CN104288760A - 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种疫苗组合物,该疫苗组合物包括免疫量的猪圆环病毒2型抗原、免疫量的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪细小病毒抗原以及兽医学上可接受的载体。该疫苗组合物各抗原之间基本无相互干扰现象,甚至还出现一定的免疫协同作用,免疫后应激小,更为安全,免疫效果优于单苗的使用效果,而且避免了多次接种带来的应激反应,简化了繁琐的免疫程序,降低了防疫成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种三联疫苗,属于兽用生物制品领域。
背景技术
猪圆环病毒病或称猪圆环病毒相关性疾病是主要由猪2型圆环病毒(Porcine circoviru2,PCV2)引起的免疫抑制性疾病,表现为断奶后仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、繁殖障碍、仔猪心肌炎、增生性和坏死性肺炎和中枢神经系统疾病等。猪圆环病毒是近几年新出现的一种危害养猪业较为严重的病原,是迄今发现的一种最小的DNA病毒,对外界环境的抵抗力较强,猪群一旦感染猪圆环病毒就很难根除。
猪繁殖与呼吸道综合征,俗称猪蓝耳病,最早于1987年在美国报道,而后迅速蔓延至欧洲及世界各地,我国最早在1996年报道该病存在,随后十几年间在全国各地猪场蔓延,造成大量妊娠母猪流产、产死胎、产木乃伊胎以及仔猪出现呼吸道症状和死亡现象,给我国养猪业构成很大的威胁。目前尚无治疗该病的特效药物,因此接种疫苗成为预防该病的主要措施。
猪细小病毒病由猪细小病毒(PPV)引起的母猪繁殖障碍疾病,特征是孕猪在怀孕早期受到猪细小病毒感染经胎盘或胎儿引起母猪流产,不孕,产死胎、畸形胎及木乃伊胎等。猪细小病在我国污染十分严重,阳性率达90%以上,几乎很难找到一个PPV阴性的猪场。对养猪业造成长期重大的经济损失,严重阻碍了世界养猪业的健康发展。目前PPV尚无有效的药物治疗方法,因此对该病的预防免疫就显的至关重要了。
目前现有技术中预防PCV2,PRRSV和PPV的感染主要依赖于疫苗免疫,尚无特效药物。市售有PCV2灭活疫苗、PPV灭活苗,PRRSV灭活以及活疫苗,但是并无PCV2-PRRSV-PPV三联疫苗”产品生产和销售。该预防方法需要分次免疫,至少需要免疫两针才能防止断奶仔猪多系统综合征和母猪的繁殖障碍性疾病,成本高,操作程序繁琐,使感染的风险加大,引起猪群的应激反应加大,不同疫苗使用还会造成免疫干扰导致部分猪群免疫失败等问题。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明提供了一种含有猪圆环病毒2型、猪蓝耳病病毒和猪细小病毒抗原成分的三联灭活疫苗及其制备方法,该疫苗能有效的防治由此三种病毒混合感染引起的断奶仔猪多系统综合征和母猪繁殖障碍性疾病。该三联疫苗组合物的免疫效果等同于各单苗的效果,三价疫苗之间无免疫干扰,副反应小,血清抗体效价高,免疫期持续长,耗时少,费力少,对猪的影响也小。这样既简化了免疫程序,又降低生产成本、运输成本以及预防成本,实用性强。
本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物包括免疫量的猪圆环病毒2型抗原、免疫量的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪细小病毒抗原以及兽医学上可接受的载体。
本发明所述猪圆环病毒2型抗原是指包含至少一种猪圆环病毒2型抗原形式的任何组合物。所述猪圆环病毒2型抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗PCV2感染的免疫应答。所述猪圆环病毒2型抗原为灭活形式、改良的活的形式或减毒形式的猪圆环病毒2型全病毒抗原,含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒,含有猪圆环病毒2型免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分。
所述猪圆环病毒抗原可以是江苏南农高科猪圆环病毒2型灭活疫苗的SH株、成都天邦和福州大北农猪圆环病毒2型灭活疫苗的DBN-SX07株、哈尔滨维科猪圆环病毒2型灭活疫苗的LG株、武汉科前猪圆环病毒2型灭活疫苗的WH株中的一种或几种。
本发明的猪繁殖与呼吸综合征抗原是指含有至少一种猪繁殖与呼吸综合征抗原形式的任何组合物,所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪繁殖与呼吸综合征感染的免疫应答。优选地,所述的猪繁殖与呼吸综合征抗原为灭活形式、减毒形式的猪繁殖与呼吸综合征全病毒,含有猪繁殖与呼吸综合征免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒,任何其它至少含猪繁殖与呼吸综合征免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他成分。
