述猪肺炎支原体抗原是完整的猪肺炎支原体，优选为灭活形式，更优选为猪肺炎支原体HN0613株。

正如本领域技术人员所知，不同的微生物野外分离株在基因序列上有微小的变异，然而，当变异不影响其蛋白质合成、结构或者主要作用功能区时，该微生物之他种野外分离株即使基因序列无法百分之百相同，其基本的生理功能并不会有所改变。但是同源性比较如果针对全部的基因来进行比对，在实际上是非常巨大的工程，不太可行，目前国际上常使用16S Ribosomal RNA(16S rRNA)来进行细菌型的分辨，因此在相似性的比较上可以用16S rRNA来进行比对而得到其同源性。所以本发明所使用的支原体抗原并不限定于本发明所使用的野外分离株，16s rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性以及该基因序列足够长(包含约50个功能域)

因此，本发明包括与猪肺炎支原体(HN0613株)16S rRNA的同源性在80％上以上的菌株，更优选与HN0613株16S rRNA同源性在至少90％，至少95％，至少95％～99％的猪肺炎支原体菌株，即不改变猪肺炎支原体16S rRNA的前提下，本领域技术人员可以通过简单的筛选或诱变本发明的猪肺炎支原体，获得与本发明猪肺炎支原体16S rRNA高度同源的菌株，并获得相应地具有相同或相似免疫原性的抗原组合物。

优选地，本发明所述的灭活的猪肺炎支原体为HN0613株，保藏号为CCTCC M2012230。

优选地，本发明所述的灭活的猪肺炎支原体灭活前含量为10⁷～10⁹CCU/头份。更优先的猪肺炎支原体含量为2×10⁸CCU/头份

优选地，本发明所述的疫苗佐剂混合物为Gel01(法国SCIPPIC)、氢氧化铝胶、矿物油、可代谢油、卡波姆(Carbomer)、蜂胶、ISA206(法国SCIPPIC)、ISA760VG(法国SCIPPIC)的一种或几种的组合。更优选地，本发明所述的疫苗佐剂为卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、Gel01(法国SCIPPIC)、铝胶；最优选地，发明所述的疫苗佐剂为Gel01(法国SCIPPIC)。

优选地，本发明所述的所述的疫苗佐剂的用量为5％～30％重量，所述的疫苗组合物中抗原成份的混合物用量为70％～95％重量，即PCV2抗原、灭活的猪肺炎支原体的用量为70％～95％重量。

由上可知，本发明的猪肺炎支原体HN0613株抗原制备的猪支原体肺炎疫苗，是一种可以有效预防和治疗目前的流行的猪支原体肺炎的疫苗；由后续实施例所证明，本发明的猪支原体肺炎疫苗，免疫效果明显高于目前大量使用的猪肺炎支原体J株和P株疫苗，具有不影响增重、肺病变损失小的优点。

其次，本发明的猪肺炎支原体HN0613株抗原与其他的猪病原体抗原配合好，相互不影响各自的免疫效力的发挥，特别令人惊奇地是，当猪肺炎支原体HN0613株抗原与PCV2的抗原(灭活的PCV2抗原或PCV2ORF2蛋白抗原)可以显著地提高各自的免疫效力，因此，在临床使用中，可起到打一针该疫苗即可预防猪圆环病毒病、猪支原体肺炎两种种病的目的，和现有的疫苗相比较，本发明的技术方案对猪肺炎支原体有更好的保护效果。

附图说明

图1为Friis固体培养基猪肺炎支原体菌落狄氏染色图；

图2为猪肺炎支原体PCR鉴定图。

具体实施方式

菌株(毒株)的来源

所选用的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type2，PCV2)毒株为PCV2b基因型SH株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期:2008年3月4日，保藏号为CGMCCNo.2389，公开于专利申请CN101240264A。

所选用的猪肺炎支原体HN0613株(Mycoplasma hyopneumoniaestrain HN0613)，已在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏日期:2012年6月13日，保藏号为CCTCC No.M2012230，保藏地址：中国武汉·武汉大学。

PBS液配方：1000ml蒸馏水中加入NaCl9g、Na₂HPO₄·12H₂O6g、NaH₂PO₄.2H₂O0.4g，pH7.2。

本发明其他化学试剂，如无特别说明，均为分析纯，并购自国药集团。

本发明实施例中肺病变指数评分标准：根据7个肺叶病变程度进行评定，最大得分为28分。特异性损伤的肺叶面积为0％时，记为0分，1％～25％记为1分，26％～50％记为2分，51％～75％记为3分，大于75％为4分。

