CN109679927A - 猪塞内加谷病毒、猪塞内加谷病毒灭活疫苗的制备方法、猪塞内加谷病毒灭活疫苗和应用 - Google Patents

猪塞内加谷病毒、猪塞内加谷病毒灭活疫苗的制备方法、猪塞内加谷病毒灭活疫苗和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了猪塞内加谷病毒A/ZJ/2015、猪塞内加谷病毒灭活疫苗的制备方法、猪塞内加谷病毒灭活疫苗和应用，属于兽医生物制品技术领域，所述猪塞内加谷病毒的拉丁文为Seneca Valley，保藏编号为CGMCC No.15034。本发明将所述猪塞内加谷病毒经过培养后制备成灭活疫苗用于预防猪塞内加谷病毒病，对1月龄的健康易感猪具有良好的免疫原性，接种后的保护率在90％以上。

Description

猪塞内加谷病毒、猪塞内加谷病毒灭活疫苗的制备方法、猪塞 内加谷病毒灭活疫苗和应用
技术领域
本发明涉及兽医生物制品技术领域，具体涉及猪塞内加谷病毒A/ZJ/2015、猪塞内加谷病毒灭活疫苗的制备方法、猪塞内加谷病毒灭活疫苗和应用。
背景技术
猪塞内加谷病毒病是由猪塞内加谷病毒(SenecaValley virus,SVV)引起的一种猪原发性疱疹病，该病主要引起猪口鼻黏膜及蹄部出现水泡和溃疡。与口蹄疫(FMD)、猪水疱病(SVD)、猪水疱疹(VES)及水疱性口炎(VS)极为相似，临床上很难区分。2008年和2012年，美国、加拿大等部分地区在发病猪群中诊断出SVV。2015年9月，美国中西部多个地区的猪群发生水疱性疫情，感染猪的鼻吻、蹄冠状带部位出现水疱样病变，偶见腹泻症状，病情急促，新生仔猪病死率达30％～70％。经梅岛外来动物疾病实验室(FADDL)病原学鉴别诊断，排除口蹄疫、猪水疱病和水疱性口炎等重要外来动物疫病，最终被确诊为猪塞内加谷病毒感染。同年，我国广东省某猪场出现囊泡病，鼻腔和口腔溃疡，新生仔猪厌食、跛足和急性死亡，FMD、SVD、VS检测结果为阴性，SVV显示为阳性，随后分离出了一株猪塞内加谷病毒毒株(CH-01-2015)，这是中国首次报道有猪感染SVV。而后在福建、河南也检测出SVV感染的存在。
猪塞内加谷病毒作为外来病原，已经在中国散在分布，未来几年可能会呈现蔓延的趋势，虽然猪塞内加谷病毒病不会造成与口蹄疫病毒相同的重大经济损失，但是该病对于新生仔猪也有较高的致死率，其临床症状与口蹄疫、猪水泡病、水泡性口炎等高度相似，给鉴别和区分该病带来了一定的困难，容易引起养殖户的恐慌，造成不必要的经济损失。因此，鉴于我国目前还没有商品化的安全、高效的猪塞内加谷病毒病灭活疫苗，研制开发猪塞内加谷病毒病灭活疫苗则显得极为迫切，对于预防猪塞内加谷病毒的侵入具有重要战略储备意义。
发明内容
本发明的目的在于提供猪塞内加谷病毒A/ZJ/2015、猪塞内加谷病毒灭活疫苗的制备方法、猪塞内加谷病毒灭活疫苗和应用，本发明将所述猪塞内加谷病毒经过培养后制备成灭活疫苗用于预防猪塞内加谷病毒病，对1月龄的健康易感猪具有良好的免疫原性，接种后的保护率在90％以上。
本发明提供了一种猪塞内加谷病毒A/ZJ/2015，所述猪塞内加谷病毒的拉丁文为Seneca Valley，保藏编号为CGMCC No.15034。
本发明提供了一种猪塞内加谷病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)用细胞培养液对PK-15细胞进行培养，当所述PK-15细胞长成单层时，弃去细胞培养液，更换为DMEM营养液后培养48～60h，得到培养物；
所述DMEM营养液中含有权利要求1所述的猪塞内加谷病毒，所述猪塞内加谷病毒的体积浓度为0.1～0.2％；
2)将所述步骤1)得到的培养物进行过滤，调节得到的滤液的pH值为7.6～7.8后，再与二乙烯亚胺混合，将得到的混合物进行灭活，得到灭活病毒液；
所述混合物中二乙烯亚胺的浓度为1.5～2.5mmol/L；
3)将所述步骤2)得到的灭活病毒液与佐剂混合、乳化，得到猪塞内加谷病毒灭活疫苗。
优选的，所述步骤2)过滤使用铜纱网进行，所述铜纱网的孔径为60～80目。
优选的，所述步骤2)调节滤液的pH值使用的试剂为质量浓度为7.5％的碳酸氢钠溶液。
优选的，所述步骤2)灭活的时间为28～32h，所述灭活的温度为29～31℃。
