CN100354414C - 一种伪狂犬病gEˉ/gIˉ基因缺失毒株、含有该毒株的灭活疫苗及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组的伪狂犬病毒Pseudorabies virus，PrV)基因工程株WKQ-001，保藏号为CCTCC-V200511的构建以及利用该毒株制备的伪狂犬病毒基因缺失标志灭活疫苗。本发明的毒株缺失了PrV的糖蛋白基因gI、gE，因而可以作为标志基因，用于鉴别和诊断人工免疫猪及自然感染猪。本发明还涉及重组伪狂犬病毒株和基因缺失灭活疫苗的应用。与国外同类疫苗相比，其针对性更强，更加适合我国伪狂犬病的流行猪群；本发明的毒株来源于感染的猪，其灭活疫苗的安全性和保护性更适合于猪伪狂犬病的预防。同时本发明的基因工程株不含任何外源基因，因而具有更高的生物安全性。

Description

一种伪狂犬病gEˉ/gIˉ基因缺失毒株、含有该毒株的灭活疫苗及应用

技术领域

本发明属于动物病毒学技术领域，与基因工程有关。本发明具体涉及一种重组的伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PrV)突变株(毒株编号：WKQ-001)的构建以及利用该重组的毒株制备伪狂犬病基因缺失标志灭活疫苗，本发明的毒株缺失了PrV的糖蛋白基因gI、gE，导致PrV毒力下降，因而可以用于制备伪狂犬病安全疫苗。

本发明还涉及所述的重组伪狂犬病毒株和基因缺失灭活疫苗的应用。

背景技术

伪狂犬病病毒(PrV)属疱疹病毒科a疱疹病毒亚科，具有在细胞培养物上快速生长，强烈的神经嗜性与潜伏感染性等特性(Roizmorn B，Desrosiers R，Flecbenstein B，Lopez C，Minson Ad and studdertMJ.The family Herpesviridae；an update.Arch Virol.1992，123：425-449)。该病毒在自然条件下能感染猪、牛、羊、犬、猫、兔、鼠、野猪、貂、熊、狐等动物。除猪以外，其他动物感染伪狂犬病毒后，具有发热、奇痒和急性脑脊髓炎等典型症状，均为致死性感染。该病在猪呈爆发流行。猪是该病毒的储藏者和传染源，主要表现为母猪的繁殖障碍和仔猪大量死亡，其中15日龄以内仔猪死亡率高达100％。伪狂犬病给养猪业造成巨大的经济损失。

在伪狂犬病疫苗研究和应用方面，目前主要包括弱毒疫苗和灭活疫苗两种。弱毒疫苗由于该病毒的潜伏感染特性，因此存在着不安全和散毒问题。一般认为，灭活疫苗的安全性要高于弱毒疫苗，但其效力要差一些。随着基因工程技术的发展，人们研制出了一些针对伪狂犬病防制的基因缺失疫苗，即利用基因工程方法插入或删除PrV基因组的一段序列，使某些基因不表达，达到致弱PrV而又不影响其免疫原性的目的。此外，基因缺失疫苗还可以降低免疫猪攻毒后的排毒能力，其自身的潜伏感染能力也大大下降。这些人工改造的基因缺失疫苗不仅在安全方面更为可靠，而且还有利于建立鉴别诊断方法。二者相结合，不但可预防伪狂犬病，而且能够区分出自然感染猪群与免疫猪群，通过逐渐淘汰自然感染猪，建立健康猪群，以致最终达到根除伪狂犬病的目的。

猪伪狂犬病根除的难点在于伪狂犬病毒的长期潜伏性以及病毒的免疫逃避而造成的免疫失败。研究表明，伪狂犬病糖蛋白基因gE是造成伪狂犬病毒潜伏和免疫逃避的主要因素。糖蛋白gE是至今发现的所有PRV毒株(某些疫苗株除外)均能表达的蛋白，具有群特异性，在PRV的鉴别诊断中具有重要意义。因此，通过接种伪狂犬病毒gE基因缺失灭活疫苗来预防和控制伪狂犬病，已成为国际上普遍接受和流行的方法。

