CN104388396B - 猪伪狂犬病毒毒株及由其制备的灭活疫苗和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株猪伪狂犬病毒毒株及由其制备的灭活疫苗和应用，属于猪伪狂犬病毒毒株的分离和应用领域。本发明首先公开了一株猪伪狂犬病毒PRV‑JL株，其微生物保藏编号是：CGMCC No.9903。本发明还公开了一种应用所述PRV‑JL株制备猪伪狂犬病灭活疫苗的方法，包括：(1)扩增猪伪狂犬病毒PRV‑JL株，收获病毒液；(2)加入灭活剂灭活病毒液，浓缩；(3)制备水相和油相；(4)将水相和油相混合，乳化，即得。动物实验结果表明，本发明PRV‑JL株制备的灭活疫苗安全性高，免疫原性好，免疫保护率高，对新分离变异株强毒株及PRV闽A株强毒均能提供完全保护，能够对目前流行的猪伪狂犬病实现有效防治。

Description

猪伪狂犬病毒毒株及由其制备的灭活疫苗和应用

技术领域

本发明涉及猪伪狂犬病毒毒株，尤其涉及一株性能优异的猪伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus)强毒株，本发明还涉及由所述猪伪狂犬病毒强毒株制备的灭活疫苗及其应用，属于猪伪狂犬病毒毒株的分离和应用领域。

背景技术

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒引起的，往往以爆发流行的方式流行。初生仔猪感染本病毒后死亡率极高，成年猪感染该病毒多呈隐性状态，死亡率较低，但怀孕母猪容易发生流产、弱胎、死和木乃伊胎。健康猪与带毒猪、病猪直接接触可感染本病毒。该病毒的免疫抑制作用可增强受感染成年猪对其他病原的易感性，结果导致受病毒感染猪死亡率增加。近年来，猪伪狂犬发病的季节性不明显，发病率上升，除猪蓝耳病以外，猪伪狂犬病已成为危害母猪繁殖功能的第二大疾病。

预防该病最行之有效的办法是接种疫苗。目前，市售的猪伪狂犬病疫苗绝大多数为猪伪狂犬病的常规弱毒疫苗和灭活疫苗。由于流行毒株不断发生变异，与市售疫苗在免疫原性方面存在差异，导致传统毒株制备的疫苗不能很好的防控当今流行的猪伪狂犬病。因此，亟待开发新的免疫原性好的猪伪狂犬病疫苗，实现对目前流行的猪伪狂犬病的有效防治。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一株分离的猪伪狂犬病毒毒株，采用该毒株制备的灭活疫苗免疫原性好，能够有效防治目前流行的猪伪狂犬病。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一株分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株。

本发明将分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9903；分类命名是：猪伪狂犬病毒；保藏时间是：2014年10月28日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明从吉林某发病猪群母猪死胎的脑组织、扁桃体等组织中分离出一株猪伪狂犬病毒PRV-JL株。将分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株空斑纯化后，测定猪伪狂犬病毒PRV-JL株的病毒含量为10^7.96TCID₅₀/0.1mL。采用PCR方法扩增PRV-JL株的gE基因，结果扩增出一条1740bp的条带，完全符合gE基因的大小。免疫荧光法检测结果表明，分离病毒PRV-JL株感染的盖玻片培养物，在细胞质中存在许多绿色的荧光灶，而未接种分离病毒的阴性对照盖玻片培养物没有特异性荧光出现。病毒PRV-JL株gE基因的进化树分析结果可见，基因进化树分析图中，新分离毒株PRV-JL株位于一个相对独立的分支中。gE基因推导的氨基酸序列比对发现，新分离株PRV-JL株与大多数毒株相比，在54位、448位和512位发生了54位(G-D)、448位(V-I)和512位(G-S)突变，在第48位插入一个D，同时第492-495位的4个D之间也插入一个D，变成了5个连续的D。本发明分离的PRV-JL株是一株猪伪狂犬病毒变异株强毒。

本发明猪伪狂犬病毒PRV-JL株能够应用于制备预防猪伪狂犬病的疫苗或药物。

本发明进一步公开了一种预防猪伪狂犬病的疫苗组合物，包括：免疫上有效量的猪伪狂犬病毒PRV-JL株和药学上可接受的佐剂。

本发明还公开了一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)扩增所述的猪伪狂犬病毒PRV-JL株，收获病毒液；(2)加入灭活剂灭活病毒液，浓缩；(3)制备水相和油相；(4)将水相和油相混合，乳化，即得。

其中，步骤(1)所述扩增为采用Vero细胞培养猪伪狂犬病毒PRV-JL株；优选的，将分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株按病毒维持液量的1％接入形成单层的Vero细胞培养物中；所述培养条件优选为37℃旋转培养。

