CN112062836A - 猪塞尼卡谷病毒高效价阳性血清及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种猪塞尼卡谷病毒高效价阳性血清及其制备方法。所述方法包括：通过猪塞尼卡谷病毒抗原液和灭活苗协同作用刺激实验动物(如豚鼠)产生的免疫反应获得高中和效价的阳性血清，所制得的塞尼卡谷特异性阳性血清效价高达1:1024以上，可用于塞尼卡谷病毒疫苗的特异性检验、鉴别检验和外源病毒检验以及诊断检测等用途，为猪塞尼卡谷病毒高效价阳性血清的制备提供新思路。

Description

猪塞尼卡谷病毒高效价阳性血清及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物制品领域，具体地说，涉及一种猪塞尼卡谷病毒高效价阳性血清及其制备方法。
背景技术
塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus，SVV)，也称塞尼卡病毒A(Senecavirus A，SVA)，为小RNA病毒科塞尼卡病毒属的唯一成员。SVV感染可导致猪水泡性疾病，该病毒感染后，猪的鼻吻、蹄冠状带部位出现水疱样病变，偶见腹泻症状，病情急促，新生仔猪病死率达30％～70％。SVV是一种新出现的动物病原，其引起的风险尚未可知，其诊断制品及血清制品的开发成为当务之急。目前尚无商品化猪塞尼卡谷病毒高免血清，也未见猪塞尼卡谷病毒特异性高效价阳性血清制备方法的相关报道。
发明内容
本发明旨在解决目前市场上无猪塞尼卡谷病毒阳性血清的现状，利用猪塞尼卡谷病毒抗原液和灭活苗协同作用刺激实验动物(如豚鼠)产生的免疫反应获得高中和效价的阳性血清，满足塞尼卡谷病毒病诊断技术和疫苗质量控制的要求。本发明提供一种猪塞尼卡谷病毒高效价阳性血清及其制备方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供猪塞尼卡谷病毒高效价阳性血清的制备方法，包括：
1)用猪塞尼卡谷病毒抗原液对实验动物进行基础免疫；
2)用猪塞尼卡谷病毒灭活苗对上述免疫实验动物进行加强免疫；
3)采血并制备血清。
本发明中，所述猪塞尼卡谷病毒为塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801，保藏编号为CGMCC NO.16396。塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801可参见CN109554352A。
优选地，所述实验动物为豚鼠。更优选体重为350～450g的豚鼠。
所述猪塞尼卡谷病毒抗原液的制备方法包括：采用悬浮细胞培养病毒，悬浮培养的猪塞尼卡谷病毒病毒液(简称猪塞尼卡谷病毒液)经过过滤和/或离心，获得的上清液即为抗原液。
优选地，抗原液的滴度≥109.0TCID50/ml。
优选地，用于悬浮培养猪塞尼卡谷病毒的细胞为BHK-21-BP-2，保藏编号为CGMCCNO.17588。细胞株BHK-21-BP-2可参见CN110157659A。
前述的方法，采用多点注射的方式对豚鼠进行基础免疫，每次免疫时注射猪塞尼卡谷病毒抗原液2ml～3ml，连续免疫2～3次(优选每次注射2ml，共免疫2次)，每次免疫之间间隔7～10天。
前述的方法，基础免疫后7～10天进行加强免疫。
本发明中，猪塞尼卡谷病毒灭活苗的制备方法包括：
a)水相的制备：将滴度≥109.0TCID50/ml的猪塞尼卡谷病毒抗原液经BEI(二乙烯亚胺)灭活处理，向病毒灭活液中加入硫代硫酸钠终止反应，即得；
b)灭活苗的制备：将水相与佐剂按1:1的质量比混合，乳化得灭活苗(双相油乳剂疫苗，水包油包水型)。
本发明中，所述佐剂优选矿物油佐剂，如206佐剂(法国SEPPIC公司)。
前述的方法，向猪塞尼卡谷病毒抗原液中加入终浓度为1.5～3mM的BEI，于30℃灭活32小时，得到病毒灭活液。