在伪狂犬病毒gE基因缺失疫苗的研制方面，华中农业大学于2003年研制出一种伪狂犬病毒TK^-/gE^-/gI^-基因缺失标志活疫苗，该疫苗具有较好的免疫效果，所述的伪狂犬病毒株缺失了TK^-/gE^-/gI^-基因，不含外源基因，属于一种用基因工程构建的活疫苗(参见中国发明专利公开说明书，专利申请号03156706.1)；四川农业大学报道了一种伪狂犬病TK^-/gE^-/gI^-/LacZ⁺基因缺失标志致弱活疫苗，该毒株缺失TK^-/gE^-/gI^-基因，但包含外源基因LacZ的表达盒(参见，郭万柱等，伪狂犬病基因缺失疫苗株(SA215)某些生物学特性研究，中国预防兽医学报，2000年9期)；中国农业科学院哈尔滨兽医研究所构建完成了gE/TK基因缺失突变株，该突变株含有外源基因LacZ的表达盒(参见田志军等，伪狂犬病病毒gE/TK基因缺失突变株的构建，中国预防兽医学报，2004年5期)；南京农业大学报道了一种伪狂犬病病毒上海株(PRV-SH)/gE^-/gI/GFP⁺缺失株(参见姜焱等，伪狂犬病病毒上海株(PRV-SH)/gE^-/gI^-/GFP⁺缺失株的构建)微生物学报，2003(2)：15-20)，该缺失株含有外源基因绿荧光蛋白GFP的表达盒。通常来说，把外源基因引入突变株，对于该突变株的筛选来说无疑是一条捷径，因为这样可以大大提高筛选的效率。有专家强调指出，LacZ，LUC等报告基因属外来基因，在生物体内有可能影响其生物学特性，而对生物体产生一些负面的影响；再者，用于生物体的生物制剂是不允许随便带人外来基因的，因而这些插入报告基因的基因缺失疫苗一般只能用来作为研究伪狂犬病的潜伏感染及其体内增殖的动力学的一种手段，不能作为商品进人市场(金升藻等，伪狂犬病基因缺失疫苗研究进展，中国农业科学，2002，35(1)：89-93)。因此上述三种基因缺失疫苗由于存在上面所提到的缺陷，一旦进入市场可能存在生物安全问题。本申请人曾经研制一种缺失了TK/gE/gI基因的伪狂犬病基因疫苗(参见中国发明专利申请公开说明书，专利申请号03156706.1)具有较好的免疫效果且不含外源基因，是对现有疫苗的一大贡献，但作为致弱的活疫苗依然可能存在着返强的危险。因此研制一种免疫效果好，又安全的伪狂犬病毒基因缺失灭活疫苗是当前生产上急需解决的问题。

发明内容

本发明的任务在于克服现有技术存在的缺陷，通过基因重组方法获得一株重组的伪狂犬病基因工程毒株，利用该毒株制备一种防制效果好和安全性高的伪狂犬病gE、gI基因缺失标志灭活疫苗。

基于上述发明的思想，本发明还包括一种缺失gE、gI基因的伪狂犬病毒基因工程毒株、含有该毒株制备的灭活疫苗及其应用。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明实施的关键，是本申请人通过基因重组技术得到一株重组的伪狂犬病毒Pseudorabies virus毒株，该毒株的编号为WKQ-001，该毒株已于2005年9月2日，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC-V200511。

本发明重组的伪狂犬病毒毒株，该毒株具有以下显著特征：

1)该重组毒株缺失了gE、gI基因；

2)该重组毒株不含外源基因。

本申请人利用该保藏的伪狂犬病毒Pseudorabies virus毒株WKQ-001，CCTCC-V200511制备一种伪狂犬病毒缺失疫苗。

所述的基因缺失疫苗是灭活疫苗，它是按照以下配比制备的：

按份数计：

A、水相3份

每一份水相按96份用权利要求1或2所述的伪狂犬病毒株制备的灭活的伪狂犬病毒液加4份灭菌吐温80配制；

B、油相6份

每一份油相按以毫升计的94份10号兽用白油，加入以克计的2份硬脂酸铝和以毫升计的6份司本-80比例配制，和

C、混合上述A和B所述的水相和油相，即得到所述的灭活疫苗。

更详细的技术方案如以下所示：

用于本发明基因重组的来源毒株是伪狂犬病毒毒株Ea株(参见陈焕春等，猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定，畜牧兽医学报，1998，29(2)，972104)作为亲本株，将PrV的糖蛋白基因gI、gE编码区部分缺失，从而得到缺失突变株，该突变株保藏在CCTCC，保藏号为：CCTCC-V200511。

制备伪狂犬病毒基因缺失标志灭活疫苗的具体步骤是：

1)重组狂犬病毒的毒株的制备：用中间转移质粒pIESE(该质粒已于2005年9月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M205101)，与伪狂犬病毒Ea株(简称PrV Ea，下同)基因组DNA共转染猪肾传代细胞IBRS-2，出现病变后，收毒。经过PCR筛选和空斑筛选获得到PrV gE^-/gI^-突变株，该毒株的编号为WKQ-001，属于一种伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)毒株，于2005年9月2日，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC-V200511。

2)伪狂犬病毒基因缺失标志灭活疫苗的制备：用步骤1)得到的伪狂犬病毒毒株(保藏编号CCTCC-V200511)生产的病毒液加入甲醛溶液充分混匀后，置37℃作用36小时，然后放室温(25℃左右)继续作用12小时即成制苗用抗原。按体积份数计：取3份水相(每一份水相按94份灭活的重组的伪狂犬病毒液中加4份灭菌吐温80制备：6份油相(每一份油相用中国浙江省杭州市炼油厂生产的10号兽用白油94份，加入硬脂酸铝2份(以克为单位计)以及6份司本-80配制而成。