本发明实施例统计分析方法为：统计7个肺叶的肺病变指数，确定病变程度。用SPSS计算机软件进行ANOVA分析，比较各组间差异，确定病变差异的有效性。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例1、猪肺炎支原体HN0613株的分离鉴定

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1病料来源2006年从河南省各地采集疑似猪支原体肺炎病变肺脏，共16份。

1.1.2培养基猪肺炎支原体Friis培养基购自BD公司；猪血清购自GIBCO公司；酚红指示剂购自美国AMRESCO公司。

1.1.3生化试剂化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，狄氏染色试剂盒购自于重庆庞通医疗器械有限公司。生化鉴定试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.4阴、阳性血清兔抗猪肺炎支原体J株特异性血清，按参考文献方法制备(Meens,J.,Selke,M.,Gerlach,G.F.,2006.Identificationand immunological characterization of conserved Mycoplasmahyopneumoniae lipoproteins Mhp378and Mhp651.Vet.Microbiol.116:85–95.)。未免兔血清作为阴性血清。

1.2方法

1.2.1病料处理

取疑似支原体肺炎病变肺脏，在超净台内用无菌手术剪刀剪取发病部位边缘组织，放入无菌平皿，将病肺组织剪成1-2mm3碎块，接种Friis肉汤，37℃培养，每日观察培养液的pH值变化。培养液变色时，取第一代经0.45μm过滤器过滤的培养物0.5ml接种到1.5ml含青霉素2000U/ml的Frris肉汤培养基中，37℃继续培养，培养基变黄后直接取培养物进行移植传代，如培养物变色，进行涂片，分别进行革兰氏染色和瑞氏染色，镜检。如革兰氏染色未发现细菌，同时瑞氏染色发现支原体样菌体时，取0.2m1培养物涂布于Frris平板固体培养基表面，置37℃，5％CO2条件下培养，每日观察是否有支原体样菌落。取支原体样单个菌落接种于Friis肉汤，培养基颜色变黄后取0.2m1培养物涂布于Frris平板固体培养基表面置37℃，5％CO2条件下进行纯化培养，如此进行纯化培养2次。将最后一次纯化培养生长的支原体样菌落接种Frris液体培养基所得的颜色变黄培养物保存于-70℃备用。

1.2.2菌落狄氏染色

按参考文献进行(曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M].北京：北京农业大学出版社.1992.49～50，126～129，371～373.)，采用无菌方法从固体培养基上切下菌落，放到载玻片上，在两边垫上竹签，滴上狄氏染色液后再盖上一块玻片，置于4℃染色30min后低倍镜下观察结果。

1.2.3PCR鉴定及测序分析

用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA模板。PCR引物参考文献进行合成(J.Caron,M.Ouardani,and S.Dea.Diagnosis andDifferentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasmahyorhinis Infections in Pigs by PCR Amplification of the p36and p46Genes[J].Journal of clinical microbiology,2000,38(4):1390～1396)。FSp36，5’-GGGCCGATGAAACCTATTAAAATAGCT-3’Rsp36，5’-GCCGCGAAATTAAATATTTTTAATTGCATCCTG-3’，上海生工合成。PCR反应体系：超纯水34.5μl、10×PCR Buffer5μl、dNTP4μl、引物各2μl、模板2μl、TaqDNA聚合酶0.5μl。按下列参数进行PCR反应:预变性94℃3min；94℃30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环后；72℃终延伸10min。扩增结束后取上述产物琼脂糖凝胶电泳检测。直接将有特异性条带的PCR产物及引物提交至上海生工进行测序分析。

1.2.4生化试验：

生化试验参考文献进行(曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M].北京：北京农业大学出版社.1992.49～50，126～129，371～373.)。主要进行洋地黄皂甙敏感性试验、尿素酶试验、葡萄糖分解试验、精氨酸水解试验、三苯基氯化四氮唑(TTC)还原试验、七叶甙水解试验、甘露醇分解试验、薄膜和斑点形成试验。

1.2.5生长抑制试验(GIT)

Friis平板接种0.1ml对数生长期的猪肺炎支原体培养物，将未稀释的抗血清25μl吸附于灭菌的6mm滤纸片，将吸有血清的滤纸片贴附于平板表面，培养至菌落可见。正常兔血清处理的纸片作为阴性对照。培养观察圆纸片周围有无菌落抑制环的产生。抑制宽度达2mm以上时判为猪肺炎支原体阳性。