所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒可以是中国动物预防控制中心研制并由广东大华农动物保健品股份有限公司等生产的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株);南京农业大学研制并由江苏南农高科技股份有限公司等生产的猪繁殖与呼吸综合症活疫苗(R98);中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制并由哈药集团生物疫苗有限公司等生产的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F112株);新疆天康畜牧生物技术股份有限公司研制并生产的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(TJM-F92株)等中的一种或几种。
本发明的猪细小病毒抗原是指含有至少一种猪细小病毒抗原形式的任何组合物,所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪细小病毒感染的免疫应答。优选地,所述的猪细小病毒抗原为灭活形式、减毒形式的猪细小病毒全病毒,含有猪细小病毒免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒,任何其它至少含猪细小病毒免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他成分。
所述的猪细小病毒抗原可以是以下组合物中的任一种抗原,如:辉瑞公司生产的PPV灭活疫苗,武汉中博生物股份有限公司的PPV灭活疫苗CP-99株,中牧实业股份有限公司的PPV灭活疫苗WH-1株,上海科立特农科(集团)有限公司的猪细小病毒油乳剂灭活疫苗。
优选地,所述猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型灭活全病毒抗原,所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活全病毒抗原,所述猪细小病毒抗原为猪细小病毒灭活全病毒抗原。
更优选地,所述猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型SH株灭活全病毒抗原,所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株灭活全病毒抗原,所述猪细小病毒抗原为猪细小病毒HN-2011株灭活全病毒抗原。
PCV2SH株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏,保藏日期:2008年3月4日,保藏号为CGMCC No.2389,公开于中国专利申请CN101240264A。
NVDC-JXA1株,已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏,保藏日期:2007年3月9日,保藏号为CGMCC No.1964,公开于中国专利申请CN101045917A。
HN-2011株,已在中国典型培养物保藏中心进行保藏,保藏日期:2011年6月9日,保藏号为CCTCC No.V201118,保藏地址为中国武汉·武汉大学。
本发明实施例仅用所述的猪圆环病毒2型抗原为PCV2SH株灭活株,所述猪繁殖与呼吸综合征抗原为猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株,所述猪细小病毒抗原为猪细小病毒HN-2011株灭活株,进一步说明本发明的发明目的。
优选地,所述猪圆环病毒2型全病毒抗原含量为5×105.5~107.0TCID50/ml,所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒抗原含量为107.0~109.0TCID50/ml,所述猪细小病毒全病毒抗原含量为106.0~108.0TCID50/ml。
更优选地,所述猪圆环病毒2型全病毒抗原含量为106.5TCID50/ml,所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒抗原含量为108.0TCID50/ml,所述猪细小病毒全病毒抗原含量为107.0TCID50/ml。