前述的方法，向病毒灭活液中加入1.6～2％v/v(优选2％v/v)的硫代硫酸钠终止反应。
前述的方法，可以采用多点注射的方式对豚鼠进行加强免疫，每次免疫时共注射猪塞尼卡谷病毒灭活苗2ml～3ml(优选2ml)，共免疫三～四次，每次免疫之间间隔7～10天。
前述的方法，基础免疫和加强免疫的免疫部位为豚鼠腿部肌肉。
前述的方法，步骤3)包括：测定血清中和抗体效价≥1:1024时采血，制备血清。
优选地，利用中和试验方法测定血清中和抗体效价。
第二方面，本发明提供按照上述方法制备的猪塞尼卡谷病毒高效价阳性血清。血清经过过滤、检验、冻干、分装等工艺过程后，可用于特异性试验、鉴别检验、外源病毒检验和诊断等方面。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明通过猪塞尼卡谷病毒抗原液和灭活苗协同作用刺激实验动物(如豚鼠)产生的免疫反应获得高中和效价的阳性血清，所制得的塞尼卡谷特异性阳性血清效价高达1:1024以上，可用于塞尼卡谷病毒疫苗的特异性检验、鉴别检验和外源病毒检验以及诊断检测等用途，为猪塞尼卡谷病毒高效价阳性血清的制备提供新思路。
(二)以豚鼠作为免疫动物，降低了用猪制备阳性血清因同源动物所引起的外源病毒风险，豚鼠作为异源动物，外源病毒风险低，且免疫原性强，血清提供量较大。
(三)本发明所用免疫原为猪塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801株，避免使用强毒，具有可靠的安全性和良好的免疫原性。
(四)本发明中免疫原采用悬浮细胞培养病毒液，病毒滴度高，批间差异小，能够一次性大量收获抗原。与贴壁细胞培养相比，BHK-21-BP-2细胞能够适应无血清全悬浮培养，抗原产量高，批间差异小。
(五)本发明中制备灭活苗所用佐剂为双相佐剂(水包油包水型)，比油佐剂更易注射动物机体，且产生应激小，免疫动物副反应小。
具体实施方式
本发明提供一种猪塞尼卡谷病毒特异性高效价阳性血清的制备方法，以豚鼠作为免疫动物，用悬浮培养细胞的病毒液作为猪塞尼卡谷病毒抗原，采用猪塞尼卡谷病毒抗原液和灭活苗协同作用刺激豚鼠产生的免疫反应获得高中和效价的阳性血清。
本发明采用的试验动物为350～450g豚鼠，且所述豚鼠对猪塞尼卡谷病毒血清中和抗体效价不高于1:4，猪圆环病毒2型抗体、猪蓝耳病毒抗体检测为阴性，猪塞尼卡谷病毒、口蹄疫病毒、非洲猪瘟病毒抗原检测为阴性。
本发明提供一种猪塞尼卡谷病毒特异性高效价阳性血清的制备方法，包括以下步骤：
免疫原的制备：将细胞复苏后，在37±0.5℃摇床中悬浮培养，细胞密度达4×106cells/mL以上时，逐级放大培养。细胞密度达4×106cells/mL，且细胞活率在90％以上时，将毒种按细胞液体积0.1％～0.5％的量接种培养好的悬浮细胞，设定培养参数(pH值、DO值、搅拌转数)在37±0.5℃下培养，24小时取样，显微镜下观察，当细胞活率小于20％时，收获病毒液，冻融一次(冻融目的：将待破碎的细胞冷至-15℃～-20℃，然后置于室温迅速融化，有利于细胞破解，使病毒完全释放出来。例如，将收获的病毒液于-18℃静置放置过夜，然后于室温融化，0.22μm滤膜过滤或4000rpm离心10分钟)，-40℃以下保存。
优选所述塞尼卡谷病毒为猪塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801株(保藏编号CGMCCNO.16396)；优选所述细胞为BHK-21-BP-2(保藏编号CGMCC.NO.17588)。
本发明中，细胞液是指无血清全悬浮培养基，包括BHK201培养基、BS-SFM V培养基、CD BHK-21培养基、
Figure BDA0002659154520000031
VM12-SFM培养基、BHK-LSM培养基中的任一种或多种。