1.2.6分离菌株的致病性

将分离菌株培养物经气管注射1～2周龄健康易感猪3头，每头5ml(HN0613，10⁸CCU/ml)。另设3头条件相同的对照猪，各气管注射培养基5ml，作为对照。试验猪、对照猪隔离饲养。攻毒后按常规饲养，饲料中无抗生素。观察28日，每日测体温。注射28日后剖检，根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。试验组与对照组进行肺病变指数差异分析。对试验猪及对照猪按1.2.4进行猪肺炎支原体的分离，对分离株按1.2.3方法进行PCR鉴定。

2.结果

2.1培养结果

16份病料中仅有1份病料接种的培养基7日后变黄色，过滤接种后5日培养液变黄，培养液均匀混浊，转接于含青霉素的Friis培养基变色后，革兰氏染色未发现细菌，瑞氏染色发现支原体样菌体。转接于固体培养基后，菌落生长入培养基内部。菌落呈典型煎荷包蛋状，与支原体菌落形态相符，命名为HN0613株猪肺炎支原体。

2.2狄氏染色结果

在低倍镜下观察到，在Friis固体培养基的猪肺炎支原体的菌落被染成不褪色的中心深蓝色菌落(参见附图1)，与支原体菌落染色特性相符。

2.3PCR鉴定

所提取的分离培养物模板经PCR扩增后，再经琼脂糖凝胶电泳检测，待检病料或培养物均在750bp～1000bp之间接近1000bp的位置有一条带，与预期948bp相符(参见附图2，其中1.Marker DL2000；2.病料分离株HN0613；3.致病性试验分离株；4.阴性对照)。

2.4序列测定与分析

将所分离菌株PCR扩增产物测序与GenBank中进行blast比较。结果显示，HN0613分离菌株P36基因序列与NCBI中公布的Mhp P36基因序列相应序列同源性为98％以上。测序结果见SEQ ID No.4。

2.5生化及血清学鉴定

分离菌株生化反应与猪肺炎支原体生化特性相符(表1)。

表1HN0613分离株生化及生长抑制试验结果表

注:+阳性，-阴性；洋地黄皂苷敏感试验出现1mm以上抑制带者为支原体；TTC还原试验猪肺炎支原体阴性，猪鼻支原体阳性；生长抑制试验抑制宽度达2mm以上时判为猪肺炎支原体(曹澍泽.兽医微生物学及免疫学技术[M].北京：北京农业大学出版社.1992.49～50，126～129，371～373.)。

2.6分离菌株的致病性试验

将菌株培养物经气管内注射10日龄健康易感猪(IHA抗体<1:5)，10日后均相继出现咳嗽和气喘等猪支原体肺炎症状。28日后剖检可见轻度肺病变，病变指数在9～15之间。而对照组均未出现上述症状及病变，剖检猪肺部未见异常。临床观察和肺部病变结果见表2。

表2HN0613分离株对仔猪感染情况

注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，字母不同者表示差异显著(P＜0.05)。

对试验组3头猪进行猪肺炎支原体分离，对其变色液体培养物按1.2.3步骤进行PCR检测，结果在略小于1000bp处出现特异性条带(见图1泳道3)，目的条带大小为948bp，证明分离病原为猪肺炎支原体。

3结论

从猪支原体肺炎典型病例的病肺中分离到了疑似猪肺炎支原体的微生物，经各项鉴定具有猪肺炎支原体的特性，生长抑制试验、PCR及测序鉴定结果表明该微生物属于猪肺炎支原体，命名为猪肺炎支原体HN0613株。猪肺炎支原体HN0613在Friis培养基中培养含量可达10⁸～10⁹CCU，对健康易感猪具有一定的毒力，可致其产生运动后咳嗽、气喘、呼吸困难等支原体肺炎典型的临床症状及肺部肉变。

实施例2猪支原体肺炎疫苗组合物以及猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体的组合疫苗抗原的制备

1.1生产用菌(毒)种的制备

猪圆环病毒2型SH的制备：将毒种PCV2SH株用MEM液体培养基(用购自美国Invitrogen公司的MEM干粉培养基按说明书配制)作1:9稀释，然后按细胞培养液体积的5％接种于PK15(ATCC，保藏号为CCL-33)单层细胞，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液(MEM液体培养基中添加4％犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸)，37℃培养4日，冻融2～3次，收获病毒，病毒滴度为10^6.5TCID₅₀/ml。