优选地,本发明疫苗组合物中,猪圆环病毒SH株灭活前含量为106.0~107.0TCID50/ml,PRRSV NVDC-JXA1株灭活前含量达107.0~109.0TCID50/ml,PPV HN-2011株灭活前含量为106.0~108.0TCID50/ml;更优选地,本发明中猪圆环病毒SH株抗原灭活前含量为106.5TCID50/ml,PRRSV灭活前含量达108.0TCID50/ml,PPVHN-2011株灭活前含量为107.0TCID50/ml。
优选地,所述兽医学上可接受的载体包括佐剂和赋形剂;所述佐剂为ISA206、氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel01、蜂胶、ISA760VG的一种或几种组合物。
其中,免疫佐剂为氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、Gel01(法国SEPPIC)、蜂胶、ISA206(法国SEPPIC)、ISA760VG(法国SEPPIC),优选卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、Gel01(法国SEPPIC)、ISA206(法国SEPPIC)、ISA760VG(法国SEPPIC),更优选Gel01(法国SEPPIC)、ISA206(法国SEPPIC),更优选为ISA206(法国SEPPIC)。
本发明的另一目的在于提供一种制备所述的疫苗组合物的方法,所述方法包括:
1)培养增殖猪圆环病毒2型,灭活;2)培养增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒,灭活;3)培养增殖猪细小病毒,灭活;4)按比例混合所述猪圆环病毒2型全病毒抗原、所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒抗原、所述猪细小病毒全病毒抗原以及佐剂。
优选地,所述猪圆环病毒2型全病毒抗原、所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒抗原、所述猪细小病毒全病毒抗原体积比为1:1:1。
优选地,本发明中所述的制备方法,其中灭活方法为甲醛灭活,本发明的甲醛溶液(以40%体积的含量计),浓度为0.1%-0.2%(V/V)。
本发明的再一目的在于提供所述的疫苗组合物在制备预防和治疗由混合感染引起的断奶仔猪多系统综合征和母猪繁殖障碍疾病的药物中的应用。
本发明所述的猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸道综合征病毒和猪细小病毒三联灭活苗,制备方法简单,疫苗的效价含量高,免疫方便,与现有技术中的分次免疫相比,各抗原之间基本无相互干扰现象,甚至还出现一定的免疫协同作用,免疫后应激小,更为安全,免疫效果优于单苗的使用效果,而且避免了多次接种带来的应激反应,简化了繁琐的免疫程序,降低了防疫成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中分别以PCV2SH株、PRRSV NVDC-JXA1株、PPVHN-2011株说明本发明。
实施例1、猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒和猪细小病毒三联灭活疫苗组合物,猪乙型脑炎病毒和猪细小病毒二联苗的制备和检验
1.毒株的来源
本发明的三联疫苗中所述的PCV2病毒为PCV2SH株,已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏,保藏日期:2008年3月4日,保藏号为CGMCC No2389。
本发明的三联苗所述的PRRSV毒株为NVDC-JXA1株,已在中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏,保藏日期:2007年3月9日,保藏号为CGMCC No1964。
本发明的三联疫苗所述的PPV毒株为HN-2011株,已在中国典型培养物保藏中心进行保藏,保藏日期:2011年6月9日,保藏号为CCTCCNo V201118。
2.疫苗半成品的制备及检验
2.1生产用毒种的制备
2.1.1猪圆环病毒2型SH株的制备:将PCV2SH株毒种用病毒稀释液(即无血清MEM培养基)适当稀释,以0.01MOI(感染复数)接种于长满单层的PK-15细胞培养,37℃吸附30min,加入含4%(v/v)犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液,37℃培养4日,冻融2~3次,收获病毒。