本发明的有益效果是：

(1)本发明的重组伪狂犬病毒株来源于申请人首先从国内自主分离和克隆的伪狂犬病毒株，与国外同类毒株及其产品相比，其应用效果更加适合我国感染和预防感染伪狂犬病的流行猪群，因而其防制的针对性更强；

(2)本发明的重组伪狂犬病毒株来源于感染的猪，与现有技术报道的分离于其他动物的伪狂犬病毒株相比，本发明制备的伪狂犬病基因缺失标志灭活疫苗的安全性和保护性更适合于猪伪狂犬病的预防，有利于我国猪场伪狂犬病的净化处理。

(3)本发明的重组伪狂犬病毒株不含任何外源基因，与现有技术报道的同类伪狂犬病毒基因疫苗所含LacZ等标记基因的伪狂犬病基因疫苗相比，具有更高的生物安全性。

附图说明

图1，显示了pIESE质粒构建流程图，质粒pIESE为含有PRV Ea株部分gE基因和gI基因的转移质粒。

图2，显示了伪狂犬病病毒gE、gI双基因缺失转移载体pIESE鉴定的电泳图谱。图中1：15000Marker；2：Stu I和BstE II双酶切质粒pIESE。经Stu I+BstE II双酶切，产生一条6200bp大小的片段，而不是1247bp和6200bp两条电泳条带。图2显示了这两个酶切位点已经消除。

图3，显示了重组病毒PrV gE^-/gI^-构建流程。

图4，显示了重组病毒PrV gE^-/gI^-PCR鉴定的电泳图谱，图中，1-18为gE^-/gI^-重组病毒；19为水对照；20为细胞对照；21为pIESE阳性质粒对照；22为PRV EA株基因组对照。

由图4可知，本发明重组伪狂犬病毒能扩增出大小约1400bp的gE^-/gI^-片段，而传统分离的伪狂犬病Ea株(PRV EA株)和阴性对照均不能扩出此片段，证明该PrV基因组DNA中gE、gI基因已经缺失。

图5，显示了重组病毒PrV gE^-/gI^-的遗传稳定性电泳图谱，图中，1-5为第五代重组病毒的PCR扩增产物；6-10为第十代重组病毒的PCR扩增产物；11-15为第十五代重组病毒的PCR扩增产物；16为水对照；17为细胞对照；18为pIESE阳性质粒对照。

图6，显示了重组病毒的间接免疫荧光鉴定图片结果，图中1为gE^-/gI^-突变株；2为细胞对照；3为传统的PRV Ea株。由间接免疫荧光结果可知：由于缺失了gE-基因，本发明伪狂犬病突变株(即伪狂犬病重组毒株)无法与gE^-的单抗结合，因此，图中1，2显示为阴性。

图7，显示了重组伪狂犬病毒PrV gE^-/gI^-的蛋白质斑点杂交鉴定图谱，图中1：伪狂犬病毒Ea株亲本病毒株对照；2：PK一15细胞对照；3：重组伪狂犬病毒PrV gE^-/gI^-杂交结果。由蛋白质斑点印迹：gE基因删除后，PrV Ea gE^-/gI^-不能表达gE糖蛋白。

以下结合图表和实施例对本发明作进一步的说明。

具体实施方式

一、引物设计

根据GeneBank已发表的Prv Ea株gI(基因数据库登录号为AF306511)；gE(基因数据库登录号为AF171937)基因序列设计合成一对特异性引物简称为P1、P2，扩增gI、gE双基因缺失后的DNA片段大小为1400bp。

引物序列如下：

P1：5’-TAGACGGGACGCTGCTGTTTCTGGAGG-3’，

P2：5’-CGGTCACGCCATAGTTGGGTCCATTCG-3’

PCR扩增条件如表1所示：

表1本发明的PCR条件和引物

引物	PCR反应条件	PCR反应条件体系
			gE-/gI-	94℃4min，94℃1min51.8℃1min，72℃1.5min35cycles，72℃10min	10×buffer(without Mg2+)5.0μL，Template 5.0μL25mmol/L MgCl2 8.0μL2mmol/LdNTP 3.0μL10mmol/L P1 2.0μL10mmol/L P2 2.0μLTaq 2.0μLDMS0 5.0μLH2O 11μL500mmol/L kcl 6.0μL

二、通用转移载体pIESE的构建

1、质粒pIECMV(含PRV Ea株gD，gI，gE，28k基因部分编码序列，11k完整编码框以及质粒pcDNA3.1的多克隆位点区)由华中农业大学动物病毒实验室方六荣博士构建。其详细制备过程参见中国发明专利申请，申请号：200510012147.3)以限制性内切酶STU I，BSTE II双酶切质粒pIECMV，去除其多克隆位点区，回收剩余片段，用T4 DNA Ligase连接，16℃水浴过夜，转化大肠杆菌DH6。，37℃培养16-20小时，然后挑取单克隆菌落，在常规的LB培养基中培养12小时，提取质粒，经酶切鉴定后，于-20℃保存待用。该质粒保藏在CCTCC，保藏号为CCTCC NO：M205101