上述培养基均为市售可得的商品化培养基：BH201(壹生科深圳有限公司，产品代码10501)、BS-SFM V培养基(沃美生物技术有限公司，商品编号BSS203142)；CD BHK-21培养基(gibco公司，商品编号A16277-03)、
Figure BDA0002659154520000032
VM12(SFM)(健顺生物，商品编号77017-198)、BHK-LSM(北京瑞麟和科技有限公司，商品编号LS-1)。
进一步地，将生产毒种按细胞液体积0.1％～0.5％的量接种细胞，如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。
进一步地，培养参数(pH值、DO值、搅拌转速)为pH为7.2±0.1，如pH为7.1、7.2、7.3或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。DO值为40％～50％，如40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。搅拌转速为80～100r/min，如80r/min、90r/min、100r/min或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。
作为优选方案，所述免疫接种具体包括：
(1)采用猪塞尼卡谷病毒抗原液免疫豚鼠进行基础免疫；优选所述猪塞尼卡谷病毒抗原的滴度≥109.0TCID50/ml；
(2)将所述猪塞尼卡谷病毒抗原灭活后，将上述抗原液与双相佐剂(如矿物油佐剂)按质量比1:1混合乳化，用于制备猪塞尼卡谷病毒灭活苗，采用所述猪塞尼卡谷病毒灭活苗对所述免疫动物进行加强免疫；优选在灭活前，所述猪塞尼卡谷病毒抗原的滴度≥109.0TCID50/ml。
优选地，所述基础免疫的免疫次数为2次，间隔时间为7～10天。
优选地，所述加强免疫的免疫次数为3～4次，间隔时间为7～10天。
更优选地，所述灭活的具体过程如下：将除菌过滤的BEI溶液按2％体积加入猪塞尼卡谷病毒液中，使BEI终浓度为1.5mM，充分混匀后倒罐，待温度升至30℃后开始计时，灭活32小时，每隔120分钟搅拌1次。计时结束后将过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液加入灭活病毒液中，使其终浓度为1.6～2％硫代硫酸钠，充分混匀后，灭活后抗原置于2～8℃保存。采用矿物油佐剂，按佐剂和水相1:1的质量比，将佐剂进料到乳化缸中，在搅拌条件下，将水相正压缓慢进料到乳化缸中，搅拌至水相与佐剂充分混合，乳化成双相油乳剂疫苗，即得猪塞尼卡谷病毒灭活苗。
为了优化免疫效果，本发明进一步对豚鼠的接种方式进行了优化，得到如下优选方案：
(1)基础免疫：采用多点注射的方式，分别对每只豚鼠腿部分点肌肉注射2ml猪塞尼卡谷病毒抗原液，间隔7～10天，免疫2次。
(2)加强免疫：在进行基础免疫后，每隔7～10天分别对每只豚鼠腿部肌肉注射2ml猪塞尼卡谷病毒灭活苗，共进行3～4次。
按照本领域常识，在所述免疫接种后，还包括采集血清和测定效价的步骤，其中，采集血清的时间一般根据免疫接种的间隔时间进行确定，在此不做进一步限定。
在本发明的一些实施方案中，一般在最后一次免疫后7～10天，无菌采集豚鼠血液，分离血清，以中和试验方法测定血清中和抗体效价，滴度在1:1024以上，即得猪塞尼卡谷病毒阳性血清。
本发明进一步提供一种猪塞尼卡谷病毒特异性阳性血清，采用上述制备方法制得；优选所述猪塞尼卡谷病毒特异性阳性血清的效价在1:1024以上。
所得阳性血清经过过滤、检验、冻干、分装等工艺过程后，可用于特异性试验、鉴别检验、外源病毒检验和诊断等方面。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801由中牧实业股份有限公司分离、鉴定并提供(保藏编号CGMCC NO.16396)，细胞株BHK-21-BP-2由中牧实业股份有限公司提供(保藏编号CGMCC.NO.17588)。