2.1.2猪繁殖与呼吸综合征病毒的制备:将JEV NVDC-JXA1株毒种用病毒稀释液(即无血清MEM培养基)适当稀释,以0.01MOI(感染复数)接种于长满单层的Marc-145细胞培养,37℃吸附1h,加入含4%(v/v)犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液,37℃培养4日,冻融2~3次,收获病毒。
2.1.3猪细小病毒HN-2011株的制备:将PPV HN-2011株毒种用病毒稀释液(即无血清的α-MEM培养基)适当稀释,以0.01MOI(感染复数)接种于长满单层的ST细胞培养,37℃吸附30min,加入含1%(v/v)犊牛血清和2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液,37℃培养4日,冻融2~3次,收获病毒。
2.2病毒液的培养制备
2.2.1猪圆环病毒2型SH株的制备:采用转瓶细胞培养法,将长满单层的PK-15细胞,倒去细胞培养液,将毒种液按0.01MOI的接种量接种于PK-15细胞上,轻轻旋转细胞瓶2周,37℃吸附30min,加入细胞维持液,置37℃旋转(10~12转/小时)培养。每日观察1~2次,细胞生长良好,37℃培养4日收获细胞和细胞液,冻融3次,置-20℃以下保存,应不超过2个月。
2.2.2猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株病毒液的制备:用转瓶细胞培养法。将长满单层的Marc-145细胞,倒去细胞培养液,将毒种液按0.01MOI的接种量接种于BHK细胞上,轻轻旋转细胞瓶2周,37℃吸附30min,加入细胞维持液,置37℃旋转(10~12转/小时)培养。每日观察1~2次,细胞生长良好,37℃培养4日收获细胞和细胞液,冻融3次,置-20℃以下保存,应不超过2个月。
2.2.3猪细小病毒HN-2011株病毒液的制备:用转瓶细胞培养法。将长满单层的ST细胞,倒去细胞培养液,将毒种液按0.01MOI的接种量接种于ST细胞上,轻轻旋转细胞瓶2周,37℃吸附30min,加入细胞维持液,置37℃旋转(10~12转/小时)培养。每日观察1~2次,细胞生长良好,37℃培养4日收获细胞和细胞液,冻融3次,置-20℃以下保存,应不超过2个月。
2.3病毒液的过滤与浓缩
猪圆环病毒2型SH株病毒液、猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株病毒液和猪细小病毒HN-2011株病毒液分别用中空纤维滤柱(孔径10μm与0.45μm)过滤,除去细胞碎片。过滤后用超滤浓缩系统进行浓缩。
2.4病毒含量测定
三种抗原浓缩后含量的测定结果
按常规方法分别测定PCV2SH株、PRRSV NVDC-JXA1株和PPVHN-2011株病毒抗原含量,PCV2SH病毒液含量为108.0TCID50/ml,PRRSV NVDC-JXA1株病毒液的含量为1010.0TCID50/ml,PPVHN-2011株病毒液含量为109.0TCID50/ml。
表1各抗原浓缩后含量
抗原 | 灭活前含量 |
猪圆环病毒2型SH株 | 108.0TCID50/ml |
猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株 | 1010.0TCID50/ml |
猪细小病毒HN-2011株 | 109.0TCID50/ml |
2.5病毒液的灭活
2.5.1猪圆环病毒2型SH株病毒液的灭活:病毒液加入甲醛溶液灭活,使甲醛溶液的终浓度为0.2%(V/V),随即充分摇匀升温,当温度升至37℃时开始计时,保持18小时灭活完毕,期间每6小时振荡混匀一次,置2~8℃保存,应不超过1个月。
2.5.2猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株病毒液的灭活:病毒液加入甲醛溶液灭活,使甲醛溶液的终浓度为0.1%(V/V),随即充分摇匀升温,当温度升至37℃时开始计时,保持24小时灭活完毕,期间每6小时振荡混匀一次,置2~8℃保存,应不超过1个月。
2.5.3猪细小病毒HN-2011株病毒液的灭活:病毒液加入甲醛溶液灭活,使甲醛溶液的终浓度为0.1%(V/V),随即充分摇匀升温,当温度升至37℃时开始计时,保持24小时灭活完毕,期间每6小时振荡混匀一次,置2~8℃保存,应不超过1个月。
2.6病毒液灭活效果检验
病毒液灭活效果检验结果:PCV2SH株无绿色PCV2阳性细胞,PRRSV NVDC-JXA1株无CPE,PPV HN-2011株无CPE。
2.7相关灭活苗的配制
2.7.1佐剂的制备:所用的佐剂为ISA206(法国SEPPIC),经121℃高压灭菌30min后冷却备用。
2.7.2防腐剂的配制:1%(w/v)的硫柳汞水溶液。
2.7.3稀释剂的配制:无菌的PBS缓冲液,pH为7.4。
2.7.4通过无菌操作各成分按下表的比例混合,以300转/分钟搅拌30min即可。
表2疫苗L的配方及含量
表3疫苗M的配方及含量