2、转移载体序列的测定采用双脱氧末端终止法(参见：分子克隆手册，中国科学出版社)测序及常用DNAclub，DNAsis2.5软件分析。其结果见附图1、附图2所示。

三、伪狂犬病毒Ea株gE基因缺失突变株的构建

1、伪狂犬病毒Ea株基因组的提取：将解毒病变的PK-15细胞转移至500mL离心管中(5000rpm，5min)。弃去培养液，加入PBS(PH7.4)重悬，转入50mL离心管中(5000rpm，5min)，弃上清，以10mL LCM重悬，冰浴15min，加入1mL氟利昂(2500rpm，8min)，取上清。以24000rpm，2小时超速离心，弃上清，加10mLTEN重悬。加入10％SDS 500UL，作用3min，酚仿抽提3次，各10000rpm，10min.无水乙醇沉淀30min，8000rpm，15min，重悬，-20℃保存待用。

2伪狂犬病毒突变株的筛选纯化

1)共转染IBRS-2细胞：利用脂质体介导法(参见invitrogen公司的Lipofectamine^TM 2000操作说明书)，以转移载体pIESE和伪狂犬病毒Ea株基因组共转染IBRS-2细胞，出现病变后，收取细胞液，以100μL接于长成单层的IBRS-2细胞的24孔细胞培养板中，出现病变后，收毒。以200μL制成病毒模板，PCR筛选阳性突变株。

2)伪狂犬病毒突变株突变株的空斑纯化：将检测为阳性的共转染产物反复冻融3次，10^-2～10^-7稀释，分别取400μL接种至生长于6孔细胞培养板的PK-15细胞单层培养物，于37℃吸附1小时，倾去培养液，用无钙镁的PBS洗3次，每孔覆盖低熔点琼脂糖2.5mL，置37℃CO₂培养箱培养，待空斑形成后，以1/10000的中性红溶液染色，37℃感作1小时，将其吸出，然后将6孔细胞培养板在37℃感作2小时，使残留的中性红溶液充分挥发。以毛细玻璃管挑取空斑，接于长满单层细胞的24孔板中，待病变完全后，收毒，-20℃保存。然后取出200μL制成病毒模板，pcr筛选，空斑纯化，如此反复，直至得到100％阳性突变株为止。见附图3、附图4所示。

四、重组伪狂犬病毒株WKQ-001的生物学特性

该突变毒株属疱疹病毒科a疱疹病毒亚科猪疱疹病毒I型，病毒粒子呈圆形成椭圆形外观，分子量的9.5×106道尔顿，其核蕊直径为75nm，衣壳壳粒的长度约12nm，宽9nm；位于细胞核内无囊膜的病毒粒子直径约110-150nm，位于胞浆内带囊膜的成熟病毒粒子的直径约180nm。伪狂犬病毒进入宿主细胞的过程可分为三个阶段，即吸附、膜融合、核衣壳释放等，以增殖方式传代。伪狂犬病毒可在猪肾传代细胞上增殖，常用培养基为含有新生牛血清的DMEM(pH7.0)生长液。该病毒可在4℃短期保存，冷冻干燥后可在-70℃下长期保存而不丧失活性。

表2  重组伪狂犬病毒株WKQ-001对乙醚、氯仿、胰蛋白酶敏感性试验

组别	TCID50(0.1mL)	组别	TCID50(0.1mL)	组别	TCID50(0.1mL)
						乙醚对照	无CPE产生10-8.0	胰蛋白酶对照	10-5.3610-7.96	氯仿对照	10-1.3610-7.76

表2的数据表明了本发明的重组伪狂犬病毒株WKQ-001对乙醚、氯仿以及胰蛋白酶敏感。

表3  重组伪狂犬病毒株WKQ-001对酸碱的抵抗力

pH值	实验组TCID50(0.1mL)	对照组TCID50(0.1mL)
			3.04.05.06.09.010.011.0	无CPE产生10-2.110-7.910-7.610-7.610-4.0无CPE产生	10-5.310-7.710-7.610-7.610-7.610-7.610-7.6

表3表明了本发明的重组伪狂犬病毒株WKQ-001在pH5.0-9.0之间保持稳定。

表4  重组伪狂犬病毒株WKQ-001对56℃耐受性

加热时间(min)	15	20	30	45	对照组
						TCID50(0.1M1)	10-5.1	10-4.0	10-7.8	无CPE产生	无CPE产生

表4显示本发明的重组伪狂犬病毒株WKQ-001在56℃加热，30min被完全灭活。

4、空斑试验表明，重组伪狂犬病毒株WKQ-001在gE及gI缺失后，所形成的空斑小于传统的野毒株伪狂犬病毒Ea株所形成的空斑。重组伪狂犬病毒株WKQ-001接种猪肾传代细胞PK-15，在连续接种15代时，仍可扩出大小约1400bp的gE-/gI-片段，表明该重组伪狂犬病毒株WKQ-001遗传稳定，不会返强。见附图5

