CN112341539A

CN112341539A - 防治具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒的卵黄抗体及其制备方法

Info

Publication number: CN112341539A
Application number: CN202011136679.9A
Authority: CN
Inventors: 刁有祥; 唐熠; 魏峰
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-10-22
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2040-10-22
Also published as: CN112341539B

Abstract

本发明公开了一种防治具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒的卵黄抗体，所述卵黄抗体是以灭活的保藏编号为CCTCC NO：V202019的新型鹅星状病毒作为抗原制备的疫苗免疫蛋鸡，然后从高免鸡蛋蛋黄中提取纯化得到。用保藏编号为CCTCC NO：V202019的鹅星状病毒作为疫苗生产毒株制备灭活疫苗来免疫蛋鸡，可以高效的获得卵黄抗体，该卵黄抗体的安全性好，未出现由卵黄抗体引起的任何局部或全身不良反应；而且能够有效的预防和治疗新型鹅星状病毒的感染，具有很好的商品化开发前景。

Description

防治具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒的卵黄抗体及其制备方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一种防治具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒的卵黄抗体及其制备方法。

背景技术

星状病毒为直径28～30nm球形无囊膜的单股正链RNA病毒，国际病毒分离委员会(ICTV)在第九次分类报告中将衣壳蛋白的的遗传距离作为属内病毒种的分类标准，将禽星状病毒属分为3个病毒种名，即Avastrovirus 1、Avastrovirus 2和Avastwvirus 3。

2019年5月，我国山东、江苏等地雏鸭群爆发了一种以肾炎和内脏器官尿酸盐沉积为主要特征的传染性疾病。该病主要发生于3～20日龄的雏鸭，病鸭以肾脏肿大出血、肾小管上皮细胞发生变性、坏死、脱落为主要特征，死亡率最高可达40％，给养鸭业造成了巨大的经济损失。

经研究发现，该病的爆发是由一种新型的鹅星状病毒感染所致，目前尚无疫苗可以进行预防，常规的抗病毒和抗菌治疗方法无效。

卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有IgG类抗体，故称其为卵黄免疫球蛋白IgG(egg yolkimmunoglobulins)，简称为IgY。与血清抗体相比，卵黄抗体具有很多独特的优点：(1)无需采血，只需采集免疫高免鸡蛋卵黄纯化即可纯化得到卵黄抗体；(2)有良好的稳定性，耐热耐酸，且常温下仍能保持一定的活性；(3)治疗效果明显，特异性强，且可适应大规模生产；(4)安全、高效、无残留、温和环保。但由于该病在我国属于首次报道，目前尚无商品化的疫苗及抗体上市，用于该新型鹅星状病毒的紧急预防和早期感染治疗的卵黄抗体更是未见报道；而且由于卵黄中含有大量的脂质，给使用带来许多不便，这也制约了防治该新型鹅星状病毒的卵黄抗体的研制与应用。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种防治具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒的卵黄抗体，用于预防和治疗鸭群爆发的以肾炎和内脏器官尿酸盐沉积为主要症状的新型星状病毒感染，从而弥补该疾病造成的严重经济损失。

本发明的另一目的是提供该防治具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒的卵黄抗体的制备方法。该制备方法易于操作，适合大规模生产；而且制备的卵黄抗体性质稳定、纯度高、效价高、特异性强，无药物残留，温和环保，对新型星状病毒感染的预防及治疗极具应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明是基于从发病雏鸭的肾脏组织中分离得到的一株新型鹅星状病毒，命名为新型鹅星状病毒SDTA株，保藏编号为CCTCC NO：V202019，在该分离株的基础上，研制了能够防治该新型鹅星状病毒的灭活疫苗，利用该灭活疫苗高强度免疫健康蛋鸡，然后分离免疫后鸡蛋卵黄，提取制备卵黄抗体。具体的：

本发明的第一方面，提供一种防治具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒的卵黄抗体，所述卵黄抗体是以灭活的保藏编号为CCTCC NO：V202019的新型鹅星状病毒作为抗原制备的疫苗免疫蛋鸡，然后从高免鸡蛋蛋黄中提取纯化得到。

本发明的第二方面，提供上述卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)用保藏编号为CCTCC NO：V202019的新型鹅星状病毒作为疫苗生产毒株，制成灭活疫苗；