猪肺炎支原体菌种的制备：冻干菌种启封后，按10％接种量接种液体培养基，37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获，经纯粹检，作为一级生产种子。取一级种子按5％接种量接种液体养基，37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获，经纯粹检，作为二级生产种子。

液体培养基的配方:牛心浸出液(BD公司)300ml，双蒸水360m1，校正pH值到7.4,121℃灭菌15分钟。再加入下列过滤除菌的成份:Hank's平衡盐溶液(10×)40m1,0.25(W/V)酚红10m1,马血清200m1，5％(W/V)水解乳蛋白100m1,25％W/V酵母浸出液20m1，10000IU/ml青霉素10ml。

1.2病毒液或菌液的培养制备

猪圆环病毒2型SH株病毒液的制备：用转瓶细胞培养法。将长满单层的PK15细胞，倒去细胞培养液(MEM液体培养基中添加6％犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸)，将毒种液体积比按0.1～0.2TCID₅₀/个细胞的接种量接种于PK15细胞上，旋转细胞瓶2周，37℃吸附30分钟，加入细胞维持液(步骤1.1所述)，置37℃旋转(10～12转/小时)培养。每日观察1～2次，细胞生长良好，37℃培养4日收获细胞和细胞液，冻融3次，置-20℃以下保存。

猪肺炎支原体菌液的制备：将鉴定合格的猪肺炎支原体HN0613株的二级种子分别按5％(v/v)接种于液体培养基(步骤1.1所述)，37℃振荡培养3～7日，待pH值由7.5降至6.8时收获。

1.3病毒液或菌液的处理

猪圆环病毒2型SH株病毒液的处理：将步骤1.2的病毒液用中空纤维滤柱(Millipore公司孔径10μm与0.45μm)过滤，除去细胞碎片。

1.4浓缩将猪圆环病毒2型SH、猪肺炎支原体HN0613株抗原液分别用密理博(Millipore公司)膜包(分子截留量为300Kda)作5倍(体积比)浓缩。

1.5含量测定

1.5.1猪圆环病毒SH株病毒含量测定

将病毒液用MEM液体培养基(步骤1.1所述)按本领域技术人员通用方法作10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-73个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15细胞单层4孔，每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5％CO₂的温箱中继续培养24小时，换细胞维持液，继续培养24小时；用冷丙酮固定细胞，用间接免疫荧光试验(IFA)测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞(呈绿色)的孔数，根据Karber氏法计算病毒TCID₅₀。

1.5.2猪肺炎支原体活菌计数测定

将含酚红指示剂的液体培养基分装至小试管中，设两排，每排13支，1.8ml/支，取0.2ml待检培养物接种至第一支小试管，混匀后依次10倍稀释至第12支小试管，第13管为对照管，置37℃摇振培养，记录21天为止产生颜色变化的最高管数，以判定CCU滴度，取两排结果的平均值。

1.6病毒液或菌液含量测定结果：

猪圆环病毒2型SH株、猪肺炎支原体HN0613株分别培养含量见表3。

表3含量测定

1.7病毒液或菌液的灭活

猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活：将检验合格的步骤1.3处理的病毒液加入甲醛溶液(洛阳市化学试剂厂分析纯，含量为37％～40％)，使甲醛溶液的终浓度为0.2％(V/V)，37℃灭活18小时，每4小时搅拌1次，每次10min，灭活结束后将灭活病毒液置2～8℃保存。

猪肺炎支原体(HN0613)菌液的灭活：步骤3制备的菌液中加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.3％(V/V)，37℃灭活24小时，其间每隔4小时搅拌1次，每次10min，灭活结束后将灭活菌液置2～8℃保存。

1.8灭活效果测定

1.8.1猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活检验：取少量灭活病毒液接种已长成单层的PK15细胞，37℃吸附1小时后弃病毒液，加入新的细胞维持液，37℃培养2日，应无细胞病变(CPE)，连续盲传3次，长成细胞单层后换成细胞维持液，37℃培养2日，用间接免疫荧光法(IFA)检测，无绿色PCV2阳性细胞产生。

1.8.2猪肺炎支原体灭活检验：取1ml灭活菌液接种50ml液体培养基，37℃培养，于第5、10日各移植一次，最后一次移植后继续培养观察11日，培养基pH值应不降低，培养基着色均应不发生变化。