5、伪狂犬病病毒Ea株gE^-/gI^-突变株(即WKQ-001)的检测

1)间接免疫荧光检测缺失突变株WKQ-001：用PBS溶液洗长满PK-15细胞的6孔细胞培养板3次，自然风干，以100％的甲醛固定5min(0.5mL/孔)，PBS溶液洗3次，吸干。每孔加入高免血清200uL，37℃，CO₂培养箱培养30min。PBS洗1次，ddH₂O洗5次。加入二抗，200uL/孔。37℃，CO₂培养箱培养30min。。PBS洗3次，加入适量PBS，荧光显微镜观察。见附图6。

2)蛋白质斑点杂交检测缺失突变株WKQ-001收获接种PrV Ea gE^-/gI^-和PrVEa出现CPE的PK-15细胞，-20℃冻融3次，取冻融液3μl滴于硝酸纤维膜膜上，风干后重复滴加二次。以鼠抗gE单克隆抗体为一抗，羊抗鼠HRP-IgG为二抗，经二氨基联苯胺显色。PrV Ea打点后显出深褐色，为阳性；而PrV Ea gE^-/gI^-及PK-15细胞对照为阴性。这表明gE基因删除后，WKQ-001不能表达gE糖蛋白。见附图7。

五、重组伪狂犬病毒灭活疫苗的制备

1、病毒的接种量及培养

将伪狂犬病毒重组毒株WKQ-001接种于37℃旋转培养24-36小时长成的细胞单层，接毒量为生长液的1/10。37℃旋转吸咐1小时，加入适量的DMED培养基(含3％犊牛血清及青链霉素各100u/mL)，置37℃孵育。接种后24-48小时，当细胞病变(CPE)达80％以上时，终止培养。

2、病毒的灭活

将病变的病毒液反复冻融三次后，收取病毒液。经无菌检验，且对PK-15细胞的TCID₅₀≥10^-6/0.1mL的病毒液混合，用甲醛作灭活剂，加入甲醛溶液充分混匀后，甲醛溶液的最终浓度为千分之八。置37℃作用36小时，然后放室温(25℃左右)继续作用12小时即成制苗用抗原。取灭活后的病毒液，接种于PK-15细胞单层3瓶，37℃培养观察7天再盲传二代，应无CPE。

表5  甲醛对PRV灭活效果的检查结果

	PK-15细胞感染滴度
						病毒液批号	Log10 TCID50
灭活前	灭活后	盲传1代	盲传2代	未灭活对照
					20050501200505102005052020050530		6.86.57.06.5	0000	0000	0000	6.86.57.06.5

表5中所列4批病毒悬液灭活后，接种细胞并盲传二代，细胞未出现CPE，TCID₅₀均为0，证明病毒灭活已完全彻底失去复制能力。

3、乳化工艺研究

(1)油相的制备：取10号兽用白油(中国浙江省杭州炼油厂生产)94份(以毫升为单位)，加入硬脂酸铝2份(以克为单位)，边加边搅拌，直到完全透明为止。再加入6份司本-80(以毫升为单位)，充分混匀后，按常规方法(例如121℃下灭菌30分钟)高压蒸气灭菌备用。

(2)水相制备：按体积计，在96份灭活的重组伪狂犬病毒液中加入4份灭菌吐温-80，充分摇动直到吐温-80彻底溶解。

(3)乳化：取6份油相放入胶体磨中，开动机器慢速搅拌，同时徐徐加入3份水相，加完后以8000-10000rpm，乳化2.5分钟，然后加入1份水相，继续搅拌30秒，乳化成乳剂型伪狂犬病毒灭活疫苗。

六、伪狂犬病毒灭活疫苗技术指标的检验

(1)物理性状

外观  本品为乳白色均匀乳剂。

剂型  为油乳剂型取一清洁吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，应呈油滴状，不扩散。

粘度；用出口内径为1.2mm吸管吸取疫苗1mL在25℃左右室温下，令其垂直流出，在8秒钟内应流出0.4mL以上判为合格。

(2)无菌检验按《中国兽药典》附录169-171页进行，应无菌生长。

(3)安全检验接种16-18克左右的小白鼠5只，每只皮下注射0.3mL，观察14天小鼠应健活。按种1.5-2kg健康家兔2只，每只臀部皮下注射5mL，观察14天应健活且无不良反应。

(4)效力检验接种体重10-20kg左右的Prv抗体阴性、健康断奶仔猪4头，各颈部肌肉注射疫苗3mL。于注苗后28天采血，分离血清，按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录315页测定抗体中和指数，免疫猪血清中和指数应≥316。

5甲醛含量测定按《中国兽药典》附录177页进行，应不超过规定量。

表6  本发明的伪狂犬病毒灭活疫苗各项指标检验

检验项目		检验日期	检验结果	判定(S-符合规定，U-不符合规定，I-无结果，NI-未检验)
					1	外观	2005.05.02	均匀乳白色乳剂	S
2	剂型	2005.05.02	呈油滴状不扩散	S
					3	粘度	2005.05.02	接近8秒	S
4	稳定性	2005.05.02	不分层、不破乳	S
					5	无菌检验	2005.05.02-2005.05.04	无细菌生长	S
6	甲醛含量测定	2005.05.03	0.185％	S
					7	安全检验	2005.05.04-2005.05.18	兔2/2健康	S
2005.05.04-2005.05.18	小白鼠5/5健活	S
			8	效力检验(中和抗体指数)			2005.05.04-2005.05.31	316398398512	S