(2)用制备的灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，制备高免蛋；

(3)由高免蛋收集卵黄，经一次灭活、酸化萃取、二次灭活、粗滤、除菌过滤、浓缩和三次灭活后制备成防治新型鹅星状病毒的卵黄抗体。

优选的，步骤(1)中，所述灭活疫苗由如下方法制备而成：

1)将保藏编号为CCTCC NO：V202019的鹅星状病毒接种到DEK细胞中，对鹅星状病毒进行增殖培养后，通过冻融破碎细胞，收取上清液，并进行纯化，获得鹅星状病毒株病毒液；

2)将鹅星状病毒株病毒液灭活，加入Tween-80混合作为水相，以白油、硬脂酸铝和Span-80混合作为油相，将油相和水相按2:1混合均匀，乳化，得到防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗。

更优选的，所述鹅星状病毒株病毒液中的病毒滴度为10^7.0-10^7.6TCID₅₀/0.1ml。

优选的，步骤(2)中，用制备的灭活疫苗分4次对产蛋鸡进行免疫，每次免疫间隔2周。免疫途径为颈部皮下或肌肉注射灭活疫苗。

优选的，步骤(3)中，所述一次灭活具体为：将卵黄液与水按体积比1:(0.5～1.5)混合，搅拌均匀后得到卵黄稀释液，于60～65℃条件下保温25～35min。

优选的，步骤(3)中，所述酸化萃取具体为：向卵黄稀释液中加入所述卵黄稀释液体积2.5～3.5倍的醋酸盐缓冲液，搅拌后过滤收集滤液。进一步优选的，所述醋酸盐缓冲液的pH值为4.8-5.2；更优选为5.0。

优选的，步骤(3)中，所述二次灭活具体为：向酸化萃取后的滤液中加入辛酸至终浓度3.5～4.5％，搅拌30-120min，搅拌后于2～8℃放置4～8小时。

优选的，步骤(3)中，所述粗滤具体为：先以滤布过滤，而后再以滤膜过滤至滤液澄清。进一步优选的，所述滤布是丙纶750B滤布。

优选的，步骤(3)中，所述除菌过滤具体为：用0.22μm滤膜过滤除菌。

优选的，步骤(3)中，所述浓缩具体为：利用30～50KD的PES中空纤维超滤膜在2～8℃条件下进行浓缩，至抗体效价不低于1:1024。

优选的，步骤(3)中，所述三次灭活具体为：加入甲醛溶液，使甲醛溶液的终浓度为0.1％，37℃灭活16h。

本发明的第三方面，提供上述卵黄抗体在制备用于预防和/或治疗新型鹅星状病毒感染的制品中的应用。所述新型鹅星状病毒的保藏编号为CCTCC NO：V202019。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的保藏编号为CCTCC NO：V202019的鹅星状病毒具有跨种传播能力，而且对多种细胞具有嗜性，方便进行体外培养，而且，与其他种类的细胞相比，新型鹅星状病毒SDTA在DEK细胞上出现病变时间早，收获时间早，病毒含量高，非常适合进行高抗原滴度的优质灭活疫苗的生产；对新发的以雏鸭肾炎为主要病症的传染性疾病具有很好的免疫原性。

(2)以保藏编号为CCTCC NO：V202019的鹅星状病毒株制备的灭活疫苗安全性好，保护率达100％，而且免疫保护持续时间长。

(3)用保藏编号为CCTCC NO：V202019的鹅星状病毒作为疫苗生产毒株制备灭活疫苗来免疫蛋鸡，可以高效的获得卵黄抗体，该卵黄抗体的安全性好，未出现由卵黄抗体引起的任何局部或全身不良反应；而且能够有效的预防和治疗新型鹅星状病毒的感染，具有很好的商品化开发前景。

附图说明

图1：PCR鉴定结果；图中，M为2000bp Marker，泳道1为GoAStV，泳道2为GoAStV，泳道3为DAStV，泳道4为DHAV，泳道5为DRV，泳道6为TMUV，泳道7为DuCV，泳8为DPV，泳道9为空白对照。

图2：A为新型鹅星状病毒SDTA接种至LMH细胞56h后的图片；B为未接种病毒的对照细胞图片。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。其中：

RNA提取试剂盒购于北京康为世纪有限公司，普通琼脂糖凝胶回收试剂盒购于北京全式金公司，反转录试剂盒购于宝生物(大连)有限公司，2×Es Taq MasterMix购于北京康为世纪有限公司，DL2000 Marker购于宝生物(大连)有限公司。