优选的，所述步骤2)佐剂包括蒙太得206。
优选的，所述佐剂与灭活病毒液的质量比为1:1。
优选的，所述步骤3)乳化的时间为30～35min，所述乳化的转速为800～1000rpm。
本发明还提供了一种猪塞内加谷病毒灭活疫苗，由包括上述技术方案所述的制备方法制备得到。
本发明还提供了上述技术方案所述的猪塞内加谷病毒灭活疫苗在制备预防猪塞内加谷病毒病药物中的应用。
本发明将所述猪塞内加谷病毒经过培养后制备成灭活疫苗用于预防猪塞内加谷病毒病。本发明将所述猪塞内加谷病毒在PK-15细胞上进行传代、毒力和免疫原性研究，证实猪塞内加谷病毒的病毒含量、毒力和免疫原性均为最佳，对实验动物和制苗材料具有良好适应性。
猪塞内加谷病毒灭活疫苗对不同品种靶动物(1月龄左右健康易感仔猪和妊娠母猪)安全性良好，妊娠母猪免疫后的体温、产仔均无异常，没有流产、早产、死胎和木乃伊胎等异常现象；对1月龄左右健康易感猪有良好的免疫原性，仔猪接种后保护率可达90％以上，具有良好的保护效果，是一种高效的猪猪塞内加谷病毒灭活疫苗，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为5份阳性样品电泳图，1～5:传代后PCR检测样品；－:阴性对照、空白对照；M:DNAMarkerDL2000；
图2为4株分离毒株与参考毒株VP1基因核苷酸序列同源性；
图3为4株分离毒株与参考毒株VP1基因系统树；
图4为A/ZJ/2015株试验猪发病图片。
保藏说明
猪塞内加谷病毒A/ZJ/2015，拉丁文名称为Seneca Valley，于2018年10月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCCNo.15034。
具体实施方式
本发明提供了猪塞内加谷病毒A/ZJ/2015，所述猪塞内加谷病毒的拉丁文为Seneca Valley，保藏编号为CGMCC No.15034。
本发明还提供了一种猪塞内加谷病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
1)用细胞培养液对PK-15细胞进行培养，当所述PK-15细胞长成单层时，弃去细胞培养液，更换为DMEM营养液后培养48～60h，得到培养物；
所述DMEM营养液中含有权利要求1所述的猪塞内加谷病毒，所述猪塞内加谷病毒的体积浓度为0.1～0.2％；
2)将所述步骤1)得到的培养物进行过滤，调节得到的滤液的pH值为7.6～7.8后，再与二乙烯亚胺混合，将得到的混合物进行灭活，得到灭活病毒液；
所述混合物中二乙烯亚胺的浓度为1.5～2.5mmol/L；
3)将所述步骤2)得到的灭活病毒液与佐剂混合、乳化，得到猪塞内加谷病毒灭活疫苗。
本发明用细胞培养液对PK-15细胞进行培养，当所述PK-15细胞长成单层时，弃去细胞培养液，更换为DMEM营养液后培养48～60h，得到培养物；所述DMEM营养液中含有上述技术方案所述的猪塞内加谷病毒，所述猪塞内加谷病毒的体积浓度为0.1～0.2％。
本发明对所述细胞培养液没有特殊限定，采用常规培养PK-15细胞的细胞培养液即可。
本发明对所述DMEM营养液的来源没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述DMEM营养液含有猪塞内加谷病毒，所述猪塞内加谷病毒的体积浓度为0.1～0.2％，优选为0.15％。
在本发明中，所述培养的时间为48～60h。在本发明中，所述培养能够使得猪塞内加谷病毒进行增殖。
本发明将得到的培养物进行过滤，调节得到的滤液的pH值为7.6～7.8后，再与二乙烯亚胺混合，将得到的混合物进行灭活，得到灭活病毒液；所述混合物中二乙烯亚胺的浓度为1.5～2.5mmol/L。
在本发明中，所述过滤优选使用铜纱网进行，所述铜纱网的孔径优选为60～80目。在本发明中，所述过滤能够除去细胞碎片。
在本发明中，所述调节滤液的pH值使用的试剂优选为质量浓度为7.5％的碳酸氢钠溶液。
本发明优选将二乙烯亚胺制备成二乙烯亚胺溶液后再混合，所述二乙烯亚胺溶液的浓度优选为0.2M。在本发明中，所述混合物中二乙烯亚胺的浓度为1.5～2.5mmol/L，优选为2mmol/L。在本发明中，所述二乙烯亚胺溶液作为灭活剂使用。