说明：(1)本发明的基因缺失灭活疫苗统一制备成油乳剂(下同)

(2)检测依据：《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》，中国农业科技出版社，二○○一年版

七、疫苗的安全性、免疫效力、保护力、免疫期及保存期试验

(一)本发明的基因缺失疫苗的安全性评价与生物试验

1、小白鼠安全试验

将实验室制备的4批疫苗(20瓶/批，100毫升/瓶)随机每批取3瓶，混合均匀后，接种18克左右的小白鼠10只，每只皮下注射0.3毫升，观察14天。

2、新生仔猪安全试验

将实验室制备的4批疫苗(20瓶/批，100毫升/瓶)随机每批取3瓶，混合均匀后，选择健康1日龄初生仔猪，每批疫苗接种10头猪，各肌肉注射2倍剂量4mL伪狂犬油乳剂疫苗，另设4头留做空白对照，所有的仔猪在注射疫苗前及注苗后一周，每天测量2次体温并观察猪的生长状况、精神、食欲，共观察14天。

3、断奶仔猪安全试验

将实验室制备的4批疫苗(20瓶/批，100毫升/瓶)随机每批取3瓶，混合均匀后，接种30日龄左右健康断奶仔猪4头，每头接种6毫升，按2倍免疫剂量接种，另设4头同龄猪做空白对照观察14天。

4、妊娠母猪安全试验

将实验室制备的4批疫苗(20瓶/批，100毫升/瓶)随机每批取3瓶，混合均匀后，按2倍免疫剂量接种妊娠80天左右的母猪2头，每头肌肉注射10毫升。同时设空白对照2头，相同条件下饲养至产仔。观察疫苗对妊娠母猪繁殖性能产生的影响及新生仔猪发育状况。

其结果如表7所示

表7本发明的基因缺失灭活疫苗的安全检验结果

疫苗批次	注射动物									妊娠80天左右母猪
														18克 小白鼠			断奶仔猪			初生仔猪
	剂量(mL)	只数	观察结果	剂量(mL)	头数	观察结果	剂量(mL)	头数	观察结果														剂量(mL)	头数	观察结果
										母猪	胎儿
												0501051005200530	0.30.30.30.3	10101010	无反应无反应无反应无反应	6666	4444	健康健康健康健康	4444	10101010	健康健康健康健康	10101010			2222	健康健康健康健康	发育正常发育正常发育正常发育正常

小白鼠在接种后均未出现不良反应。1日龄初生仔猪、断奶仔猪加倍剂量接种，精神状态良好，食欲正常，接种部位无肿胀发热等不良反应。同条件下的阴性对照组也无不良反应，加倍剂量注射妊娠80天左右的母猪，均未发生流产，按期正常分娩，不影响母猪妊娠，对母猪繁殖性能不产生影响。所产仔猪发育正常。接种部位无发热肿胀等不良反应，同条件下饲养的2头对照妊娠母猪无异常临床反应。

(二)疫苗的效力检验

1、后备母猪免疫效力试验

将4批疫苗随机每批取3瓶，混合均匀后，未经配种后备母猪4头，颈部肌肉注射制品5毫升，另设4头作为非免疫对照，分别于免疫前、免疫后14、21、28天采血，分高血清作微量中和试验，检测Prv中和抗体指数。

2、妊娠母猪免疫效力试验

将4批疫苗随机每批取3瓶，混合均匀后，选经产母猪4头，于配种前每头肌注2毫升，另设4头为非免疫对照。到妊娠70天以同样方法和剂量加强免疫一次，分别采集免疫前、免疫后28天、56天、80天，加强免疫后14天的血清供检测抗体用。于加强免疫2周后攻毒，每头猪经耳静脉注射10^-7TCID₅₀/0.1mL Prv鄂A株强毒2mL，滴鼻2mL。到预产期前即攻毒后14天将免疫猪及对照猪剖杀，检查每窝胎儿发育状况。

3、断奶仔猪免疫效力试验

将4批疫苗随机每批取3瓶，混合均匀后，将疫苗以3毫升剂量分别注射25日龄健康断奶仔猪各4头，设空白对照4头。14天后攻毒，每头猪经耳静脉注射10^-7TCID₅₀/0.1mL Prv强毒2mL，滴鼻1mL进行攻击，观察21天，计算保护率。

4、初生仔猪免疫效力试验

将4批疫苗随机每批取3瓶，混合均匀后，选用健康1日龄初生仔猪4窝，每窝10头猪，4批疫苗分别注射1窝中的8头仔猪，备注射2mL，留2头做为未免疫对照。于免疫后14天各免疫猪连同对照猪经耳静脉注射10^-6 TCID₅₀/0.1mL Prv鄂A株强毒1mL，滴鼻1mL攻毒，观察21天计算保护率。结果如表8-所示