表4疫苗H的配方及含量
表5疫苗1的配方及含量
表6疫苗2的配方及含量
表7疫苗3的配方及含量
表8疫苗4的配方及含量
2.8性状检验和无菌检验
疫苗应为白色乳状,长时间静置底部有少量沉淀,振荡后呈均匀混悬液,检测结果性状为灰白色乳剂;按《中华人民共和国兽药典》(2005年版)附录169~171页进行,疫苗应无菌生长。无菌检验结果显示无菌生长,符合要求。
2.9安全检验
用28~35日龄PCV2抗体、PRRSV抗体及PPV抗体均为阴性仔猪,颈部注射各种疫苗进行安全检验。各颈部肌肉注射三联灭活疫苗4ml,观察14日,注苗局部无严重反应,且全部健活为合格。结果表明各疫苗均合格,注射部位、全身、脏器均未见异常。
实施例2、本研究是为了评价不同抗原含量PCV2-PRRSV-PPV组合疫苗以及各病毒单苗的免疫效力
1.试验材料
按照实施例1中的方法制备PCV2-PRRSV-PPV三联苗(PCV2抗原含量为106.0TCID50/ml,PRRSV抗原含量为107.0TCID50/ml,PPV抗原含量为106.0TCID50/ml),记为疫苗L;PCV2-PRRSV-PPV三联苗(PCV2抗原含量为106.5TCID50/ml,PRRSV抗原含量为108.0TCID50/ml,PPV抗原含量为107.0TCID50/ml),记为疫苗M;PCV2-PRRSV-PPV三联苗(PCV2抗原含量为107.0TCID50/ml,PRRSV抗原含量为109.0TCID50/ml,PPV抗原含量为108.0TCID50/ml),记为疫苗H;低剂量的PCV2-PRRSV-PPV三联苗(PCV2抗原含量为5×105.5TCID50/ml,PRRSV抗原含量为108.0TCID50/ml,PPV抗原含量为107.0TCID50/ml),记为疫苗1;PCV2灭活疫苗(PCV2抗原含量为106.5TCID50/ml)记为疫苗2;PRRSV灭活疫苗(PRRSV抗原含量为108.0TCID50/ml)记为疫苗3;PPV灭活疫苗(PPV抗原含量为107.0TCID50/ml)记为疫苗4。
表9各疫苗成分及含量
2.动物试验设计
2.1疫苗免疫
选用3~4周龄健康易感仔猪95头,分成19组,每组5头,第1,2,3组每头颈部肌肉注射疫苗L各2ml,第4,5,6组注射疫苗M各2ml,第7,8,9组注射疫苗H各2ml,第10,11,12组注射疫苗1各2ml,第13组注射疫苗2各2ml,第14组注射疫苗3各2ml,第15组注射疫苗4各2ml,两周后按相同途径和剂量进行第2次接种;第16,17,18组非免疫攻毒对照,第19组作空白对照(非免疫、非攻毒),均隔离饲养观察。
2.2PCV2部分:在首免后35d对第1,4,7,10,13和16组仔猪用PCV2SH株(含106.5TCID50/ml)滴鼻1ml、肌肉注射2ml,隔离饲养。攻毒第4、7日,分别在每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA,0.5mg/ml),每个点接种1ml(4ml/头),同时腹腔接种巯基乙酸培养基,10ml/头;攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基,10ml/头。攻毒后连续观察25日,于第25日称重后,采血,扑杀,剖检。根据体温、相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定。攻毒对照组应至少4头发病,免疫组应至少4头保护。
2.3PRRSV部分:在首免后28d对第2,5,8,11,14和17组仔猪侧耳后部肌肉注射PRRSV NVDC-JXA1强毒株3ml(105.0TCID50/ml),每日测体温并观察至21日,根据观察结果进行判定,5头对照猪应全部发病,且至少2头死亡,免疫猪应至少4头健活。
2.4PPV部分:在首免后14d,35d,120d,155d对第3,6,9,12,15和18组仔猪采血,以检测血清PPV的HI抗体效价。
3效力检验结果
3.1PCV2SH株效力检验结果
表10PCV2SH株免疫保护结果
注:病变包括肺实变、淋巴结肿大、肾有坏死点、脾轻度肿大、肠道鼓气等。
体重变化:分别在攻毒前及宰杀时对7组仔猪进行称重,计算各组平均相对日增重,利用统计学软件SPSS17.0进行统计分析,结果表明疫苗免疫组猪相对日增重与空白对照组相似(P=0.5>0.05),但明显高于非免疫攻毒对照组(P=0.015<0.05)。
由病变观察和体重变化结果证明实施例1中试制的疫苗M、疫苗H和疫苗1在免疫35d后对PCV2的攻击保护率达到100%,而疫苗L和疫苗2对PCV2的攻毒保护率为80%。三种不同抗原剂量的疫苗,即疫苗L,疫苗M和疫苗H均能对仔猪产生较好的免疫保护,且抗原含量越大,保护效果越好。当PCV2抗原含量减半,疫苗1的免疫保护仍为100%,这可能与PRRSV和PPV抗原对PCV2抗原的免疫效应所产生的协同作用有关;疫苗M和疫苗H的免疫保护率高于疫苗2,证明含有一定抗原含量的三联疫苗免疫保护效果更优于单苗。