在本发明中，所述灭活的时间优选为28～32h，更优选为30h；所述灭活的温度优选为29～31℃，更优选为30℃。
本发明优选在灭活期间进行定时搅拌和摇振，本发明对所述搅拌和摇振的条件没有特殊限定，采用常规即可。本发明优选在灭活开始后，每4h摇振1次。
本发明优选在灭活结束时加入硫代硫酸钠溶液，使硫代硫酸钠的终质量含量优选为2％。在本发明中，所述硫代硫酸钠具有中断灭活剂的灭活作用。
本发明将得到的灭活病毒液与佐剂混合、乳化，得到猪塞内加谷病毒灭活疫苗。
在本发明中，所述佐剂优选包括蒙太得206，所述蒙太得206优选为法国SEPPIC公司销售的产品。
在本发明中，所述灭活病毒液与佐剂的质量比优选为1:1。
在本发明中，所述乳化的时间优选为30～35min，更优选为31～34min，最优选为32～33min；所述乳化的转速优选为800～1000rpm，更优选为900rpm。
本发明还提供了一种猪塞内加谷病毒灭活疫苗，由包括上述技术方案所述的制备方法制备得到。在本发明中，所述猪塞内加谷病毒灭活疫苗为水包油包水(W/O/W)型。
本发明还提供了上述技术方案所述猪塞内加谷病毒灭活疫苗在制备预防猪塞内加谷病毒病药物中的应用。
在本发明中，所述猪塞内加谷病毒灭活疫苗优选采用颈部肌肉注射，妊娠母猪于产仔前21～28日接种疫苗2ml，仔猪于1月龄左右接种疫苗2ml。
下面结合具体实施例对本发明所述的猪塞内加谷病毒A/ZJ/2015、猪塞内加谷病毒灭活疫苗的制备方法、猪塞内加谷病毒灭活疫苗和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1.毒种
1.1毒种来源：猪塞内加谷病毒病灭活疫苗(A/ZJ/2015)的生产及检验用毒种均为猪塞内加谷病毒A/ZJ/2015株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15034。
1.2PCR检测：将10份临床诊断疑似SVV的猪脚皮经青霉素和链霉素处理后提取RNA，并RT-PCR反应，PCR产物进行凝胶电泳鉴定，结果显示有5份病料为猪塞内加谷病毒阳性。将5份阳性样品接种PK-15细胞，盲传3代后进行RT-PCR检测，其中4份样品呈SVV阳性，电泳结果见图1。将2号样品分离毒株命名为：A/ZJ/2015；3号样品分离毒株命名为：A/ZJ/2015/1；4号样品分离毒株命名为：A/YH/2015；5号样品分离毒株命名为：A/DQ/2015。
1.3分子病毒学鉴定：将PCR产物送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，结果用DNAstar软件与GenBank登录的代表毒株美国A/USA/IA46008/2015/9进行同源性比较、系统进化树分析，我国流行的SVV毒株与美国A/USA/IA46008/2015/9为代表的毒株群，同源性在98.2～98.5％之间。见图2和图3。
1.4病毒含量测定对A/ZJ/2015、A/ZJ/2015/1、A/YH/2015、A/DQ/20154株猪塞内加谷病料处理液分别接种于PK-15细胞中，并加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，37℃、5％CO2培养箱中培养48～60小时，收获细胞培养物，于-20℃冰箱中暂时保存。将收获的细胞培养物接种到长成单层的PK-15细胞上，盲传3代，收获每一代细胞培养物，-70℃以下保存。同时传代过程中，每代都通过PCR定性检测细胞中有无猪塞内加谷病毒增殖情况。对4株猪塞内加谷病毒在PK-15细胞上培养增殖的F2、F4及F6代进行病毒含量测定，用DMEM培养液将病毒培养液作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度病毒液100μl，接种于96孔培养板中已生长良好的PK-15细胞单层上，每个滴度接种8孔，同时设正常细胞对照，置于37℃、5％CO2培养箱中培养72～96小时，观察细胞病变(CPE)。按Reed-Muench法计算TCID50，测定结果见表1。A/ZJ/2015株F2、F4及F6代的病毒含量均为最高；A/DQ/2015株含量最低，培养至F6代，病毒滴度仍低于107.0TCID50/ml，因此只选择A/ZJ/2015、A/ZJ/2015/1、A/YH/20153株分离的病毒进行后续试验。