4.1后备母猪

表8  本发明的灭活疫苗对后备母猪免疫效力试验结果

疫苗批次	免疫剂量(mL)	试验猪数(头)	抗体中和指数
							免疫前(天)	免疫后(天)
			0	14	21	28
							0501051005200530对照	2222	44444	11111	218-316251-398198-380258-3981	398-1000398-1258398-1258398-12581	398-1000398-1258308-1412398-12581

说明：本表的疫苗的批号为20050501-20050530，共4个批次

批号为20050501-20050530 4批疫苗分别免疫后备母猪，免疫14天后，中和抗体指数升至218-398。21-28天时，中和抗体指数最高达1412。

4.2妊娠母猪免疫28天后，试验猪中和抗体指数高者可达1412，免疫后80天，血清中和抗体指数仍可达1000，以相同剂量加强免疫后14天，血清中和抗体指数高者可达到3548。攻毒后14天剖杀时血清中和抗体指数低者可为1258，高者可达3548。4批疫苗免疫16头母猪剖杀统计胎儿数，共取胎151头，健活胎为145头。死胎及弱胎共6头。4头非免疫对照猪共怀胎38头，健活胎仅2头，死胎及弱胎共36头。

表9  本发明的灭活疫苗对妊娠母猪免疫效力试验结果

疫苗批次	免疫剂量	试验猪数	攻毒剂量	中和抗体指数						胎儿数
														免疫前(天)	首免			二免		总计	健胎	死胎	弱胎
				免疫后28天	免疫后55天	免疫后80天	免疫后14天	攻毒后14天	头数	头数	头数	头数
													200505012005051020050520		555	444	444	000	389-1412380-1258316-1122	389-1122398-1000389-1000	389-1000316-1000316-639	1000-35481000-3548398-3548	1258-35481258-35481258-3548	383637	363536	110	101

20050530对照

5

44

44

0

316-1258

389-1000

316-1000

1000-3548

1258-3548

4038

382

131

15

4.3断奶仔猪免疫后14天攻毒，仔猪保护数均为4/4，保护率为100％。在观察期间，免疫猪无任何不良反应，而未免疫对照仔猪在攻毒后2天有3头猪体温升高分别为40℃、41℃、41.8℃。精神沉郁，发抖，呕吐、腹泻。其中1头对照猪有神经症状，表现为运动失调，于攻毒后7天死亡；3头对照猪在观察期间。症状逐渐减轻，最后恢复正常。

表10  本发明的灭活疫苗对断奶仔猪免疫效力试验结果

疫苗批次	免疫剂量(mL)	试验猪数(头)	攻毒剂量(mL)	免疫时间(天)	攻毒保护数(头)	保护率(％)
							20050501200505102005052020050530对照	3333	44444	22222	14141414	4/44/44/44/41/4	10010010010025

4.4初生仔猪于免疫后，14天后攻毒，在攻毒后观察期内，有1头在攻毒后24-72小时，体温升高到40.5℃-41.8℃，其他免疫猪攻毒后均无不良反应。总保护率为90.6％。8头不免疫对照猪于攻毒后24小时．体温升高至40.5℃-42℃，精神不振，发抖，呕吐及腹泻，其中有6头分别在攻毒后36-50小时死亡。死亡猪剖检病变表现为上呼吸道粘膜及扁桃体出血，肺水肿，肾脏有针尖大的出血点，脑膜充血、出血、水肿。另2头对照猪于攻毒后第10天症状减轻，体温有所下降，但在观察期内仍保持40℃左右的微热。

表11  本发明的灭活疫苗对初生仔猪免疫效力试验结果

疫苗批次	免疫剂量(mL)	试验猪数(头)	攻毒剂量(mL)	免疫时间(天)	攻毒保头数(头)	保护率(％)	发病对照(头)
								20050501200505102005052020050530	2222	8888	1111	14141414	7/87/87/87/8	87.587.587.5100	2/22/22/22/2

5母猪免疫后的仔猪母源中和抗体水平的检测

挑取一头配种前注射疫苗2mL。产前一个月加强免疫一次(2mL)，产前2天采血测其中和抗体为1∶16。而产后第一天乳汁中的抗体达到1∶64-128。共产仔11头，挑其中7头仔猪在不同日龄采血，进行了抗体水平的完整检测，其结果见表

表12  本发明的灭活疫苗对母猪免疫后的仔猪母源中和抗体水平的检测

13	1∶11	1∶18.7	1∶11	1∶11	1∶18.7	1∶18.7	1∶22
								21	1∶9.4	1∶11	1∶11	1∶8	1∶8	1∶11	1∶8
30	1∶5.6	1∶9.4	1∶9.4	1∶9.4	1∶5.6	1∶5.6	1∶56
								40	1∶4	1∶4	1∶8	1∶2	1∶4	1∶5	1∶2
50	1∶2	-	1∶4	-	1∶2	-	-
								60	1∶2	-	-	-	-	-	-