步骤(2)按照质量g/体积mL计，灭活剂与病毒液的比例为0.02：100；所述灭活剂为二乙烯亚胺溶液；优选的，按照质量g/体积mL计，所述二乙烯亚胺溶液的浓度为2％。所述灭活为在30℃灭活60h；优选的，在30℃、100r/min摇床上灭活60h，然后加入2％硫代硫酸钠溶液，终止灭活。

步骤(2)所述浓缩优选为浓缩5倍。

步骤(3)所述制备水相包括：将吐温-80与浓缩后的灭活病毒液按照体积比4：96混合均匀，得到水相；

所述制备油相包括：将白油、司本-80、硬脂酸铝按照体积比94：6：1.5混合均匀。

步骤(4)将水相和油相按照体积比1：1.5混合均匀。

安全性试验结果表明，本发明制备的猪伪狂犬病灭活苗对家兔和猪安全性好，免疫后全部家兔或猪精神状态良好，饮食正常，注射部位亦未见异常，均健康存活，无猪伪狂犬病典型症状反应。免疫原性试验结果表明，在断奶仔猪免疫攻毒试验中，本发明分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株制备的灭活疫苗保护率为100％，高于市售Bartha-K61株弱毒疫苗的保护率；在妊娠母猪攻毒保护试验中，PRV-JL株灭活疫苗对新分离变异株强毒PRV-JL株及PRV闽A株强毒均能提供完全保护。证明本发明分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株免疫原性好，能够对目前流行的猪伪狂犬病实现有效防治。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“分离的”意指所指代的材料从其天然环境中取出。因此，经分离的生物材料可以不含某些或所有细胞组分，即其中天然材料自然存在的细胞的组分(例如细胞质或膜组分)。如果材料存在于细胞提取物或上清液中，那么它是经分离的。

可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”指这样的药物组合物，其包括在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超过一种上述组分。

术语“佐剂”意指包括一种或多种物质的组合物，所述物质增强疫苗组合物的抗原性。佐剂可以充当缓慢释放抗原的组织储存，并且还充当非特异性增强免疫应答的淋巴样系统激活。通常，在不存在佐剂的情况下，用单独抗原的初次疫苗接种将无法引发体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、矿物质凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质。

术语“免疫有效量”是将引发针对猪伪狂犬病毒的免疫应答的无毒力猪伪狂犬病毒毒株的量。“免疫有效量”将依赖于受体动物的物种、品种、年龄、大小、健康状况等因素。

附图说明

图1为猪伪狂犬病毒PRV-JL株的PCR鉴定结果；其中，M：DNA Maker DL 2000；1：PRV-JL株；2：猪伪狂犬病毒闽A株；3：阴性对照；

图2为猪伪狂犬病毒PRV-JL株感染细胞的免疫荧光法检测结果；其中，A为未接种分离病毒的阴性对照；B为PRV-JL病毒感染细胞；

图3为猪伪狂犬病毒PRV-JL株gE基因的进化树分析；

图4为猪伪狂犬病毒PRV-JL株gE基因推导的氨基酸序列比对结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1猪伪狂犬病毒毒株的分离

1、实验方法

1.1病料采集

病料采自吉林某发病猪群母猪死胎的脑组织、扁桃体等，以1：10加入DMEM，研磨，制备组织悬液，反复冻融3次，12,000rpm离心10min取上清经0.22μm滤器过滤。将滤出液置-80℃冰箱冻结保存。

1.2分离培养

将上述病料按病毒培养液的10％含量接入尚未形成单层的绿猴肾细胞系Vero细胞培养物中，置于37℃感作1h，加入含2％小牛血清的DMEM培养液，37℃培养5日。冻融2次后第二代培养4天，收获培养液，经2次冻融后，收毒；连续传代5代，获得原始毒种。

1.3病毒的基础种子批建立

取原始毒种，按病毒维持液量的1％接入形成单层的Vero细胞培养物中，置37℃培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收毒；连续传代6代，获得病毒的基础种子。

1.4病毒的生产种子批建立

取基础种子，按病毒维持液量的1％接入形成单层的Vero细胞培养物中，置37℃培养，在5％CO₂，37℃条件下培养，每天对细胞病变效应(CPE)进行观察。

2、实验结果

细胞病变效应的观察结果显示：细胞膨大，圆缩，继而开始脱落逐渐形成空斑病灶，并且有“拉网”现象；当细胞病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收毒。连续传代11代，最终获得一株猪伪狂犬病毒毒株，命名为PRV-JL株。