细胞液为无血清全悬浮培养基，购自苏州沃美生物技术有限公司。
矿物油佐剂为206佐剂，购自法国SEPPIC公司。
所用试验动物为350～450g豚鼠，购自北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司。所述豚鼠对猪塞尼卡谷病毒血清中和抗体效价不高于1:4，猪圆环病毒2型抗体、猪蓝耳病毒抗体检测为阴性，猪塞尼卡谷病毒、口蹄疫病毒、非洲猪瘟病毒抗原检测为阴性。
中和试验方法的具体步骤如下：参考SN/T 1698-2006猪伪狂犬病微量血清中和试验操作规程。
(1)血清灭活：将待检血清置56℃水浴30分钟。
(2)血清加样：吸取阳性血清、阴性血清和待检血清，接种96孔细胞板，每个样品4个孔，每孔100μl。
(3)血清稀释：将上述加好的血清样品中每孔加入100μl维持液(含2％v/v新生牛血清的DMEM培养基；其中，DMEM为商品化培养基，购自Hyclone公司，新生牛血清购自内蒙古金源康生物工程有限公司)，作2倍系列稀释，稀释至1:4096，最后一个稀释度混匀后吸取100μl弃去。
(4)病毒稀释：将猪塞尼卡谷病毒China/HuN-1/2017株(即SVV-ZM-201801)用维持液稀释至100TCID50/0.lml，作为中和用毒。
(5)中和：将中和用毒100μl加入96孔板中，分别与稀释后猪塞尼卡谷病毒阳性血清、阴性血清和待检血清等量混合，于37℃、5％CO2培养箱中孵育1小时。
(6)对照：设病毒回归对照4个滴度(100TCID50/0.lml、10TCID50/0.lml、1TCID50/0.lml，0.1TCID50/0.lml)，每个滴度4孔，每孔病毒液100μl。同时设细胞空白对照4～8孔，每孔加入100μl维持液。
(7)接种细胞：向上述96孔板中加入BHK-21细胞悬液，每孔100μl。同时设病毒对照和正常细胞对照，于37℃、5％CO2培养箱中静止培养72小时，逐日观察并记录细胞病变(CPE)。
(8)结果判定
试验成立条件：1)100TCID50/0.lml应4/4孔病变，0.1TCID50/0.1ml 4/4孔不病变；2)细胞对照孔应不病变；3)阴性血清组细胞孔应全部病交；(4)阳性血清中和组细胞孔应全部不病变。
结果计算：用倒置显微镜观察细胞孔是否出现CPE，统计待检血清病变孔数，按Reed-Muench法计算血清中和抗体效价。
实施例1猪塞尼卡谷病毒特异性高效价阳性血清的制备方法
1、猪塞尼卡谷病毒液制备
将细胞复苏后，在37±0.5℃摇床中悬浮培养，细胞密度达4×106cells/mL以上时，逐级放大培养。细胞密度达4×106cells/mL，且细胞活率在90％以上时，将生产毒种按细胞液体积0.1％的量接种培养好的悬浮细胞，设定培养参数(pH值、DO值、搅拌转数)在37±0.5℃下培养，24小时取样，显微镜下观察，当细胞活率小于20％时，收获病毒培养物，冻融一次(冻融目的：将收获的病毒液于-18℃静置放置过夜，然后于室温融化，使病毒从细胞中完全释放出来)，-40℃以下保存。
猪塞尼卡谷病毒抗原液的制备：将收获病毒液经过滤或离心，获得的上清液即为猪塞尼卡谷病毒抗原液。
所得猪塞尼卡谷抗原液的滴度≥109.0TCID50/ml。
2、猪塞尼卡谷病毒灭活苗的制备
1)将除菌过滤的4％BEI溶液按2％体积加入猪塞尼卡谷抗原液中，使BEI终浓度为1.5mM，充分混匀后倒罐，待温度升至30℃后开始计时，灭活32小时，每隔120分钟搅拌1次。
2)计时结束后将过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液加入灭活病毒液中，使其终浓度为2％，充分混匀后，灭活后抗原(滴度≥109.0TCID50/ml)作为水相，于2～8℃保存。
3)采用矿物油佐剂，按质量比佐剂:水相＝1:1的比例，将佐剂进料到乳化缸中，在搅拌条件下，将水相正压缓慢进料到乳化缸中，搅拌至水相与佐剂充分混合，乳化成双相油乳剂疫苗，即得猪塞尼卡谷病毒灭活苗。