1.8.3灭活结果

猪圆环病毒2型SH株、猪肺炎支原体的灭活检验结果见表，灭活是彻底的，见表4。

表4抗原的灭活检验效果

1.9猪圆环病毒2型亚单位抗原的制备：按照专利CN101884787A中所述方法进行制备PCV2亚单位抗原，即按照下面的步骤制备PCV2ORF2蛋白(即PCV2亚单位抗原)：

1、首先设计引物Spe-ATG(5'-cgactagtatgacgtatccaaggaggcgt-3')和引物Hind-TAA(5'-gcaagctttattcattaagggttaagttggg-3')，以保藏号为CGMCCNo.2389的PCV2-SH株的基因组DNA为模板，扩增PCV2ORF2基因(即，SEQ ID NO1序列)，并将扩增的ORF2基因克隆入pMD-18T载体中，获得重组载体pT-ORF2，重组载体pT-ORF2含序列表中的SEQ ID NO1序列。

设计四条引物，以pT-ORF2为模板，通过融合PCR方法在ORF2基因序列5`端引入蜂毒素信号肽核苷酸序列和限制性酶SpeⅠ和HindⅢ酶切位点。引物如下：

HBM-F15'-tttcttacatctatgcgacgtatccaaggaggcgt-3'

HBM-R15'-ggcaacgttgactaagaatttcatactagtatcgtccac-3'

HBM-F25'-ttatggtcgtatacatttcttacatctatgcg-3'

HBM-R25'-aaacaagggcaacgttgactaagaatttc-3'

通过Spe Ⅰ和HindⅢ双酶切带有蜂毒素信号肽核苷酸序列的ORF2序列，并将其克隆入转移载体pFastBac^TM1(Invitrogen)，构成包含猪圆环病毒2型重组ORF2基因的载体pFastBacP2，其中，重组转移载体pFastBacP2含蜂毒素信号肽核苷酸序列，即含序列表中的SEQ ID NO2序列；

2、将pFastBacP2转化含有病毒穿梭质粒Bacmid的大肠杆菌DH10Bac(购自Invitrogen公司)，获得重组质粒Bacmid-P2；PCR筛选，提取阳性质粒，制备阳性重组质粒Bacmid-P2DNA。采用Reagent转染Sf9细胞(购自Invitrogen公司)，待细胞出现病变后，进行重组病毒噬斑纯化和病毒扩增，然后通过通用引物M13F和M13R进行PCR验证目的重组ORF2基因。纯化获得重组杆状病毒，命名为vBac-P2，将vBac-P2重组杆状病毒感染悬浮培养的昆虫细胞High Five^TM(购自Invitrogen公司)。在含有200～350ml的EXPRESS FIVE SFM培养基的500ml转瓶中无菌悬浮培养HighFive^TM细胞，接种细胞密度为0.3～0.6×10⁶个细胞/ml。当细胞密度达到1×10⁶个细胞/ml时，用重组病毒vBac-P2接种各转瓶，接种到各转瓶中的重组杆状病毒具有不同的感染复数(M.O.I.)，分别是0.01、0.1、1。接种重组杆状病毒后，以26～28℃，转速为100rpm，培养4天。

3、在上述High Five^TM细胞培养瓶中，接种后每12小时对各瓶取样，即48h、60h、72h、84h和96h取样。各样品以10,000g离心20分钟，分离上清液和沉淀。上清液通过1μm的滤膜进行过滤，过滤后进行SDS-PAGE电泳和紫外分光光度计测定上清液中的猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白及其含量，并由测序可知，重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白序列含序列表中的SEQ ID NO3序列。制备使用PBS(0.01mM，pH7.4)将重组猪圆环病毒2型ORF2蛋白浓度稀释至50μg/ml，置-20℃以下保存。

实施例3、组合物疫苗的制备：

为了比较疫苗的免疫效果，制备组合物疫苗时选择Montanide^TMGel佐剂(法国赛比克SEPPIC公司生产)，分别制备猪圆环病毒病(全病毒抗原或ORF2蛋白)、猪支原体肺炎二联灭活疫苗及猪支原体肺炎单苗。具体配制情况如下：

配制方法:配方如表5。取实施例1制备的PCV2抗原和猪肺炎支原体抗原。将浓缩后的抗原液根据联苗及单苗中最终的抗原含量制备成混合抗原液或直接制备成抗原液，然后将抗原液与Gel01佐剂(法国赛比克SEPPIC公司生产)按90:10(V/V)混合，用pH为7.2的PBS液补充体积以300转/分钟搅拌30分钟即可。