表1 4株分离毒株不同代次病毒含量测定
2.增殖病毒的程序
2.1制苗材料的制备：PK-15克隆细胞呈多边形的扁平细胞，细胞核呈卵圆形，细胞轮廓清晰，单层细胞形态良好，分散后呈圆形；贴壁生长；无其他细胞污染、无细菌、霉菌、支原体、外源病毒污染。PK-15克隆细胞来源原始细胞库及生产用细胞库。
2.2病毒的增殖：为了适应规模化持续生产的需要，对猪塞内加谷病毒(A/ZJ/2015株)在75L细胞生物反应器上培养的条件进行优化筛选。对接毒量、接毒后的收获时间、培养温度、细胞生物反应器转速、接种时的细胞密度等培养条件进行了逐一筛选摸索。结果表明，接种PK-15细胞数为2×105个/ml～4×105个/ml，待细胞在细胞生物反应器中生长成致密细胞单层后，接毒量为0.1～0.2％，37℃以40～60转/分的转速进行悬浮培养，接毒后16～20h收获，此时收获的猪塞内加谷病毒含量最高。
3.病毒灭活的程序
3.1过滤：将冻结的塞内卡制苗病毒液融化，经60～80目铜纱网过滤除细胞碎片，用7.5％NaHCO3调pH值至7.6～7.8。
3.2灭活：向已过滤的病毒液中加入二乙烯亚胺(BEI)，使其浓度达到2mmo1/L，在30±1℃条件下持续灭活28～32小时，其间每4h摇振1次，每组4瓶PK-15细胞上均未观察有CPE。灭活终止期加入过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液，使其终含量为2％。抽样，并置2～8℃冷库保存待用。
3.3灭活检验：
待PK-15细胞在扁瓶上生长为致密的细胞单层后，抽取灭活样品按培养液1:20比例接种，观察细胞生长情况，并设置阴性对照(按相同比例接种含0.003mol/L的BEI的培养液)和阳性对照(按相同比例接种含病毒含量为107.5TCID50/ml病毒的培养液)。每个检验组各4瓶细胞，并盲传2代。均未观察有CPE。
3.4菌检：按《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。
4.疫苗配制程序：
根据Montanide ISA206VG((法国SEPPIC公司产品蒙太得206))佐剂水包油包水型乳剂制作方法，将猪塞内加谷病毒A/ZJ/2015株灭活病毒液与206VG佐剂预热至30～31℃，使用Montanide ISA206VG与病毒含量为107.0TCID50/ml的灭活病毒液按质量比1:1比例混合，使用4叶搅拌器分别以800r/min～1000r/min的剪切转速乳化30～35min，乳化成略带粘滞性的双相油乳剂疫苗，制备灭活疫苗。
5.疫苗检验：将猪塞内加谷病毒培养液灭活后，将水相与油相佐剂按质量比1:1的比例混合乳化，制成猪塞内加谷病毒灭活疫苗(A/ZJ/2015株)共5批，经性状检验、无菌检验、安全检验、效力检验等，制定生产工艺。各检验项目均达到《猪塞内加谷病毒灭活疫苗(A/ZJ/2015株)质量标准》(草案)的各项指标。
5.1物理性状检查：
对制备的疫苗进行外观、剂型、黏度、稳定性等性状的检验。观察乳化后疫苗的外观，为乳白色乳状液。另取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散，检验其剂型是否为水包油包水(W/O/W)型。按现行《中国兽药典》附录检验黏度。稳定性检验：吸取10ml疫苗乳剂加入15ml离心管中，室温3000r/min离心15min，观察分层情况，以不分层、管底析出水相小于0.5ml为合格。
5.2无菌检验：按《中国兽药典》进行无菌检验，应无菌生长。
5.3安全检验：
取35～42日龄健康易感仔猪(猪塞内加谷病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒抗原阴性，猪塞尼卡谷病毒血清中和抗体效价不高于1:4)5头，接种前3日上下午分别测量一次体温，以6次测定体温的平均值作为每头猪基础体温。颈部肌肉接种4.0ml疫苗。接种后，每日上午、下午分别测量体温，连续测温3日，然后继续观察至10日。免疫猪精神、食欲应与接种前无明显变化，应不出现疫苗引起的明显的局部炎症或全身反应。5批疫苗安全检验试验猪经10日观察，精神、采食、体温均未出现异常，全部健活，注射局部未发生肿胀，未出现任何不良反应。