3、免疫接种
基础免疫：分别对每只豚鼠腿部肌肉分点注射2ml的猪塞尼卡谷病毒抗原液，间隔7天，免疫2次。加强免疫：基础免疫后每隔10天分别对每只豚鼠腿部肌肉注射2ml的猪塞尼卡谷灭活苗，免疫3次。
4、采集血清
最后一次免疫后7天，无菌采血收集豚鼠血，分离血清，按照《中国兽药典》2015版规定的方法进行中和试验测定血清中和200TCID50猪塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801株的中和效价。测定血清中和抗体效价，效价为1:1448。
实施例2猪塞尼卡谷病毒特异性高效价阳性血清的制备方法
1、猪塞尼卡谷病毒抗原液的制备
将细胞复苏后，在37±0.5℃摇床中悬浮培养，细胞密度达4×106cells/mL以上时，逐级放大培养(pH7.2±0.1，溶氧DO 30％～60％，搅拌速度60～150rpm)。细胞密度达4×106cells/mL，且细胞活率在90％以上时，将生产毒种按细胞液体积0.5％的量接种培养好的悬浮细胞，设定培养参数(pH7.2±0.1，溶氧DO 40％～60％，搅拌速度80～110rpm)在37±0.5℃下培养，24小时取样，显微镜下观察，当细胞活率小于20％时，收获病毒培养物，冻融一次(冻融目的：将收获的病毒液于-18℃静置放置过夜，然后于室温融化，使病毒从细胞中完全释放出来)，-40℃以下保存。
猪塞尼卡谷病毒抗原液的制备：将收获病毒液经过滤或离心，获得的上清液即为猪塞尼卡谷病毒抗原液。
所得猪塞尼卡谷抗原液的滴度≥109.0TCID50/ml。
2、猪塞尼卡谷病毒灭活苗的制备
1)将除菌过滤的4％BEI溶液按2％体积加入猪塞尼卡谷抗原液中，使BEI终浓度为1.5mM，充分混匀后倒罐，待温度升至30℃后开始计时，灭活32小时，每隔120分钟搅拌1次。
2)计时结束后将过滤除菌的50％硫代硫酸钠溶液加入灭活病毒液中，使其终浓度为2％，充分混匀后，灭活后抗原放置2～8℃保存。
3)采用矿物油佐剂，按质量比佐剂:水相＝1:1的比例，将佐剂进料到乳化缸中，在搅拌条件下，将水相正压缓慢进料到乳化缸中，搅拌至水相与佐剂充分混合，乳化成双相油乳剂疫苗，即得猪塞尼卡谷病毒灭活苗。
3、免疫接种
基础免疫：分别对每只豚鼠腿部肌肉分点注射2ml的猪塞尼卡谷病毒抗原液，间隔10天，免疫2次。加强免疫：基础免疫后每隔10天分别对每只豚鼠腿部肌肉注射2ml的猪塞尼卡谷灭活苗，免疫3次。
4、采集血清
最后一次免疫后7天，通过前腔静脉放血的方式收获血清，分离血清，以中和试验方法测定血清中和抗体效价，效价为1:2048。
本发明提供的塞尼卡谷病毒特异性高效价阳性血清的制备方法。该方法首次用猪塞尼卡谷抗原液对豚鼠进行两次基础免疫，再用猪塞尼卡谷病毒灭活苗对豚鼠进行3～4次加强免疫，而后无菌采集豚鼠血清，以中和试验方法测定血清中和抗体效价。本发明利用豚鼠作为实验动物，按照一定免疫程序免疫接种制备特异性阳性血清，血清经过过滤、检验、冻干、分装等工艺过程，最终用于特异性检验、鉴别检验、外源病毒检验和诊断等。本发明通过猪塞尼卡谷病毒抗原液和灭活苗协同作用刺激豚鼠产生的免疫反应获得高中和效价的阳性血清，减小了用猪制备阳性血清因同源动物而引起的外源病毒污染的风险，为阳性血清的制备提供新思路。
实施例3抗原液和灭活苗联合免疫与灭活苗、抗原液单独免疫的比较
本实施例中，分别用实施例1制备的灭活苗、抗原液进行单独免疫。
免疫方法：取豚鼠对其腿部肌肉多点注射上述抗原液、灭活苗，分别经过4次或5次免疫，两次基础免疫各2ml，加强免疫每只3ml。与抗原液和灭活苗联合免疫相比，测定免疫后血清中和抗体效价，结果如表1所示：
表1不同免疫途径对豚鼠抗SVV特异性血清中和效价的影响
Figure BDA0002659154520000081