表5GEL01佐剂疫苗的配方及含量(每头份以2ml疫苗计)

具体如下：

疫苗1的制备过程：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备灭活PCV2SH抗原10ml、Mhp支原体HN061310ml。然后加入pH为7.2的PBS液70ml，最后加入Gel01佐剂10ml(法国赛比克SEPPIC公司生产)，37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml。

疫苗2制备过程：在无菌烧杯中依次加入实施例1制备的PCV2ORF2蛋白抗原2ml、Mhp支原体HN061310ml。然后加入pH为7.2的PBS液78ml，最后加入Gel01佐剂10ml(法国赛比克SEPPIC公司生产)，37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml。

疫苗3制备过程：在无菌烧杯中加入实施例1制备的Mhp支原体HN061310ml。然后加入pH为7.2的PBS液80ml，最后加入Gel01佐剂10ml(法国赛比克SEPPIC公司生产)，37℃，500转/分钟，搅拌10分钟，即得疫苗100ml。

其它抗原含量疫苗如表6，其制备方法和过程同上述疫苗1、2、3的制备。制备疫苗前需将实施例1制备的抗原按实施例1的浓缩方法在次进行浓缩，PCV2全病毒抗原20倍浓缩，猪肺炎支原体抗原2倍浓缩。

表6GEL01佐剂疫苗的配方及含量(每头份以2ml疫苗计)

实施例4、猪支原体肺炎灭活疫苗(HN0613株)的免疫效力试验

4.1试验用疫苗免疫仔猪

按实施例3制备猪支原体肺炎灭活疫苗(疫苗3)，并经过无菌等检验合格后用于试验。疫苗4为购买勃林格殷格翰生产的猪肺炎支原体灭活疫苗(批号271-489)，疫苗5为购买西班牙海博莱生产的猪肺炎支原体灭活疫苗(批号24HQ-1)，疫苗4和疫苗5均为猪肺炎支原体J株制备的疫苗。疫苗6为购买美国普泰克公司生产的猪肺炎支原体灭活疫苗(批号MHB-10019)，所使用的菌株为P株。

选14～21日龄仔猪25头，共5组，5头/组。免疫组4组，分别疫苗3、疫苗4、疫苗5和疫苗6(表7)，对照组不免疫。疫苗3、疫苗4、疫苗5免疫组每头猪分别颈部肌肉注射相应的灭活疫苗2ml，疫苗6则进行两次免疫，1ml/次，两次免疫间隔2周。

表7疫苗免疫分组

4.2仔猪免疫后攻毒

猪肺炎支原体攻毒：在免疫后70d，进行猪肺炎支原体进行攻毒试验，免疫组和对照组仔猪用CVCC354株(购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株)气管注射5ml/头(100MID)，攻毒后观察30天，剖杀试验猪按根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。免疫组与对照组进行肺病变指数差异分析。

各试验组仔猪均在攻毒前称重，观察结束时称重，计算攻毒后至观察结束时的平均日增重。

4.3攻毒后结果

猪肺炎支原体攻毒后肺病变指数结果见表8。结果表明，疫苗3免疫仔猪平均肺病变指数为3.90，疫苗4、疫苗5、疫苗6免疫仔猪平均肺病变指数为5.80、5.90和5.83，，对照组平均肺病变指数为16.20。与对照组相比，疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6免疫组与对照组间平均肺病变存在极显著差异。疫苗3免疫组与疫苗4、疫苗5、疫苗6免疫组间平均肺病变指数存在显著差异。疫苗4、疫苗5、疫苗6免疫组仔猪平均肺病变仔数较高，仔猪肺病变较疫苗3免疫组仔猪明显。

攻毒保护情况见表9，疫苗3免疫组仔猪攻毒后免疫保护效果达5/5，而疫苗4、疫苗5、疫苗6免疫组仔猪攻毒后免疫保护效果分别为4/5、3/5和4/5。疫苗3、疫苗4、疫苗5和疫苗6免疫组仔猪平均日增重极显著高于对照组，而疫苗3免疫组仔猪平均日增重显著高于疫苗4、疫苗5和疫苗6免疫组仔猪。

以上结果表明，HN0613株猪肺炎支原体具有良好的免疫原性，制备成疫苗提供的免疫保护效果优于含有猪肺炎支原体J株或P株抗原的疫苗。

表8猪肺炎支原体攻毒各试验组猪肺损伤得分情况

注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，大写字母不同者表示差异极显著(P＜0.01)，小写字母不同表示差异显著(P＜0.05)