实施例2猪伪狂犬病毒毒株的鉴定

对本发明实施例1分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株进行鉴定。

1、病毒的蚀斑克隆

用维持液将分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株作10倍系列稀释，取其中的10^-5、10^-6、10^-7、10^-8接种24孔细胞板，每个稀释度接种4个孔，100μl/孔。置于37℃温箱孵育1h后，每孔加入1mL的44℃营养琼脂，待营养琼脂凝固后将细胞板翻转，并置于含5％CO₂的细胞培养箱内，逐日观察。培养4d后对每个稀释度上的空斑进行计数，计算空斑形成单位(PFU)，观察空斑形态及大小，挑出小而孤立的空斑，加入0.5mL营养液中，冻融2次，3,000r/min，离心10min，吸取上清，做病毒增殖，测定克隆株病毒的毒价。

结果显示，24孔细胞板中分离的病毒经过4天培养，能产生空斑的最大稀释度为10^-6，在10^-6稀释度的细胞单层上可看到单个存在的可数空斑，直径在2～5mm之间，空斑形态不规则，4个孔内的空斑个数有差异，最多的空斑数为30个，最少的仅有10个。最终PFU为1.6×10⁸/0.1mL。按照Reed-Muench法计算得到克隆毒株的病毒含量为10^7.96TCID₅₀/0.1mL。

2、病毒PCR鉴定

分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株空斑纯化后，采用PCR方法扩增gE基因。

PCR扩增反应体系(50μl体系)：

PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min，上述3步骤进行30个循环；72℃后延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖电泳分析。

结果表明(图1)，PCR扩增出一条1740bp的条带，完全符合gE基因的大小。

3、病毒感染细胞的免疫荧光法检测

取已经纯化的猪伪狂犬病毒PRV-JL株接种于长满单层的猪睾丸(ST)细胞上，37℃培养，当细胞病变达80％时，收毒并冻融2次，将病毒液传第2代，选用第2代病毒培养物，冻融2次，作荧光抗体检查。把经冻融2次的第2代病毒培养物接种于已长满单层的ST细胞盖玻片上，继续培养24h。将盖玻片取出，用PBS冲洗，丙酮固定20min，待自然风干后再用PRV荧光标记抗体于湿盒内染色30min，冲洗，封固，镜检。

通过荧光显微镜观察分离病毒PRV-JL株感染的盖玻片培养物，在细胞质中存在许多绿色的荧光灶，而未接种分离病毒的阴性对照盖玻片培养物没有特异性荧光出现(图2)。

4、分离毒株gE基因的进化树分析

采用PCR方法扩增猪伪狂犬病毒PRV-JL株gE基因，反应体系同上。PCR产物经1％琼脂糖电泳分析，回收目的片段，克隆至载体pMD-18T，测序，进行gE基因的进化树分析。

基因进化树分析图中，新分离毒株PRV-JL株位于一个相对独立的分支中(图3)。

gE基因推导的氨基酸序列比对发现，新分离株PRV-JL株与大多数毒株相比，在54位、448位和512位发生了54位(G-D)、448位(V-I)和512位(G-S)突变，在第48位插入了一个D，同时第492-495位的4个D之间也插入了一个D，变成了5个连续的D(图4)。

本发明将分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9903。

实验例1猪伪狂犬病灭活苗的制备

1、制苗用抗原液的制备

将实施例1分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株按病毒维持液量的1％接入形成单层的Vero细胞培养物中，置37℃旋转培养，当病变达到80％时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收毒。

2、灭活

按病毒液总量的0.02％(g/mL)向病毒液中加入2％(g/mL)二乙烯亚胺溶液，充分振荡后，于30℃、100r/min摇床上灭活60h，然后加入2％硫代硫酸钠溶液，终止灭活，并作无菌检验。

3、浓缩

取灭活后的病毒液，经4,000r/min水平离心，然后以0.2um滤膜滤器过滤；微滤后的病毒液以100KD滤膜滤器超滤浓缩5倍。

4、油佐剂灭活疫苗的配制

按照注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸铝1.5份的体积比配制油相；按照96ml抗原加入4ml吐温-80的比例配制水相；水相和油相按照体积比1：1.5比例混合，进行乳化，制成油包水单相苗。