根据实验的结果，经疫苗免疫母猪的初乳乳汁抗体水平均高出母猪血清中的抗体水平，因而测得的新生仔猪血清中的抗体水平也较高。但随着日龄的增大，抗体水平下降也较快，到30日龄已经较低了，因此在临床，将仔猪伪狂犬病的免疫定在断奶时进行首免是较为合适的。

(三)、疫苗的免疫期

1猪免疫后14天开始出现抗体，中和抗体指数虽未达到阳性标准316，但与非免疫对照猪只相比已明显上升。免疫后28天时，5批疫苗中和抗体指数均达到398以上，在免疫35-42天达到高峰，以后抗体水平逐渐下降，到180天时抗体水平等于或接近临界值。根据抗体水平消长情况，本疫苗的免疫期作为预防用定为六个月。对妊娠母猪，为了初乳中有高水平的母源抗体来保护新生仔猪，建议临产前一个月加强免疫一次，完全可以保护仔猪到断奶。对育肥用的仔猪断奶时注射一次，直到出栏。对种用的仔猪断奶时注射一次，隔4-6周再加强免疫一次，作为基础免疫，以后每半年免疫一次，具体结果见下表。

表13  种猪初次免疫后的中和抗体的检测

疫苗批号	免疫猪数(头)	血    抗    中    指清    体    和    数							(平均值)
												14天	21天	28天	35天	42天	52天	85天	125天	155天	180天
		0501051005200530对照	44442	1992232512231	3543163163981	4573555013551	954125811228911	15131412125810961	14121122120310961	7588917948911	6303983163981											4073983163161	1991991121991

2种猪二次免疫后抗体水平测定结果

在一次免疫后42天左右时抗体水平达到高峰，因而于42天时进行第二次免疫，免疫后14天抗体水平明显上升，到180天时，抗体水平明显高于一次免疫，而且免疫后抗体持续时间也较长，具体结果见下表。

表14  种猪二次免疫后的中和指数

疫苗批号	免疫猪数(头)	血清抗体中和指数(平均值)
													14天	21天	28天	35天	42天	52天	62天	85天	125天	155天	180天

0501051005200530对照

44442

71627891701978911

68186511681868181

65116238651162381

59955584558455841

52585122541252581

49124309491240791

41414309430943091

31622511316231621

25112511281825111

79489110298911

6206308916301

(四)、疫苗的保存期

疫苗存放在4-8℃保存12个月及18个月；20-25℃保存1个月及3个月，以3mL使用剂量对1月龄断奶仔猪进行免疫，分别在免疫后21天和28天采血，检测其中和抗体水平，均在316-398之间，产生抗体的水平均在正常范围内，并用强毒攻击，猪只全部正常，充分证实在上述保存条件和保存期内，疫苗质量没有变化。因而起草标准定为4-8℃保存12月，20-25℃保存1个月

表15  本发明的灭活疫苗的保存期试验(以断奶仔猪为例)

疫苗批号	保存条件℃	保存时间(月)	试验猪数(头)	中和指数(平均值)
								免疫前1天	免疫后21天	免疫后28天	攻毒后14天
				0501051005200530对照	20-254-820-254-820-254-820-254-820-25	13121513121513121513121513	2222222222222222224					1111111111111111111	3983543463803803633542953723243803314783463803553803631	5014074364266024784894265375016025886164904784675014071	398436407416512467457489537436501575588380467446537436331

如如表15所示，本发明的灭活疫苗在4-8℃保存12个月和在4-8℃保存15个月后，分别免疫动物(例如猪、小白鼠、兔等)，28天时所产生的中和抗体指数差异不显著(P＞0.05)，说明本发明的灭活疫苗在4-8℃可以保存12-15个月；在20-25℃保存1个月和在20-25℃保存3个月后，28天时所产生的中和抗体指数差异显著(0.01＜P≤0.05)。本发明疫苗在20-25℃可保存1个月。

Claims (6)

1、一种重组的伪狂犬病毒Pseudorabies virus毒株WKQ-001，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC-V200511。

2、权利要求1所述的重组的伪狂犬病毒毒株，其特征在于：

1)所说的毒株缺失了gE、gI基因；

2)所说的毒株不含外源基因。

3、包含权利要求1或2所述的重组伪狂犬病毒毒株的基因缺失疫苗。

4、权利要求3所述的基因缺失疫苗，其特征在于，所述的基因缺失疫苗是灭活疫苗。

5、权利要求3或4所述的基因缺失疫苗，按份数计的配比为：

A、水相3份

每一份水相按96份用权利要求1或2所述的伪狂犬病毒株制备的灭活的伪狂犬病毒液加4份灭菌吐温80配制；

B、油相6份

每一份油相按以毫升计的94份10号药用白油，加入以克计的2份硬脂酸铝和以毫升计的6份司本-80比例配制，和

C、混合上述A和B所述的水相和油相。

6、权利要求1或2所述的重组伪狂犬病毒株在制备伪狂犬病毒基因缺失疫苗中的应用。

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