表9猪肺炎支原体攻毒保护情况

实施例5、含猪支原体肺炎HN0613株抗原的猪圆环病毒病猪支原体肺炎抗原二联灭活疫苗组合物的免疫效果与单苗以及现有技术联苗的对比试验

5.1试验用疫苗免疫仔猪

按实施例3所述方法制备的猪圆环病毒2型猪肺炎支原体的二联灭活疫苗(表5中疫苗1、疫苗2)并经过无菌等检验合格后用于试验。疫苗7(购自勃林格殷格翰动物保健公司茵格发猪圆环病毒2型疫苗CircoFLEX(批号：309-211))和实施例4中的表7中的疫苗4作为疫苗对照，疫苗8为疫苗4和疫苗7同时注射，命名为疫苗8。

选14～21日龄仔猪50头，共10组，5头/组。免疫组分为8组，分别免疫疫苗1、疫苗2、疫苗4、疫苗7和疫苗8，其中疫苗1、疫苗2和疫苗8均免疫2组10头仔猪，余下2组10头作为对照组(表10)。按分组疫苗1、疫苗2、疫苗4和疫苗7每头猪分别颈部肌肉注射相应的灭活疫苗2ml；疫苗7每头猪分别颈部肌肉注射相应的灭活疫苗1ml，疫苗8为使用两种单苗分别免疫，即每头猪分别颈部肌肉2ml疫苗4和1m疫苗7；对照组不免疫。

表10疫苗免疫分组

5.2仔猪免疫后攻毒

PCV攻毒：在首次免疫后35d，取疫苗1、疫苗2、疫苗7和疫苗8免疫猪各5头及对照组仔猪5头，3组免疫组和对照组仔猪各用PCV2SH株(含10^6.0TCID₅₀/ml)滴鼻1ml/头、肌肉注射2ml/头，攻毒后第4、7日，分别在每头攻毒猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/ml)，每个点接种1ml(4ml/头)，同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定。

猪肺炎支原体攻毒：在首次免疫后70d，取疫苗1、疫苗2、疫苗4和疫苗8免疫猪各5头及对照组仔猪5头，进行猪肺炎支原体进行攻毒试验，3组免疫组和对照组仔猪用CVCC354株(购自中国兽医药品监察所)气管注射5ml/头(100MID)，攻毒后观察30天，剖杀试验猪，根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。免疫组与对照组进行肺病变指数差异分析。

5.3攻毒后结果

5.3.1PCV攻毒

PCV攻毒后，体温变化情况见表11，疫苗1、疫苗2、疫苗7和疫苗8免疫组仔猪仅有个别猪只出现一过性体温升高现象，体温升高一天后很快恢复正常，无其它临床症状；对照组猪只攻毒后所有猪只体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓。

攻毒后发病及保护情况见表12、13。疫苗1、疫苗2、疫苗7和疫苗8免疫仔猪攻毒后无明显临床症状，未观察到特异性病理变化，抗原PCR检测均为阴性，保护效果达5/5；而对照组仔猪全部发病，临床症状，病理变化明显，病原PCR检测均为阳性。至攻毒观察结束，疫苗1、疫苗2、疫苗7和疫苗8免疫仔猪平均日增重无显著差异，与对照组相比，疫苗1、疫苗2、疫苗7和疫苗8免疫仔猪平均日增重均极显著高于对照组。表明疫苗1、疫苗2、疫苗7和疫苗8免疫后对PCV的攻毒保护效果良好。

表11PCV2攻毒后各组试验猪体温超40.5℃的天数比较

表12PCV攻毒后各组试验动物发病判定结果

PCV攻毒后符合以下3项中的任何2项，即可判为发病。

A.临床症状：仔猪体温升高(≥40℃)，应至少持续3日，出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓；

B.病理变化：腹股沟和气管淋巴结水肿、肺脏轻度水肿，肾脏发黄或有点状坏死。组织学病变为淋巴结有明显淋巴细胞侵入，或有多核巨细胞；

C.病毒检测：用PCR检测淋巴结组织，检测到PCV2。

表13免疫仔猪PCV攻毒后保护情况

5.3.2猪肺炎支原体攻毒

猪肺炎支原体攻毒后肺病变指数结果见表14。结果表明，疫苗1、疫苗2平均肺病变指数分别为4.0和4.2，而疫苗4和疫苗8免疫组仔猪平均肺病变指数为6.4和6.7。疫苗4和疫苗8免疫组攻毒后仔猪肺病变比疫苗1、疫苗2免疫组仔猪肺病变明显；攻毒后到观察结束时疫苗1、疫苗2免疫仔猪的平均日增重显著高于疫苗4和疫苗8免疫组仔猪(表15)。疫苗1、疫苗2免疫后攻毒达5/5和4/5的免疫保护效果，疫苗4和疫苗8免疫组免疫后攻毒保护效果均为3/5。

