CN103667196A

CN103667196A - 含有猪圆环病毒2型抗原与猪流感抗原的疫苗组合物

Info

Publication number: CN103667196A
Application number: CN201210358160.4A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠; 白朝勇
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2012-09-25
Filing date: 2012-09-25
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2032-09-25
Also published as: CN103667196B

Abstract

本发明提供了一种同时抵抗猪圆环病毒2型（PCV2）和猪流感病毒（SIV）感染的疫苗组合物。疫苗组合物包含至少一种有效剂量的猪圆环病毒2型抗原和至少一种有效剂量的猪流感病毒抗原及佐剂。所述疫苗组合物可用于预防和治疗猪圆环病毒2型相关疾病和猪流感病毒病。

Description

含有猪圆环病毒2型抗原与猪流感抗原的疫苗组合物

技术领域

本发明涉及一种猪用疫苗，具体涉及一种同时抵抗猪圆环病毒2型（Porcinecircovirus type 2,PCV2）和猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）感染的疫苗。

背景技术

猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原。PMWS的临床特征有消瘦、皮肤苍白、呼吸困难、腹泻、黄疽等。病理变化可见全身淋巴结肿大，特别是腹股沟淋巴结肿大可达5～10倍；肺主要呈弥散性、间质性肺炎变化，质地硬如橡皮，表面一般呈灰褐色的斑驳状外观；肾的变化较多，可见皮质和髓质散布大小不一的白色坏死灶，由于水肿而导致其呈现蜡样外观；脾轻度肿大；大多数病猪的肝有不同程度的萎缩、纤维化。除PMWS外，猪皮炎与肾病综合征（PDNS）、增生性坏死性肺炎（PNP）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。PCV2相关的猪病，死亡率达10%～30%不等，较严重的猪场在暴发时死淘率高达40%，给养猪业造成严重的经济损失。

猪流感（Swine influenza，SI）是当前危害养猪业的一种重要的呼吸系统疾病，主要表现为高热、咳嗽和呼吸困难等症状，是规模化养猪场普遍存在且难以根除的群发性疫病之一。自20世纪90年代中期以来，由猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体等原发性病原体引起的猪呼吸道疫病综合征（Porcine respiratorydisease complex，PRDC）给世界各国养猪业造成了严重的损失。据国内外的文献报道，猪体内的A型流感病毒血清亚型有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2，国内的猪流感病毒血清亚型主要以H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2为主，而其中又以H1N1和H3N2亚型为主。由于猪流感病毒对呼吸道上皮有高度特异的亲嗜性，易使呼吸道上皮管壁受损，导致胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、链球菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒的继发感染或混合感染，增加疫情的复杂性，给养猪业造成极大的经济损失。此外，对猪流感的控制还具有重要的公共卫生意义。2009年起始于美国和墨西哥的H1N1亚型流感疫情再次证实了SIV在人流感研究和控制中具有重要地位。SIV的变异速度较快，传统疫苗的研制明显滞后，交叉保护能力有限，且诱导细胞免疫能力差，抗体产生较慢（崔克、江甜，猪流感疫苗研究进展，兽医导刊，2012(02):53-54.）。

猪流感跟圆环病毒引起的发病症状基本相同，而猪流感是条件致病的病毒，当两者的混合感染时，导致本领域技术人员很容易把两者的混合感染当做猪圆环治疗和预防，造成了猪流感病毒病没有防治而造成猪的生长性能降低，猪流感和圆环病毒的混合感染也造成猪免疫功能受到影响，极易感染猪瘟、猪蓝耳病等烈性传染病。

因此，本领域需要能产生保护性免疫应答以同时抵抗PCV2和SIV感染的疫苗，减少所述感染的发生率和/或减轻所述感染的严重性，或预防与所述感染有关的临床表现。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种疫苗，以解决现有技术的缺陷。

本发明的SIV H1N1毒株和SIV H3N2毒株的分离鉴定:

利用鸡胚分别从河南洛阳地区两猪场发病猪的鼻拭子分离到SIV H1N1亚型病毒（命名为ZJS株）和SIV H3N2亚型病毒（命名为WX株），通过RT-PCR鉴定、血凝试验和接种动物试验进行了鉴定。

SIV RT-PCR鉴定引物

利用上述SIV RT-PCR鉴定引物进行SIV H1N1和SIV H3N2的鉴定，结果显示两株病毒的HA基因和NA基因均能扩增出特异性条带，符合H1N1亚型和H3N2亚型特征。

SIV H1N1 ZJS株和SIV H3N2 WX株均能使0.5%的鸡红细胞发生凝集，分别用SIV H1N1阳性血清和SIV H3N2阳性血清分别与所述ZJS株和所述WX株作用后，均不能凝集0.5%的鸡红细胞。

所述SIV H1N1 ZJS株和SIV H3N2 WX株分别接种SIV血凝抑制抗体阴性的28日龄易感断奶仔猪，可致接种仔猪均出现明显的呼吸道症状，剖检均可见肺部有明显的实变，喉和气管有出血，气管和支气管内有泡沫样粘液。

分类命名：猪流感病毒血清型H1N1亚型ZJS株，Swine influenza virus(H1N1subtype)strain ZJS,Orthomyxoviridae,Influenza virus A。

保藏号：CCTCC NO.V201233

保藏日期：2012年8月13号

保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学

保藏单位：中国典型培养物保藏中心

分类命名：猪流感病毒血清型H3N2亚型WX株，Swine influenza virus (H3N2subtype)strain WX,Orthomyxoviridae,Influenza virus A。

保藏号：CCTCC NO.V201234

保藏日期：2012年8月13号

保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学

保藏单位：中国典型培养物保藏中心

本发明提供了一种猪流感病毒血清型H1N1亚型ZJS株，学名为Swine influenzavirus，H1N1 subtype strain ZJS,（拉丁文名Orthomyxoviridae,Influenza virus A），保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2012年8月13号，保藏号为CCTCCNo.V201233。

本发明还提供了一种猪流感病毒HA基因，它编码实质上含有序列号5所示的氨基酸序列的多肽，所述序列号5的多肽为猪流感病毒H1N1亚型ZJS株HA抗原。

本发明还提供了一种猪流感病毒HA基因，它具有序列号3所示的碱基序列，所述序列号3所示的碱基序列编码含有序列号5所示的氨基酸序列的多肽，所述序列号3所示的碱基序列为猪流感病毒H1N1亚型ZJS株HA基因。