3.2PRRSV效力检验结果
表11PRRSV NVDC-JXA1株免疫保护结果
注:猪繁殖与呼吸综合征发病标准:至少3日体温在41℃以上,或精神、食欲下降,眼结膜炎,咳嗽、喘等呼吸道症状,或大体剖检,肺部出现片状实变。
由表11结果可以证明实施例1中试制的疫苗M、疫苗H和疫苗1在免疫35d后对PRRSV的攻击保护率达到100%,而疫苗L和疫苗3对PRRSV的攻毒保护率为80%。三种不同抗原剂量的疫苗,即疫苗L,疫苗M和疫苗H均能对仔猪产生较好的免疫保护,且抗原含量越大,保护效果越好。而当PCV2抗原含量减半,疫苗1的免疫保护仍为100%,PRRSV抗原的免疫原性未受到干扰,仍具有较好的免疫保护;疫苗M和疫苗H的免疫保护率高于疫苗3,证明含有一定抗原含量的三联疫苗免疫保护效果更优于单苗。
3.3PPV的效力检验结果
表12PPV免疫持续期抗体水平比较结果
表12结果显示各组疫苗在免疫14d检测到抗体水平,在免疫后35d抗体水平达到峰值,在免疫后120d,疫苗M和疫苗H的抗体水平仍维持在较高水平,而其他疫苗组抗体水平降低较明显。由此证明,含有一定抗原含量的三联疫苗PPV抗体水平在免疫后120d仍能维持较高水平,而1/2全PCV2含量的疫苗1,较全含量PCV2疫苗M抗体水平较低,尤其在免疫后120d抗体水平下降较明显,这可能是因为PCV2抗原含量减少,对PPV的协同作用减弱,使其抗体水平有所降低,但在各时间点的抗体水平仍高于疫苗4。
4.小结与讨论
三联灭活疫苗中抗原含量在一定范围内,各抗原抗体水平会随着抗原量的增加而升高,当抗原增加到一定量,抗体的上升趋势不明显甚至停止;PRRSV和PPV抗原对PCV2抗原抗体水平的协同作用最为明显,即在1/2全PCV2含量时,PCV2抗原的免疫保护水平仍能达到全PCV2含量时的水平;当1/2全PCV2含量时,PRRSV的免疫保护水平仍能维持全PCV2含量时PRRSV的免疫力,说明PCV2抗原含量改变对PRRSV免疫不产生干扰,由此证实此三联苗各抗原之间无免疫干扰,且在一定程度上有免疫协同效应。
实施例3、本研究是为了在实验室条件下复制出母猪繁殖障碍性疾病模型
1动物试验设计
选后备母猪28头,分为7组,每组4头。所有母猪均在妊娠35~50天通过肌肉注射途径按照表13所述实验方案接种PCV SH株强毒株、PRRSV NVDC-JXA1强毒株株和PPV HN-2011强毒株病毒液各1ml,期间观察母猪的生理状态,直至分娩。分娩后观察有无流产、死胎、木乃伊胎或胎儿重吸收等繁殖障碍症状。检测死胎内脏器官有无PCV、PRRSV和PPV病毒存在;存活胎采血分离血清,测定PCV、PRRSV和PPV抗体存在情况。
表13母猪繁殖障碍性疾病模型复制的试验方案
2结果与讨论
表14母猪繁殖障碍性疾病模型复制的试验结果
由表14结果可以看出,在第1,2和3组中,当分别以低剂量的PCV和PRRSV病毒液对母猪攻毒时仅有1头母猪出现繁殖障碍,死胎率均为24.3%,而低剂量的PPV则未引起母猪的繁殖障碍,死胎率为6.98%;在第4,5组,低剂量PRRSV和PPV协同低剂量的PCV均使两头母猪出现繁殖障碍,死胎率分别升高至47.6%和55.6%;而当三种病毒以低剂量混合感染时,4头母猪均出现较严重的繁殖障碍,死胎率为81.4%。死胎内脏器官病原检测显示检测到相应的病毒存在,唯独PPV抗原均未检测到,在检测存活胎儿抗体水平时,均检测到相应的抗体存在。
由此本研究在实验室条件下复制出母猪繁殖障碍疾病,当单独接种PCV和PRRSV引起轻微的繁殖障碍;两种病原混合感染(PCV2+PRRSV或PCR2+PPV)时繁殖障碍加重,而当三种病原共同感染时(PCV2+PRRSV+PPV)全部母猪出现繁殖障碍,而在试验过程中,PCV2和PRRSV抗原在各感染模型中均检测到,而PPV抗原并未检测到。
实施例4、本研究是为了评价PCV2-PRRSV-PPV三联组合疫苗在母猪繁殖障碍疾病中的应用功效
1、试验材料
按照实施例1中的方法制备PCV2-PRRSV-PPV三联苗(PCV2抗原含量为106.5TCID50/ml,PRRSV抗原含量为108.0TCID50/ml,PPV抗原含量为107.0TCID50/ml),记为疫苗M;PCV2灭活疫苗(PCV2抗原含量为106.5TCID50/ml)记为疫苗2;PRRSV灭活疫苗(PRRSV抗原含量为108.0TCID50/ml)记为疫苗3;PPV灭活疫苗(PPV抗原含量为107.0TCID50/ml)记为疫苗4。
2、动物试验设计