实验例2猪伪狂犬病灭活苗的安全性试验

检测本发明实验例1制备的猪伪狂犬病灭活苗的安全性。

1、疫苗对家兔的安全性检测

用体重1.5～2.0kg健康家兔6只，于其臀部皮下注射疫苗，5.0mL/只，连续观察15d。

结果表明，全部家兔精神状态良好，饮食正常，注射部位亦未见异常，均健康存活。

2、疫苗对猪的安全性检测

用猪伪狂犬病毒中和抗体阴性猪6头，于其颈部肌肉注射疫苗，10mL/头，观察21d。

结果表明，全部免疫猪饮食正常，精神状态良好，无猪伪狂犬病典型症状反应。

以上检测结果说明，本发明用分离的猪伪狂犬病毒PRV-JL株制备的猪伪狂犬病灭活疫苗，其物理性状合格，无细菌污染，对动物的安全性合格。

实验例3猪伪狂犬病毒灭活苗的免疫原性试验

1、断奶仔猪免疫攻毒试验

选取15头猪伪狂犬病毒中和抗体阴性断奶仔猪，随机分成3组，每组5头，第一组免疫实验例1制备的PRV-JL株灭活疫苗，2mL/头；第二组免疫市售Bartha-K61株弱毒疫苗，2mL/头；第三组注射生理盐水，2mL/头。于免疫后28日采血，分离血清，进行中和指数测定。并用伪狂犬强毒闽A株(农业部兽药规程中用于检验疫苗免疫效率用毒株，购于农业部中国兽医药品监察所)对所有猪进行攻毒，其中滴鼻3ml，肌肉注射3ml，于免疫后49日进行采血。观察实验猪发病情况。

结果表明，攻毒后5头空白对照猪和3头Bartha-K61株弱毒疫苗实验猪出现发热(＞41℃)，精神沉郁，咳嗽，呼吸困难，神经症状与死亡等临床表现，而PRV-JL株灭活疫苗免疫组实验猪精神状态良好，未见任何异常现象，攻毒保护率达100％(表1)。

表1断奶仔猪免疫攻毒试验结果

2、妊娠母猪攻毒保护试验

取初产母猪12头(PRV gE抗体阴性)，随机分成3组，每组4头。于配种前进行疫苗免疫。第一组免疫实验例1制备的PRV-JL株灭活疫苗，2mL/头；第二组免疫Bartha-K61株弱毒疫苗，2mL/头；第三组注射生理盐水，2mL/头。怀孕后60天时，将每组的4头母猪进行随机分为A、B两组，A组采用PRV-JL株细胞毒攻毒，滴鼻3ml/头，肌肉注射3ml/头；B组采用PRV闽A株攻毒，滴鼻3ml/头，肌肉注射3ml/头。隔离饲养，观察母猪健康和产仔情况，对死亡胎儿进行荧光检测及病毒分离。

结果表明(表2)，母猪接种灭活疫苗后，精神状态良好，没有异常反应。产仔情况如下：1A组产仔25/25(健康数/总数)，1B组产仔26/26；2A组产仔10/24，2B组产仔12/23；3A组产仔0/20，3B组产仔0/23。第二组和第三组均有大量木乃伊胎产出。对死亡胎儿进行病毒分离及免疫荧光检测，结果均为阳性。由此可以证实，用PRV-JL株制备的灭活疫苗对新分离变异株强毒PRV-JL株及PRV闽A株强毒均能提供完全保护，而Bartha-K61株弱毒疫苗对变异株强毒PRV-JL株及PRV闽A株强毒不能提供完全保护。

表2妊娠母猪攻毒保护试验结果

*分子为健康胎数，分母为产下总胎数。

Claims (11)

1.一株分离的猪伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus)PRV-JL株，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCC No.9903。

2.权利要求1所述猪伪狂犬病毒PRV-JL株在制备预防猪伪狂犬病疫苗中的应用。

3.一种预防猪伪狂犬病的疫苗组合物，其特征在于，包括：免疫上有效量的权利要求1所述猪伪狂犬病毒PRV-JL株和药学上可接受的佐剂。

4.一种猪伪狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)扩增权利要求1所述的猪伪狂犬病毒PRV-JL株，收获病毒液；(2)加入灭活剂灭活病毒液，浓缩；(3)制备水相和油相；(4)将水相和油相混合，乳化，即得。

5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述扩增为采用Vero细胞培养猪伪狂犬病毒PRV-JL株。

6.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)按照质量g/体积mL计，灭活剂与病毒液的比例为0.02：100；所述灭活剂为二乙烯亚胺溶液。

7.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于：按照质量g/体积mL计，所述二乙烯亚胺溶液的浓度为2％。

8.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述浓缩为浓缩5倍。

9.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：

步骤(3)所述制备水相包括：将吐温-80与浓缩后的灭活病毒液按照体积比4：96混合均匀；

所述制备油相包括：将白油、司本-80、硬脂酸铝按照体积比94：6：1.5混合均匀。

10.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)将水相和油相按照体积比1：1.5混合均匀。

11.权利要求4至10任何一项所述制备方法制备得到的猪伪狂犬病灭活疫苗。