本发明提供了一种猪流感病毒血清型H3N2亚型WX株，学名为Swine influenzavirus，H3N2 subtype strain WX,（拉丁文名Orthomyxoviridae,Influenza virus A），保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2012年8月13号，保藏号为CCTCCNo.V201234。

本发明还提供了一种猪流感病毒HA基因，它编码实质上含有序列号6所示的氨基酸序列的多肽，所述序列号6的多肽为猪流感病毒H3N2亚型WX株HA抗原。

本发明还提供了一种猪流感病毒所述的HA基因，它具有序列号4所示的碱基序列，所述序列号4的碱基序列编码含有序列号6所示的氨基酸序列的多肽，所述序列号4的碱基序列为猪流感病毒H3N2亚型WX株HA基因。

本发明还提供了一种猪流感病毒HA基因编码的多肽，它实质上含有序列号5所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种猪流感病毒HA基因编码的多肽，它实质上含有序列号6所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种预防或治疗猪流感病毒感染的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括H1N1亚型ZJS株全病毒抗原10⁴-10⁸EID₅₀/头份和H3N2亚型WX株全病毒抗原10⁴-10⁸EID₅₀/头份。

本发明还提供了一种预防或治疗猪流感病毒感染的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括H1N1亚型ZJS株血凝价为7-12Log2的HA抗原和H3N2亚型WX株血凝价为7-12Log2的HA抗原。

本发明提供了一种猪流感疫苗组合物和亚单位疫苗组合物，所述流感疫苗抗原优选包含H1N1亚型全病毒抗原10⁴-10⁸EID₅₀/头份和H3N2亚型全病毒抗原10⁴-10⁸EID₅₀/头份；更优地，所述的SIV病毒抗原至少包含H1N1亚型全病毒抗原10⁵-10⁷EID₅₀/头份和H3N2亚型全病毒抗原10⁵-10⁷EID₅₀/头份；所述亚单位抗原包含SIV H1N1亚型ZJS株和H3N2亚型WX株的HA基因表达的蛋白，其方法是通过分别将SIV H1N1亚型ZJS株和H3N2亚型WX株的HA基因分别克隆入杆状病毒基因组中（按照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统试剂盒操作说明书进行，Life Technologies公司，货号：10359016），构建重组杆状病毒，构建的重组病毒分别命名为VBac-ZJS和VBac-WX，感染昆虫Sf9细胞（Life Technologies公司，货号：12552014），再感染后收获细胞培养物及培养上清，冻融3次后，离心收获上清，测定HA效价后，作为亚单位抗原。优选地，亚单位抗原分别包含H1N1亚型HA抗原和H3N2亚型HA抗原血凝价为7-12Log2，更优选地，亚单位抗原包含H1N1亚型HA抗原和H3N2亚型HA抗原血凝价为11Log2。

本发明通过大量的筛选研究，意外发现PCV2抗原和SIV的抗原混合后，二者的抗原相互并不会产生干扰或影响；相反地，PCV2抗原能够促进SIV的抗原产生免疫应答。

因此，本发明的目的在于提供预防或治疗PCV2疾病和SIV疾病的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少一种有效剂量的猪圆环病毒2型抗原和至少一种有效剂量的猪流感病毒抗原，所述猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型灭活全病毒抗原、减毒活全病毒抗原，猪流感病毒抗原为猪流感病毒血清型H1N1亚型灭活全病毒抗原、减毒活病毒抗原和/或猪流感病毒血清型H3N2亚型灭活全病毒抗原、减毒活病毒抗原。

所述“PCV2抗原”是指含有至少一种抗原的任何组合物，所述抗原当对猪给药时，可诱导、刺激或增强抵抗PCV2感染的免疫应答。优选地，所述PCV2抗原是完整的PCV2全病毒，包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，含有，优选为灭活形式的PCV2全病毒，改良的PCV2活病毒或减毒的PCV2病毒，含有至少PCV2的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它含至少PCV2的免疫原性氨基酸序列的多肽、亚单位或其他成分，PCV2抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原：如梅里亚公司（Merial）的

辉瑞公司（Pfizer）的

PCV2；哈尔滨维科生物技术开发公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）；福州大北农生物技术有限公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗（DBN-SX07株）和基因工程亚单位疫苗（如勃林格殷格翰公司（Boehringer-Ingelheim）的Ingelvac

）。

所述“SIV抗原”是指包含至少一种抗原的任何组合物，所述SIV抗原在对猪给药后可诱导、刺激或增强抗猪流感病毒感染的免疫应答。优选地，所述猪流感病毒抗原是完整的猪流感全病毒，包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株，含有，优选为灭活形式的猪流感全病毒，改良的SIV活病毒或减毒的SIV病毒，含有至少SIV的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其它含至少SIV的免疫原性氨基酸序列的多肽、亚单位或其他成分。

本发明提供了一种预防或治疗PCV2病和SIV疾病的疫苗组合物，所述的猪圆环病毒2型抗原为10³-10⁷TCID₅₀/头份的灭活全病毒PCV2 SH株，保藏号为CGMCCNo.23890；所述的猪流感病毒ZJS株灭活全菌抗原为10⁴-10⁸EID₅₀/头份，所述的猪流感病毒WX株灭活全菌抗原为10⁴-10⁸EID₅₀/头份。

优选地，本发明中PCV2抗原为灭活全病毒抗原，优选PCV2 SH株，猪圆环病毒2型毒株SH属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus）中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保藏号为CGMCC No.23890，公开于专利文献CN101240264A。

本发明的疫苗中所述PCV2病毒含量优选含有至少为10³-10⁷TCID₅₀/头份；更优地，所述PCV2病毒含量为10⁴-10⁶TCID₅₀/头份。

优选地，本发明的疫苗中所述的SIV病毒抗原优选包含H1N1亚型全病毒抗原10⁴-10⁸EID₅₀/头份和H3N2亚型全病毒抗原10⁴-10⁸EID₅₀/头份；更优地，所述的SIV病毒抗原至少包含H1N1亚型全病毒抗原10⁵-10⁷EID₅₀/头份和H3N2亚型全病毒抗原10⁵-10⁷EID₅₀/头份。

优选地，本发明中所述SIV抗原为灭活全病毒抗原，优选血清型为H1N1亚型和/或H3N2亚型。

优选地，本发明的疫苗组合物中，所述的灭活的SIV全病毒抗原来源于血清型H1N1亚型ZJS株CCTCC No.V201233保藏单位中国典型培养物保藏中心和血清型H3N2亚型WX株保藏号为CCTCC No.V201234保藏单位中国典型培养物保藏中心。