可见，抗原液和灭活苗联合免疫(混免)效果明显优于灭活疫苗或抗原液单独免疫(单免)。
实施例4最佳免疫程序的确定
为确定最佳免疫程序，采用灭活苗进行基础免疫，抗原液进行加强免疫的免疫程序，结果显示血清抗体低于抗原液进行基础免疫，灭活疫苗进行加强免疫的免疫程序，因此优选抗原液进行基础免疫，灭活疫苗进行加强免疫。
实施例5免疫动物的选择
采用不同实验动物进行免疫，兔的免疫结果如表2所示：
兔子免疫方法：选取体重1.5～3kg雌性新西兰大耳朵白兔4只，分别对每只兔子进行4～5次免疫接种，一免和二免：将实施例1制备的抗原液背部及腿部多点注射免疫兔子，每只注射2ml，三免～五免：第一次接种后每隔14天对每只兔子皮下多点注射实施例1制备灭活苗，每只注射3ml。
表2兔抗SVV特异性血清和豚鼠抗SVV特异性血清中和效价结果
Figure BDA0002659154520000082
Figure BDA0002659154520000091
可见，与兔免疫相比，豚鼠免疫能够获得高水平抗体的血清。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.猪塞尼卡谷病毒高效价阳性血清的制备方法，其特征在于，包括：
1)用猪塞尼卡谷病毒抗原液对实验动物进行基础免疫；
2)用猪塞尼卡谷病毒灭活苗对上述免疫实验动物进行加强免疫；
3)采血并制备血清；
所述猪塞尼卡谷病毒为塞尼卡谷病毒SVV-ZM-201801。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述实验动物为豚鼠。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述猪塞尼卡谷病毒抗原液的制备方法包括：悬浮培养的猪塞尼卡谷病毒病毒液经过过滤和/或离心，获得的上清液即为抗原液；
优选地，抗原液的滴度≥109.0TCID50/ml；和/或
用于悬浮培养猪塞尼卡谷病毒的细胞为BHK-21-BP-2。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用多点注射的方式对豚鼠进行基础免疫，每次免疫时注射猪塞尼卡谷病毒抗原液2ml～3ml，连续免疫2～3次，每次免疫之间间隔7～10天。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，猪塞尼卡谷病毒灭活苗的制备方法包括：
a)水相的制备：将滴度≥109.0TCID50/ml的猪塞尼卡谷病毒抗原液经BEI灭活处理，向病毒灭活液中加入硫代硫酸钠终止反应，即得；
b)灭活苗的制备：将水相与佐剂按1:1的质量比混合，乳化得灭活苗；
优选地，所述佐剂为矿物油佐剂。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，向猪塞尼卡谷病毒抗原液中终浓度为1.5～3mM的BEI，于30℃灭活32小时，得到病毒灭活液；和/或
向病毒灭活液中加入终浓度为1.6～2％v/v的硫代硫酸钠终止反应。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采用多点注射的方式对豚鼠进行加强免疫，每次免疫时共注射猪塞尼卡谷病毒灭活苗2～3ml，共免疫三～四次，每次免疫之间间隔7～10天。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)中免疫的豚鼠体重为350～450g；和/或
免疫部位为豚鼠腿部肌肉。
9.根据权利要求2-8任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：测定血清中和抗体效价≥1:1024时采血，制备血清。
10.根据权利要求1-9任一项所述方法制备的猪塞尼卡谷病毒高效价阳性血清。
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