2.1田间试验某猪场选后备母猪240头,分为3组,每组80头。第1组每头母猪配种前1月颈部肌肉注射疫苗M,14天后第二次免疫,在产前一个月第三次免疫,每次2ml/头;第2组每头母猪在配种前一个月分别颈部肌肉注射猪疫苗2和疫苗3,14天后第二次免疫,在产前一个月第三次免疫,每次各2ml,每头4ml;第3组不进行疫苗免疫,作为空白对照组。在试验过程中,其他的疫苗免疫均按正常程序进行。待生产时观察母猪的流产、产死胎、木乃伊胎情况。在仔猪出生后,称量仔猪的出生重,观察仔猪的生长情况,直至断奶,再称量下断奶后的体重。
该猪场发病史情况:部分母猪出现繁殖障碍疾病,取流产或死产胎儿送往邻近兽医工作站进行病原检测,提示有PCV2和PRRSV病原存在。
3结果与讨论
表15母猪繁殖性能及仔猪生长情况统计
由表15田间试验结果可以看出,使用疫苗M免疫母猪出现死胎数为62,疫苗2和疫苗3联用免疫组出现216头死胎,而对照组则出现272头死胎;疫苗M免疫后备母猪所产的仔猪,健康状况良好,出生时平均体重高于疫苗2和疫苗3免疫组和空白对照组;而在哺乳期仔猪的死亡率疫苗M免疫后死亡率明显降低,由未免疫的26%降到5.9%,断奶后仔猪生长体重也以疫苗M免疫组的效果最佳。
综上所述,猪圆环-蓝耳-细小三联灭活苗免疫母猪,能够降低死胎数,明显降低仔猪死亡率,改善仔猪的生长和健康状况。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已,并非对本发明做任何形式上的限制,虽然本发明已以优选实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案的范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种疫苗组合物,其中,所述疫苗组合物包括免疫量的猪圆环病毒2型抗原、免疫量的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪细小病毒抗原以及兽医学上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型灭活全病毒抗原,所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活全病毒抗原,所述猪细小病毒抗原为猪细小病毒灭活全病毒抗原。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物,其中,所述猪圆环病毒2型抗原为猪圆环病毒2型SH株灭活全病毒抗原,所述猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原为猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株灭活全病毒抗原,所述猪细小病毒抗原为猪细小病毒HN-2011株灭活全病毒抗原。
4.根据权利要求2所述的疫苗组合物,其中,所述猪圆环病毒2型全病毒抗原含量为5×105.5~107.0TCID50/ml,所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒抗原含量为107.0~109.0TCID50/ml,所述猪细小病毒全病毒抗原含量为106.0~108.0TCID50/ml。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物,其中,所述猪圆环病毒2型全病毒抗原含量为106.5TCID50/ml,所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒抗原含量为108.0TCID50/ml,所述猪细小病毒全病毒抗原含量为107.0TCID50/ml。
6.根据权利要求1所述的疫苗组合物,其中,所述兽医学上可接受的载体包括佐剂和赋形剂;所述佐剂为ISA206、氢氧化铝胶、矿物油、卡波姆、Gel01、蜂胶、ISA760VG的一种或几种组合物。
7.一种制备权利要求1所述的疫苗组合物的方法,所述方法包括:
1)培养增殖猪圆环病毒2型,灭活;
2)培养增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒,灭活;
3)培养增殖猪细小病毒,灭活;
4)按比例混合所述猪圆环病毒2型全病毒抗原、所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒抗原、所述猪细小病毒全病毒抗原以及佐剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其中,所述猪圆环病毒2型全病毒抗原、所述猪繁殖与呼吸综合征病毒全病毒抗原、所述猪细小病毒全病毒抗原体积比为1:1:1。
9.根据权利要求1~6所述的疫苗组合物在制备预防和治疗由混合感染引起的断奶仔猪多系统综合征和母猪繁殖障碍疾病的药物中的应用。
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