本发明提供一种预防或治疗猪圆环病毒2型（PCV2）和猪流感病毒感染的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含至少一种有效剂量的猪圆环病毒2型抗原和至少一种有效剂量的猪流感病毒抗原，所述的猪圆环病毒2型抗原为亚单位抗原、重组活载体和DNA载体的抗原，所述猪流感病毒抗原为猪流感病毒血清型H1N1亚型亚单位抗原、重组活载体和DNA载体的抗原和/或猪流感病毒血清型H3N2亚型亚单位抗原、重组活载体和DNA载体的抗原。

本发明提供一种预防或治疗猪圆环病毒2型（PCV2）和猪流感病毒感染的疫苗组合物，所述的猪圆环病毒2型抗原为0.5~50μg/头份的PCV2 ORF2蛋白；所述猪流感病毒抗原为血凝价7-12Log2的ZJS株HA抗原和/或血凝价7-12Log2的WX株HA抗原。

优选地，所述PCV2 ORF2蛋白为含有实质上SEQ NO1.核苷酸序列编码的蛋白或编码实质上序列表SEQ NO2.氨基酸序列的蛋白。所述SEQ NO1.核苷酸序列为PCV2SH株的VP2基因的核苷酸序列，所述SEQ NO2.氨基酸序列为VP2的氨基酸序列。

优选地，本发明中PCV2抗原为含有PCV2的免疫原性氨基酸序列，更优选地，PCV2抗原为PCV2亚单位抗原，最优选地，猪圆环病毒2型抗原为PCV2 ORF2蛋白。其中，本发明PCV2 ORF2蛋白，优选序列表SEQ NO1.核苷酸序列编码的蛋白或序列表SEQ NO2.氨基酸序列的蛋白或与其同源75%以上，优选与其同源80%，更优选与其同源90%的蛋白序列。本发明对PCV2 ORF2蛋白没有特别的限制，只要其具有保留对PCV2的免疫原性，任何PCV2 ORF2蛋白都可用作本文所述PCV2 ORF2 DNA和／或多肽的来源。

优选地，本发明中猪流感病毒抗原为含有所述SIV的免疫原性氨基酸序列，更优选地，猪流感病毒抗原为所述SIV亚单位抗原，最优选地，猪流感病毒抗原为所述SIV HA基因表达产物。优选序列表SEQ NO3.核苷酸序列编码的蛋白或序列表SEQNO4.氨基酸序列的蛋白或与其同源75%以上的蛋白，优选与其同源80%以上，更优选地，与其同源90%以上。本发明对猪流感HA基因没有限制，只要其保留对猪流感的免疫原性，任何猪流感HA基因都可用作表达本文所述SIV HA基因DNA和／或多肽。

优选地，本发明的所述疫苗组合物中，所述PCV2 ORF2蛋白的含量为0.5~50μg/头份，更优选5~30μg/头份，最优选10-20μg/头份。

优选地，本发明的所述疫苗组合物中，所述的SIV HA蛋白包含H1N1亚型的HA蛋白和H3N2亚型的HA蛋白。

优选地，本发明的所述疫苗组合物中，所述SIV的亚单位抗原来源于血清型H1N1亚型ZJS株和血清型H3N2亚型WX株。

优选地，本发明的所述疫苗组合物中，所述SIV HA蛋白包含的H1N1亚型HA蛋白的血凝价7-12Log2。

优选地，本发明的所述疫苗组合物中，所述SIV HA蛋白包含的H3N2亚型HA蛋白的血凝价7-12Log2。

本发明提供了一种预防或治疗猪圆环病毒2型（PCV2）和猪流感病毒感染的疫苗组合物，所述疫苗组合物中还包含其它的猪病原体的附加抗原。

优选地，所述附加抗原选自：猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的抗原、猪肺炎支原体抗原、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）抗原、猪伪狂犬病毒（PRV）抗原、猪波氏杆菌抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、副猪嗜血杆菌抗原及它们的组合。

优选地，所述疫苗组合物还包括兽医学可接受的载体或赋形剂。

优选地，所述疫苗组合物还包含兽医学上可接受的佐剂。

优选地，本发明所述疫苗佐剂可包括氢氧化铝、磷酸铝、皂苷如Quil A和QS-21、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂。更优选地，乳剂基于轻液体轻质矿物油如Marcol 52、由烯烃寡聚产生的类异戊二烯油如角鲨烷或角鲨烯、卡波姆、Montanide^TM Gel等等。最优选地，本发明中所述疫苗佐剂为Montanide^TM Gel。

优选地，所述佐剂选自：氢氧化铝、磷酸铝、皂苷如Quil A和QS-21、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、卡波姆、Montanide Gel。

优选地，所述佐剂为5%～20%的Montanide^TM Gel。

优选地，所述佐剂为卡波姆的水溶液。

本发明提供了一种用所述的猪流感病毒血清型H1N1亚型ZJS株和H3N2亚型WX株制备疫苗组合物的方法，将ZJS株和WX株分别在MDCK细胞中大量增殖，经甲醛灭活，添加佐剂，乳化或搅拌均匀制备。

本发明提供了一种用所述的猪流感病毒ZJS株和WX株HA基因制备疫苗组合物的方法，将所述HA基因克隆入杆状病毒基因组中，通过将杆状病毒感染Sf9昆虫细胞表达SIVHA基因制备所述HA抗原，添加佐剂，乳化或搅拌均匀制备。

本发明提供了一种制备预防或治疗猪圆环病毒2型（PCV2）和猪流感病毒感染的疫苗的方法，所述方法包括将所述PCV2病毒株大量增殖，将所述猪流感病毒ZJS株和WX株大量增殖，分别灭活，加入免疫佐剂，乳化或搅拌均匀制备。

本发明提供了一种制备预防或治疗猪圆环病毒2型（PCV2）和猪流感病毒感染的疫苗的方法，所述方法包括将PCV2亚单位抗原基因克隆并大量表达，将所述H1N1亚型ZJS株和H3N2亚型WX株HA基因克隆并大量表达，添加免疫佐剂，乳化或搅拌均匀制备。

此外，本发明的另一个目的在于提供一种制备用于预防和治疗PCV2和SIV感染的疫苗组合物的方法，包括如下步骤：

（1）制备PCV2抗原。

（2）制备SIV抗原。

（3）将PCV2抗原液和SIV抗原液分别进行灭活后，加入免疫佐剂，乳化制备。

其中，步骤（1）中制备所述PCV2抗原包括制备PCV2全病毒抗原和PCV2亚单位抗原，其方法包括但不限于使用PK-15细胞培养、使用大肠杆菌表达系统、杆状病毒表达系统、酵母表达系统。