通过实施例1～5的试验说明，本发明所使用的猪肺炎支原体HN0613株菌株，无论制备成单苗还是与PCV抗原一起制备成联苗，均表现出良好的免疫原性，与含J株抗原的疫苗4、疫苗5和疫苗8比较试验结果表明，猪肺炎支原体HN0613株制备成单苗以及和PCV2抗原一起制备成联苗的对猪肺炎支原体CVCC354的免疫攻毒保护效果均优于含J株抗原的疫苗4、疫苗5和疫苗8。

表14猪肺炎支原体攻毒各试验组猪肺损伤得分情况

组别	仔猪头数	平均肺病变指数±标准差
			疫苗1	5	4.00±0.55^Bc
疫苗2	5	4.20±0.49^Bc
			疫苗4	5	6.40±0.51^Bb
疫苗8	5	6.70±0.56^Bb
			对照组	5	16.00±0.71^Aa

表15猪肺炎支原体攻毒保护情况

实施例6、含猪支原体肺炎HN0613株抗原的猪肺炎支原体疫苗组合物，以及含猪支原体肺炎HN0613株抗原猪圆环病毒病猪支原体肺炎抗原二联灭活疫苗组合物的对猪肺炎支原体的免疫效果试验。

6.1试验用疫苗免疫仔猪

按实施例3所述方法制备的猪圆环病毒2型猪肺炎支原体的二联灭活疫苗(表6中疫苗A、疫苗B、疫苗C、疫苗D、疫苗E、疫苗F)并经过无菌等检验合格后用于试验。

选14～21日龄仔猪35头，共8组，5头/组。免疫组分为7组，分别免疫疫苗A、疫苗B、疫苗C、疫苗D、疫苗E和疫苗F，，余下1组10头作为对照组(表10)每头猪分别颈部肌肉注射相应的灭活疫苗2ml；对照组不免疫，健康对照组不免疫不攻毒。

6.2仔猪免疫后攻毒

猪肺炎支原体攻毒：在首次免疫后70d，进行猪肺炎支原体进行攻毒试验，3组免疫组和对照组仔猪用CVCC354株(购自中国兽医药品监察所)气管注射5ml/头(100MID)，攻毒后观察30天，剖杀试验猪，根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。免疫组与对照组进行肺病变指数差异分析。

6.3攻毒后结果

猪肺炎支原体攻毒后肺病变指数结果见表15。结果表明，各个试验则预防猪肺炎支原体引起的肺病变均有明显的效果，尤其是二联苗体现出来了更好的效果。

表15猪肺炎支原体攻毒各试验组猪肺损伤得分情况

组别	仔猪头数	平均肺病变指数
			疫苗A	5	4.10±0.55^Bc
疫苗B	5	3.980±0.47^Bc
			疫苗C	5	440±0.51^Bc
疫苗D	5	3.80±0.56^Bc
			疫苗E	5	3.70±0.55^Bc
疫苗F	5	6.30±0.53^Bb
			疫苗G	5	6.20±0.46^Bb
对照组	5	15.90±0.63^Aa

表16猪肺炎支原体攻毒保护情况

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种猪肺炎支原体，其特征在于，所述猪肺炎支原体为保藏号为CCTCC M2012230的猪肺炎支原体HN0613株，所述猪肺炎支原体的Mhp P36基因序列为SEQ ID No.4。

2.一种预防或治疗猪支原体肺炎相关疾病的猪支原体肺炎疫苗，其特征在于，含有猪肺炎支原体HN0613株制备的猪肺炎支原体抗原。

3.一种含猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物含有猪肺炎支原体抗原，与以下猪病原体抗原的一种或几种的组合：猪圆环病毒2型、猪流感病毒抗原、猪生殖呼吸综合征抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪波氏杆菌抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原。

4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪肺炎支原体HN0613株抗原为灭活的猪肺炎支原体HN0613株，或含有猪肺炎支原体HN0613株的免疫原性氨基酸序列嵌合病毒，或任何其它含猪肺炎支原体HN0613株免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位抗原的任意一种或几种的组合。