5.4效力检验：
5.1中和抗体测定取1月龄左右仔猪(猪塞内加谷病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒抗原阴性，猪塞尼卡谷病毒血清中和抗体效价不高于1:4)10头，随机分为2组，每组5头，试验组经颈部肌肉接种疫苗2.0ml/头，对照组接种相同剂量的生理盐水。接种后28日，采血进行中和抗体效价测定，对照组中和抗体几何平均值不高于1:4，试验组4/5中和抗体效价不低于1:32，几何平均值应不低于1:32。5批实验室试制猪塞内加谷病毒灭活疫苗(A/ZJ/2015株)接种1月龄左右健康易感仔猪，28日后仔猪血清中和抗体检测结果表明，免疫组5/5猪塞尼卡谷病中和抗体效价达1:32以上。中和抗体检测结果见表2。
表2 5批疫苗免疫后28日抗体效价检测结果
5批疫苗的免疫1月龄左右健康易感仔猪后中和抗体检测结果显示，5批实验室产品的效力检测均符合拟定标准。
5.2免疫攻毒试验取1月龄左右仔猪(猪塞内加谷病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒抗原阴性，猪塞尼卡谷病毒血清中和抗体效价不高于1:4)10头，随机分为2组，每组5头，试验组经颈部肌肉接种疫苗2.0ml/头，对照组接种相同剂量的生理盐水。接种后28日，连同对照组5头进行颈部肌肉注射攻毒，每头注射2.0ml(含107.3TCID50)，攻毒后连续观察15日，对照猪至少4头发病，免疫猪至少4头保护。结果表明猪塞内加谷病毒灭活疫苗(A/ZJ/2015)对1月龄左右日龄健康易感猪有良好的免疫原性，仔猪接种后保护率可达90％以上。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种猪塞内加谷病毒A/ZJ/2015，所述猪塞内加谷病毒的拉丁文为Seneca Valley，保藏编号为CGMCC No.15034。
2.一种猪塞内加谷病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)用细胞培养液对PK-15细胞进行培养，当所述PK-15细胞长成单层时，弃去细胞培养液，更换为DMEM营养液后培养48～60h，得到培养物；
所述DMEM营养液中含有权利要求1所述的猪塞内加谷病毒，所述猪塞内加谷病毒的体积浓度为0.1～0.2％；
2)将所述步骤1)得到的培养物进行过滤，调节得到的滤液的pH值为7.6～7.8后，再与二乙烯亚胺混合，将得到的混合物进行灭活，得到灭活病毒液；
所述混合物中二乙烯亚胺的浓度为1.5～2.5mmol/L；
3)将所述步骤2)得到的灭活病毒液与佐剂混合、乳化，得到猪塞内加谷病毒灭活疫苗。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)过滤使用铜纱网进行，所述铜纱网的孔径为60～80目。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)调节滤液的pH值使用的试剂为质量浓度为7.5％的碳酸氢钠溶液。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)灭活的时间为28～32h，所述灭活的温度为29～31℃。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)佐剂包括蒙太得206。
7.根据权利要求2或6所述的制备方法，其特征在于，所述佐剂与灭活病毒液的质量比为1:1。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)乳化的时间为30～35min，所述乳化的转速为800～1000rpm。
9.一种猪塞内加谷病毒灭活疫苗，其特征在于，由包括权利要求2～8任意一项所述的制备方法制备得到。
10.权利要求2～8任一项所述的制备方法制备得到的猪塞内加谷病毒灭活疫苗或权利要求9所述的猪塞内加谷病毒灭活疫苗在制备预防猪塞内加谷病毒病药物中的应用。
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