步骤（1）中制备所述PCV2抗原的方法包括：将PCV2毒种接种于PK15细胞上，优选毒种接种量为0.001-1 TCID₅₀/个细胞，优选培养温度为33-37℃，优选培养时间为2-5天，收获细胞培养物，反复冻融3次，收获病毒。

其中，步骤（2）中制备所述SIV抗原包括制备SIV全病毒抗原和PCV2亚单位抗原，其方法包括但不限于使用鸡胚、MDCK细胞系、Vero细胞系、BHK细胞系、CEF细胞系及使用大肠杆菌表达系统、杆状病毒表达系统、酵母表达系统。

步骤（2）中所述SIV抗原制备方法包括：将SIV H1N1亚型毒种和H3N2亚型毒种分别接种于长满单层的MDCK细胞中，优选毒种的接种量M.O.I.为0.001-0.1，优选培养温度为33-37℃，优选培养基含有2%-10%犊牛血清的D-MEM培养基，优选培养时间为24-96h，收获细胞培养物，冻融3次，收获病毒。

步骤（3）中所述的免疫佐剂优选为角鲨烯、卡波姆、Montanide^TM Gel等，更优选为Montanide^TM Gel。

采用本发明生产的PCV2、SIV二联灭活疫苗免疫猪后，有80%以上的猪能够得到保护，疫苗完全合格。

本发明还提供一种制备SIV的二价疫苗组合物，所述疫苗组合物包含H1N1 ZJS株和H3N2 WX株抗原，其制备方法如下：

将所述SIV H1N1亚型ZJS株毒株和H3N2亚型WX株毒种分别接种于长满单层的MDCK细胞中，优选毒株的接种量M.O.I.为0.001-0.1，优选培养温度为33-37℃，优选培养基含有2%-10%犊牛血清的D-MEM培养基，优选培养时间为24-96h，收获细胞培养物，冻融3次，收获病毒。

所述SIV抗原包括制备SIV全病毒抗原和亚单位抗原，其方法包括但不限于使用鸡胚、MDCK细胞系、Vero细胞系、BHK细胞系、CEF细胞系及使用大肠杆菌表达系统、杆状病毒表达系统、酵母表达系统。

本发明提供了一种所述的H1N1亚型ZJS株和H3N2亚型WX株HA基因在预防和治疗猪流感病毒相关疾病中的应用。

本发明提供了一种所述的H1N1亚型ZJS株和H3N2亚型WX株HA多肽在预防和治疗猪流感病毒相关疾病中的应用。

本发明提供了一种包含所述的H1N1亚型ZJS株和H3N2亚型WX株疫苗组合物在预防和治疗猪流感病毒相关疾病中的应用。

本发明提供了一种包含预防或治疗猪圆环病毒2型（PCV2）和猪流感病毒感染的疫苗组合物在预防和治疗猪圆环病毒相关疾病和猪流感病毒相关疾病中的应用。

以上可见，本发明至少有以下优点：

1）解决了现有技术的困难，改变了人们对猪圆环病毒和猪流感同时感染时的认识偏见，首次将猪圆环病毒2型抗原和猪流感病毒抗原按照合适的比例联合使用，而在本发明之前，一直没有人认为两种病可以同时进行预防进而这两种疫苗可以联合使用；

2）本发明的猪圆环病毒2型和猪流感病毒抗原组合物及使用该组合物制备的预防和治疗猪圆环病毒2型和猪流感病毒感染的二联疫苗，不仅不会产生两种抗原成份的相互免疫干扰或影响，而且意外发现猪圆环病毒2型（PCV2）和猪流感病毒（SIV）的抗原混合后，猪圆环病毒2型（PCV2）和猪流感病毒（SIV）的抗原组合物不仅能产生的保护性免疫应答的同时，还意外发现猪圆环病毒2型（PCV2）和猪流感病毒（SIV）抗原有相互增强免疫效果的作用，而且如本发明后续实施例所证明的，特别是存在其中一种抗原的情况下，另一种抗原量减半仍能维持本抗原的免疫效果，而这出乎本领域普通技术人员预料的。

3）上述预防和治疗猪圆环病毒2型和猪流感病毒感染的二联疫苗与猪圆环病毒2型或猪流感的单疫苗的效力相比，在对猪注射免疫过程中，猪体的应激反应出人预料地小，因此，本发明的二联疫苗安全性更佳，可以避免多次接种免疫出现的不良反应。

4）上述预防和治疗猪圆环病毒2型和猪流感感染的二联疫苗不仅可以是灭活的PCV2病毒抗原与灭活的猪流感抗原组成的二联疫苗，还可以是PCV2亚单位蛋白为抗原与灭活的猪流感抗原组成的二联疫苗，即PCV2ORF2蛋白为抗原与灭活的猪流感抗原组成的二联疫苗；

5）此外，本发明预防和治疗猪圆环病毒相关疾病和猪流感病毒相关疾病的二联疫苗，制备方法简单，疫苗的效价含量高，免疫方便快捷，与现有技术中的多次免疫，至少需要打2针或3针才能防治以上二种疾病的疫苗及其免疫方法相比，本发明仅免疫1次就能够预防PCV2和SIV两种病原感染，降低了免疫成本，节约了免疫程序，更加经济可靠。

附图说明

图1为猪流感病毒H1N1亚型ZJS株和H3N2亚型WX株RT-PCR鉴定的电泳图；

图2为猪流感病毒H1N1亚型ZJS株HA基因核苷酸序列与多种已分离的H1N1亚型毒株HA核苷酸序列比对分析图；

图3为猪流感病毒H3N2亚型WX株HA基因核苷酸序列与多种已分离的H3N2亚型毒株核苷酸序列比对分析图；

图4为猪流感病毒H1N1亚型ZJS株HA抗原氨基酸序列与SIV-H1N1-HQ698627分离株HA基因氨基酸序列对比分析图；

图5为猪流感病毒H3N2亚型WX株HA抗原氨基酸序列与SIV-H3N2-JX138525分离株HA基因氨基酸序列对比分析图。

附图标记

电泳泳道M、电泳泳道1、电泳泳道2、电泳泳道3、电泳泳道4、A为扩增的HA基因条带、B为扩增的NA基因条带。

具体实施方式

本发明中的术语“实质上含有”是指本发明的基因或多肽在保持其功能的范围内，序列号1、3、4的碱基序列，序列号2、5、6的氨基酸序列可以发生置换、插入或缺失等变异。

本发明中的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量。

本发明中所述的“TCID50”（50% tissue culture infective dose）是指半数细胞培养物感染量，是表示病毒感染力的一种表示方式。本发明中所述的“EID50”（egg 50%infective dose）是指半数鸡胚感染量，也是病毒感染力的一种表示方式。本发明中所述的“血凝价”是指SIV全病毒抗原或HA亚单位抗原使0.5%的红细胞发生100%凝集的最大稀释倍数，是具有血凝性抗原含量的一种表示方法。

本发明中所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline）的英文缩写，本发明中使用的是0.01mM的pH7.4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。

本实施例中的疫苗组合物、二联苗、PCV2和SIV二联灭活疫苗均指预防或治疗猪圆环病毒2型（PCV2）、猪流感的疫苗组合物，即至少包含猪圆环病毒2型抗原、猪流感抗原的疫苗组合物。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.猪流感毒株的分离和鉴定

本发明的SIV H1N1毒株和SIV H3N2毒株的分离鉴定:

利用鸡胚分别从河南洛阳市某猪场发病猪的鼻拭子和河南地区某猪场发病猪的鼻拭子中分离到SIV H1N1亚型病毒（命名为ZJS株）和SIV H3N2亚型病毒（命名为WX株），通过RT-PCR鉴定、血凝试验和接种动物试验进行了鉴定。

SIV RT-PCR鉴定引物

如图1所示，利用上述SIV RT-PCR鉴定引物进行SIV H1N1和SIV H3N2的鉴定：泳道M为Marker，泳道1中A为SIV H1N1亚型ZJS株的HA基因的扩增条带，泳道2中B为SIV H1N1亚型ZJS株的NA基因的扩增条带，泳道3中A为SIV H3N2亚型WX株的HA基因的扩增条带，泳道4中B为SIV H3N2亚型WX株的NA基因的扩增条带，结果显示两株病毒的HA基因和NA基因均能扩增出特异性条带。

SIV H1N1 ZJS株和SIV H3N2 WX株均能使0.5%的鸡红细胞发生凝集，分别用SIV H1N1阳性血清和SIV H3N2阳性血清分别与ZJS株和WX株作用后，均不能凝集0.5%的鸡红细胞。

SIV H1N1 ZJS株和SIV H3N2 WX株分别接种SIV血凝抑制抗体阴性的28日龄易感断奶仔猪，可致接种仔猪均出现明显的呼吸道症状，剖检均可见肺部有明显的实变，喉和气管有出血，气管和支气管内有泡沫样粘液。

猪流感病毒H1N1亚型ZJS株HA基因核苷酸序列比对分析

如图2所示，将SIV H1N1 ZJS株HA基因序列（Seq NO.2）与国内外发表在GenBank的SIV多种H1N1毒株HA基因序列通过Lasergene生物学软件的Megalign功能进行比对分析，结果显示，SIV H1N1 ZJS株HA基因序列与多种H1N1毒株HA基因序列具有较高的一致性，达90%以上，其中，国内北京地区2009年分离的H1N1毒株（HQ698627，即图2中标号8的序列）HA基因具有很高的一致性，二者核苷酸一致性达97.4%

如图3所示，将SIV H3N2 WX株HA基因序列（Seq NO.3）与国内外发表在GenBank的SIV多种H3N2毒株HA基因序列通过Lasergene生物学软件的Megalign功能进行比对分析，结果显示，SIV H3N2 WX株HA基因序列与国内2008年湖南分离的H3N2毒株（GenBank登录号：JX138525）HA基因具有较高的一致性，二者核苷酸一致性达97.2%。

如图4所示，将SIV H1N1 ZJS株HA多肽氨基酸序列与SIV-H1N1-HQ698627分离株HA多肽氨基酸序列比对，结果显示，二者氨基酸一致性为97.5%，其中仅第100、137、220、471、490、497、508、510、537、544位置存在差异。

如图5所示，将SIV H3N2 WX株HA多肽氨基酸序列与SIV-H3N2-JX138525分离株HA多肽氨基酸序列比对，结果显示，二者氨基酸一致性为98.4%，其中仅第11、26、41、91、223、242、434、495和506位存在差异。

实施例2：猪圆环病毒2型抗原和猪流感病毒抗原的制备

猪圆环病毒2型（SH株）病毒液的制备：将PCV2 SH株毒种按0.1 TCID₅₀/个细胞的接种量接种于长满单层的PK15（购自ATCC，型号为ATCC CCL-33^TM）细胞上，37℃吸附30分钟，加入含有4%（体积比）犊牛血清和2mM D-氨基葡萄糖盐酸的MEM液体培养基（用购自美国Life Technologies公司的MEM干粉培养基按照其说明书配制），置37℃继续培养。每日观察2次，细胞生长良好，37℃培养4日后收获细胞培养物，冻融3次，收获病毒，并使用PBS将收获的病毒液稀释至病毒滴度为10^6.0TCID₅₀/mL，定批号为20110428。

猪圆环病毒2型（SH株）亚单位抗原的制备：克隆猪圆环病毒2型ORF2基因并引入蜂毒素信号肽基因序列，转入pMD-18T载体，获得包含猪圆环病毒2型ORF2基因的重组载体,转移重组载体转化入含有穿梭载体的大肠杆菌感受态细胞中，获得包含猪圆环病毒2型重组ORF2基因的穿梭载体，再将该穿梭载体转染入昆虫细胞中，获得重组杆状病毒vBac-P2；重组杆状病毒vBac-P2感染昆虫细胞及昆虫细胞的培养,重组杆状病毒vBac-P2表达猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白，收获和纯化猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白,进行制备猪圆环病毒2型重组ORF2蛋白作为PCV2 ORF2蛋白亚单位抗原，最终获得的PCV2 ORF2蛋白亚单位抗原终浓度为45μg/mL，定批号为20110501。

猪流感病毒（ZJS株和WX株）的增殖制备：将SIV H1N1亚型ZJS株和H3N2亚型WX株毒种分别按病毒感染复数(multiplicity of infection,M.O.I.)为0.001的接种量分别接种于长满单层的MDCK（购自ATCC，型号为ATCC CCL-34^TM）细胞上，37℃吸附30分钟，加入含有3%体积比的犊牛血清和2mM D-氨基葡萄糖盐酸的D-MEM液体培养基（用购自美国Life Technologies公司的D-MEM干粉培养基按照其说明书配制），置37℃继续培养，每日观察2次，细胞生长良好，72h收获细胞培养物，冻融3次，收获病毒，并使用PBS将SIV H1N1亚型ZJS株病毒液稀释至病毒滴度为10^7.0EID₅₀/mL，定批号为20110502，同样，使用PBS将SIV H3N2亚型WX株病毒液稀释至病毒滴度为10^7.0EID₅₀/mL，定批号20110503。

猪流感病毒（ZJS株和WX株）亚单位抗原的制备：分别将SIV H1N1亚型ZJS株和H3N2亚型WX株的HA基因分别克隆入杆状病毒基因组中（按照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统试剂盒操作说明书进行，Life Technologies公司，货号：10359016），并使其处在多角体基因的控制下，通过将杆状病毒感染昆虫细胞（Sf9细胞来源）表达SIV（H1N1亚型ZJS株和H3N2亚型WX株）的HA基因，其中H1N1亚型ZJS株的HA基因序列为Seq NO.2，H3N2亚型WX株的HA基因序列为Seq NO.3。构建的重组病毒分别命名为VBac-ZJS和VBac-WX，将构建的重组病毒分别以M.O.I.为0.01感染昆虫细胞，在感染后5天收获细胞培养液及细胞，反复冻融3次后，12000rpm离心，取上清，使用PBS将重组蛋白浓度稀释为含血凝价为11Log2的抗原蛋白液，置-20℃以下保存，其中SIV H1N1亚型HA蛋白抗原定批号为20110520和H3N2定抗原批号为20110522。

实施例3：病毒液或菌液的处理、灭活。

猪圆环病毒2型（SH株）病毒液的处理：将实施例2制备的批号为20110428病毒液用中空纤维（0.5μm~2μm）滤柱（购自GE Healthcare Life Sciences）过滤，除去细胞碎片，再加入0.2%～0.3%病毒液体积的甲醛溶液37℃灭活18h。得到猪圆环病毒2型全病毒抗原，抗原含量为灭活前病毒滴度为10^6.0TCID₅₀/ml，定批号为20110506。

猪流感病毒液的处理：将实施例2中的批号为20110502的H1N1亚型SIV抗原液用中空纤维（0.5μm~2μm）滤柱（购自GE Healthcare Life Sciences）过滤，除去细胞碎片，再加入0.2%～0.3%的甲醛溶液37℃灭活18h，定批号为20110512；将实施例2中的批号为20110503的H3N2亚型SIV抗原液用中空纤维（0.5μm~2μm）滤柱（购自GE Healthcare Life Sciences）过滤，除去细胞碎片，再加入0.2%～0.3%的甲醛溶液37℃灭活18h，定批号为20110513。

实施例4：PCV2、SIV（H1N1型和H3N2型）二联疫苗的制备。

按实施例2和实施例3制备PCV2灭活全病毒抗原和亚单位抗原及猪流感（H1N1型和H3N2型）的灭活全病毒抗原和亚单位抗原，按下表（表1）中的配方制备疫苗。

表1.疫苗的制备

表1中所述的PCV2-V是指PCV2的全病毒灭活抗原;PCV2-S是指PCV2的Cap蛋白亚单位抗原；H1N1-V是指H1N1的全病毒灭活抗原；H1N1-S是指H1N1的HA亚单位抗原；H3N2-V是指H3N2的全病毒灭活抗原；H3N2-S是指H3N2的HA的亚单位抗原;MG是指佐剂Montanide Gel。

将各种病毒液及亚单位抗原按表1中所述比例依次将抗原、PBS和Montanide Gel放入容器，然后用IKA数显欧洲之星搅拌器（500～800r/min）搅拌混匀5～10min即成。

安全性检验：将上述疫苗组V1-V20分别进行2.5倍剂量注射28日龄仔猪，注射后，体温未见有明显升高，其它体征均符合疫苗安全性试验要求。

实施例5：PCV2抗原、SIV抗原疫苗组合物对PCV2的攻击保护效果。

本实施例目的在于验证实施例4中所制备的二联灭活疫苗是否能够对PCV2的攻击进行保护。

（1）将实施例4中配制的疫苗V1-V16组进行效力试验，使用28日龄PCV2和SIV H1N1亚型和H3N2亚型抗体阴性仔猪190头，分为19组，即第1-19组，每组10头；

（2）第1-17组分别免疫V1-V17组疫苗，每组每头猪分别颈部肌肉相应的疫苗2ml，免疫后14d再次接种2ml；第18组作为攻毒对照组，第19组作为空白对照组。在首次免疫后35d，第1-18组均用PCV2SH株（含10^6.0TCID₅₀/ml）滴鼻1ml、肌肉注射2ml，攻毒后第4、7日，每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5μl/ml），每个点接种1ml（4ml/头），同时腹腔接种巯基乙酸培养基（Thio），10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、组织损伤和免疫组织化学（IHC）检测PCV2病毒抗原结果进行判定，当免疫猪攻毒后体温连续两天升高超过40.5℃，同时肺部病变大于5%、淋巴结病变和IHC检测中超过两项为阳性的猪的头数不超过两头，判定该疫苗能够保护免疫猪抵抗PCV2的感染。

结果：PCV2攻毒保护结果统计如下表（表2）：

表2.PCV2、SIV二联灭活疫苗免疫后对PCV2攻击保护的结果统计

注：CC为攻毒对照组；BC为空白对照组。

由以上结果分析可以得到结论：

（1）V1-V16为PCV2活抗原或PCV2亚单位抗原与SIV的亚单位抗原或灭活抗原的不同组合，即本发明中的PCV2-SIV二联疫苗，如上述表2的结果可见，V1-V16均能够保护免疫猪抵抗PCV2的感染。如上述结果意外地证明了PCV2-SIV的抗原组合，不仅不会产生两种抗原成份的相互免疫干扰或影响，相反地可以提供足够免疫效力。

（2）更令人意外的是，在相同的PCV2抗原含量的前提下（即V1-V3与V17相比，均为PCV2灭活病毒抗原且含量相同）PCV2抗原与SIV抗原组合时免疫猪能提供比单独的PCV2疫苗（V17）免疫时更好的免疫效果。并且，PCV2抗原与SIV的H1N1亚型抗原和H3N2亚型抗原中的至少一种配合制备的灭活疫苗（如V1、V2组）即能够抵抗PCV2的感染。

（2）最令人意外的是，当降低某个抗原至原来的1/2的量时，PCV2、SIV二联灭活疫苗（如V4）的免疫保护效果比PCV2单苗（V17）的效果要好，而且抗原量减半后的二联灭活疫苗（V4）与抗原减半的PCV2单苗（V19）相比，效果明显更佳。以上结果证明了SIV抗原可以提高了PCV2抗原的免疫效果，两种抗原的组合物对PCV2免疫起到了协同作用，同时由于佐剂品种和量均相同，显然这种协同作用是由两种抗原在一起引起的，而在本申请之前人们一直未能认识到上述结果。

实施例6：PCV2、SIV二联疫苗对SIV的攻击保护效果。

本实施例目的在于验证实施例4中所制备的疫苗免疫后对SIV的攻击的保护效果。

（1）将实施例4中配制的疫苗V1-V16组进行效力试验，使用28日龄PCV2和SIV H1N1亚型和H3N2亚型抗体阴性仔猪200头，分为20组，即第1-20组，每组10头；

（2）第1-16组分别免疫V1-V16组疫苗，每组每头猪分别颈部肌肉相应的疫苗2ml，免疫后14d再次接种2ml；第17组免疫V18组疫苗，第18组免疫V20组疫苗，第19组作为攻毒对照组，第20组作为空白对照组。在首次免疫后28d，按照表3中分组进行攻毒，攻毒株使用分别使用SIV H1N1（ZJS株，10^6.0EID₅₀/0.1mL）和H3N2（WX株，10^6.0EID₅₀/0.1mL），每毒株通过滴鼻和气管内注射攻毒各1mL，攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据试验猪的肺部损伤面积评分来评价疫苗对接种猪的保护效果。

表3.SIV攻毒分组表

注：CC为攻毒对照组；BC为空白对照组。

SIV攻毒保护结果统计如下表（表4）：

表4.PCV2、SIV二联灭活疫苗免疫后对SIV攻击保护的结果统计

注：CC为攻毒对照组；BC为空白对照组。

由以上结果经分析可以得到结论：

（1）由于猪流感跟圆环病毒引起的发病症状基本相同，而猪流感是条件致病的病毒，当猪发生两者的混合感染时，本领域技术人员很容易造成把两者的混合感染当作猪圆环单独感染来治疗和预防，导致猪流感病毒病没有防治而造成猪的生长性能降低；此外，猪流感和圆环病毒的混合感染也造成猪免疫功能受到影响，极易感染猪瘟、猪蓝耳病等烈性传染病。

在本发明的实施例5、6中，无论PCV2疫苗（SH株全病毒抗原、ORF2抗原）和SIV H1N1疫苗（ZJS株全病毒抗原、HA抗原）的二联苗(V1、V5、V9和V13组)以及PCV2疫苗（SH株全病毒抗原、HA抗原）和SIV H3N2疫苗（WX株全病毒抗原、HA抗原）的二联苗(V2、V6、V10和V14组)，还是PCV2疫苗（SH株全病毒抗原、ORF2抗原）和SIV H1N1疫苗（ZJS株全病毒抗原、HA抗原）、SIV H3N2疫苗（WX株全病毒抗原、HA抗原）的二联苗（V3、V4、V7、V8、V11、V12、V15、V16组）均能够保护免疫猪抵抗PCV2和SIV相应的攻毒毒株的感染，证明PCV2疫苗和SIV疫苗（H1N1亚型、H3N2亚型）的二联疫苗能够同时有效地抵抗PCV2和SIV病毒，有效解决了把两者的混合感染当做猪圆环单独感染来治疗和预防，从而延误疾病治疗和预防的最佳的时间的技术问题，这是本领域技术人员难以预料到的。

（2）各组疫苗免疫后均能够保护免疫猪抵抗SIV相应的攻毒毒株的感染。更令人意外的是，猪圆环病毒2型（PCV2）与猪流感（SIV）抗原组合（例如V3、V4组）时免疫猪能提供比单独的SIV疫苗（V18、V20）免疫时更好的免疫效果。PCV2与SIV的H1N1亚型和H3N2亚型的其中一种抗原配合制备的灭活疫苗（如V1和V2组）均能够分别抵抗H1N1亚型和H3N2亚型的感染。

（3）PCV2、SIV二联疫苗的效果比SIV单苗的效果要好，证明了是PCV2抗原提高了SIV抗原的免疫效果，两种抗原的组合物对SIV的免疫起到了协同作用（V3疫苗免疫组动物的肺部损伤明显低于V18组和V20组SIV单苗免疫的动物），同时由于佐剂品种和量均相同，显然这种协同作用是由两种抗原在一起引起的。并且，在抗原含量减半时，PCV2、SIV二联灭活疫苗仍能够达到或超过SIV单苗的免疫效果，而这出乎本领域普通技术人员所预料的。

实施例7：PCV2、SIV二联灭活疫苗单针免疫后免疫效果的评价。

本实施例的目的在于评价PCV2、SIV二联灭活疫苗，单次免疫后的效果评价。

（1）按照表5中疫苗组合物各种成分进行配制疫苗V21和V22。

表5.包含卡波姆佐剂疫苗的制备

采用实施例2和实施例3制备的抗原按照表5处方用实施例4的方法配置组合物V21、V22。

（2）使用28日龄PCV2和SIV H1N1亚型和H3N2亚型抗体阴性仔猪50头，分为5组，每组10头；第1组免疫实施例4制备的V17疫苗，每头猪分别颈部肌肉注射2ml；第2组免疫表5配方的V21疫苗，每头猪分别颈部肌肉注射2ml；第3组免疫V22疫苗，每头猪分别颈部肌肉注射2ml；第4组不免疫，做为攻毒对照组，第5组不免疫不攻毒，做为空白对照组。在免疫后第21天进行攻毒，第1-4组均用PCV2SH株（含10^6.0TCID₅₀/ml）滴鼻1ml、肌肉注射2ml，同时，使用SIV H1N1（ZJS株，10^6.0EID₅₀/0.1mL）和SIV H3N2（WX株，10^6.0EID₅₀/0.1mL），每个毒株通过滴鼻和气管内注射攻毒各1mL，攻毒后第4、7日，每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5μl/ml），每个点接种1ml（4ml/头），同时腹腔接种巯基乙酸培养基（Thio），10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据试验猪的肺部损伤评分来评价疫苗对接种猪的保护效果。

表6.PCV2、SIV二联灭活疫苗单针免疫效果评价结果统计

组别	疫苗	动物数量	平均肺部损伤（%）
				1		10	12.6
2	V21	10	1.9
				3	V22	10	2.5
4	CC	10	16.5
				5	BC	10	1.2

注：CC为攻毒对照组；BC为空白对照组。

表7.PCV2、SIV二联灭活疫苗单针免疫后猪体重统计结果

注：CC为攻毒对照组；BC为空白对照组。

表6中结果统计显示，在免疫抗原减半的疫苗组（V22）和免疫抗原未减半的疫苗组（V21）后，猪只均未见明显异常，剖检见该组猪平均肺部损伤仅有1.9%，与空白对照组猪只的平均肺部损伤（1.2%）相比无显著差异，但与攻毒对照组的平均肺部损伤（16.5%）相比差异显著。

表7中结果统计显示，在免疫V21和V22疫苗组的猪只在攻毒后的体重与空白对照组猪只体重差别不明显（P＞0.05），而与攻毒对照组猪只体重相比差异显著。

本实施例结果显示，在单针免疫PCV2、SIV二联灭活疫苗后21天攻毒，令人吃惊的发现，免疫PCV2、SIV二联灭活疫苗组的猪只均能够抵抗PCV2和SIV毒株的攻击；特别是PCV2和SIV抗原组合的二联灭活疫苗在剂量减半后，单针免疫仍能够使免疫猪得到保护，与以往的需要2针以上的注射免疫预防PCV2和SIV感染的相关疫苗相比大大简化了免疫程序，提高了免疫效率。

此外，本实施例结果还表明，在仅免疫PCV2单苗（V17）后的猪只不能够完全抵抗PCV2和SIV毒株的攻击，平均肺部损伤高达12.6%，试验猪只剖杀前的平均体重（22.38Kg）与空白对照组猪只的平均体重（27.85Kg）差异显著。结果表明，PCV2和SIV联合疫苗对解决临床二者混合感染或降低二者感染后继发其它病原感染的几率有重要意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种猪流感病毒血清型H1N1亚型ZJS株，学名为（Swine influenza virus，H1N1 subtype strain ZJS,Orthomyxoviridae,Influenza virus A），保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2012年8月13号，保藏号为CCTCC No.V201233。

2.一种猪流感病毒HA基因，它编码实质上含有序列号5所示的氨基酸序列的多肽。

3.根据权利要求2所述的HA基因，它具有序列号3所示的碱基序列。

4.一种猪流感病毒HA基因编码的多肽，它实质上含有序列号5所示的氨基酸序列。

5.一种猪流感病毒血清型H3N2亚型WX株，学名为（Swine influenza virus，H3N2 subtype strain WX,Orthomyxoviridae,Influenza virus A），保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2012年8月13号，保藏号为CCTCC No.V201234。

6.一种猪流感病毒HA基因，它编码实质上含有序列号6所示的氨基酸序列的多肽。

7.根据权利要求6所述的HA基因，它具有序列号4所示的碱基序列。

8.一种猪流感病毒HA基因编码的多肽，它实质上含有序列号6所示的氨基酸序列。

9.一种预防或治疗猪流感病毒感染的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括H1N1亚型ZJS株全病毒抗原10⁴-10⁸EID₅₀/头份和H3N2亚型WX株全病毒抗原10⁴-10⁸EID₅₀/头份。

10.一种预防或治疗猪流感病毒感染的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括H1N1亚型ZJS株血凝价为7-12Log2的HA抗原和H3N2亚型WX株血凝价为7-12Log2的HA抗原。

11.一种预防或治疗猪圆环病毒2型（PCV2）和猪流感病毒感染的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含至少一种有效剂量的猪圆环病毒2型抗原和至少一种有效剂量的猪流感病毒抗原，所述猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型灭活全病毒抗原、减毒活病毒抗原，所述猪流感病毒抗原为猪流感病毒血清型H1N1亚型抗原、减毒活病毒抗原和/或猪流感病毒血清型H3N2亚型灭活全病毒抗原、减毒活病毒抗原。

12.根据权利要求11所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型抗原为10³-10⁷TCID₅₀/头份的灭活全病毒PCV2SH株，保藏号为CGMCC No.23890；所述的猪流感病毒ZJS株灭活全菌抗原为10⁴-10⁸EID₅₀/头份，所述的猪流感病毒WX株灭活全菌抗原为10⁴-10⁸EID₅₀/头份。

13.一种预防或治疗猪圆环病毒2型（PCV2）和猪流感病毒感染的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含至少一种有效剂量的猪圆环病毒2型抗原和至少一种有效剂量的猪流感病毒抗原，所述的猪圆环病毒2型抗原为亚单位抗原、重组活载体和DNA载体的抗原，所述猪流感病毒抗原为猪流感病毒血清型H1N1亚型亚单位抗原、重组活载体和DNA载体的抗原和/或猪流感病毒血清型H3N2亚型亚单位抗原、重组活载体和DNA载体的抗原。

14.根据权利要求13所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型抗原为0.5~50μg/头份的PCV2ORF2蛋白；所述猪流感病毒抗原为血凝价7-12Log2的ZJS株HA抗原和/或血凝价7-12Log2的WX株HA抗原。

15.根据权利要求14所述的疫苗组合物，其特征在于，所述PCV2ORF2蛋白为含有实质上SEQ NO1.核苷酸序列编码的蛋白或编码实质上序列表SEQ NO2.氨基酸序列的蛋白。

16.根据权利要求11～15任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗中还包含其它的猪病原体的附加抗原，所述附加抗原选自：猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的抗原、猪肺炎支原体抗原、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）抗原、猪伪狂犬病毒（PRV）抗原、猪波氏杆菌抗原、猪多杀性巴氏杆菌抗原、副猪嗜血杆菌抗原及它们的组合。

17.根据权利要求11～15任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物还包含兽医学上可接受的佐剂；优选所述佐剂优选自：氢氧化铝、磷酸铝、皂苷如Quil A和QS-21、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、卡波姆、Montanide Gel；所述佐剂更优选自5%～20%的Montanide^TM Gel，所述佐剂最优选为卡波姆的水溶液。

18.一种制备预防或治疗猪圆环病毒2型（PCV2）和猪流感病毒感染的疫苗组合物的方法，所述方法包括将所述PCV2病毒株大量增殖，将所述猪流感病毒ZJS株和WX株大量增殖，分别灭活，加入免疫佐剂，乳化或搅拌均匀制备。

19.根据权利要求9~10任意一项所述的疫苗组合物在预防和治疗猪流感病毒相关疾病中的应用。

20.根据权利要求11-15任意一项所述的疫苗组合物在预防和治疗猪圆环病毒相关疾病和猪流感病毒相关疾病中的应用。