实施例1：鹅星状病毒毒株的分离和鉴定

1.流行病学调查：

自2019年5月以来，我国山东、江苏等地雏鸭群爆发了一种以肾炎和内脏器官尿酸盐沉积为主要特征的传染性疾病。该病主要发生于3～20日龄的雏鸭，死亡率最高可达40％。对病死的雏鸭进行剖检，主要的病理变化如下：肾脏肿大出血，肾小管上皮细胞发生变性、坏死、脱落。

2.病料采集与处理：

对山东泰安某鸭场的患病鸭的肾脏等病变脏器进行细菌检验。结果发现，患病鸭肾脏组织未检测到细菌，初步排除细菌感染的可能。

然后取患病雏鸭的肾脏组织，加入无菌PBS，研磨成匀浆，反复冻融3次，离心取上清液，上清液过滤除菌后，经绒毛尿囊膜接种鸭胚，37℃孵育，每天检查存活情况，连续观察5d，收集尿囊液、病变明显的尿囊膜和组织脏器并混匀。继续接种鸭胚，连续传代3次，取第三代尿囊液、尿囊膜及组织脏器混合液进行后续检测。

3.RT-PCR鉴定：

(1)RNA提取：将收集的混合液离心取上清液，按照RNA提取试剂盒说明书要求，提取病毒RNA，置于-20℃保存备用。

(2)反转录获得cDNA：所用反转录试剂盒采用来自宝生物(大连)有限公司的货号为RR036A的PrimeScript^TM RT Master Mix，在200μLPCR反应管中依次加入5×PrimeScriptRT Master Mix×2μL，从病毒液中提取的RNA～2μL，使用RNase Free dH₂O补充至10μl体系。置于PCR仪中进行反应，反应条件为37℃15min；85℃5s，之后4℃保存。

(3)PCR扩增：

根据美国国家生物技术信息中心建立的基因序列数据库Genbank上所有星状病毒基因序列设计扩增489bp片段的特异性引物一对，由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

上游引物：5′-ATTCTTGGCTCGGTTGTC-3′；(SEQ ID NO.1)

下游引物：5′-CCTGTGTTGCTCCTTCTC-3′。(SEQ ID NO.2)

采用20μL体系进行扩增：模板cDNA×2μL，上、下游引物各×1μL，2×Es TaqMasterMix×10μL，采用ddH₂O补充至20μL体系。混匀并瞬离后置于PCR仪进行反应，反应条件为95℃，5min，之后95℃，45s，52℃，30s，72℃，25s进行30个循环，72℃，10min之后4℃保存备用。

同时，利用已报道的特异性引物对常规鸭源病毒检测，包括：鸭呼肠孤病毒(DRV)、鸭星状病毒(DAStV)、鸭甲肝病毒(DHAV)、鸭瘟病毒(DPV)、鸭坦布苏病毒(TMUV)及鸭圆环病毒(DuCV)。

(4)琼脂糖凝胶电泳：

将PCR扩增产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果发现，采用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物进行PCR扩增后的产物在1％琼脂糖凝胶中电泳后出现了与预期值489bp大小相符的特异性条带，表明分离株的细胞培养物中存在新型水禽星状病毒。另外对分离株进行的常规鸭源病毒检测，包括：DRV、DAStV、DHAV、DPV、TMUV及DuCV，结果均为阴性，并未检测到其他病毒污染(图1)。表明分离株为星状病毒，命名为SDTA-001株。

4.病毒基因组的扩增及序列分析：

以获得的cDNA为模板，对分离毒株SDTA-001株的基因组进行分段扩增，扩增产物送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。测序结果拼接后用Blast进行比对，同时与其他不同种属星状病毒进行同源性分析。

结果显示，SDTA-001株编码区包含ORF1a、ORF1b及ORF2三个开放性阅读框。将该分离株全基因组核苷酸序列和ORF2基因序列与GenBank上已发表的禽源星状病毒和哺乳动物星状病毒基因序列进行比对分析，结果发现，SDTA-001株ORF2基因序列(如SEQ ID NO.3所示)与鹅星状病毒的同源性均在95％以上。由此可以认定：分离株SDTA-001株为鹅星状病毒。

将该毒株命名为新型鹅星状病毒SDTA。并对该毒株进行生物保藏，保藏信息如下：

菌种名称：新型鹅星状病毒SDTA

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏机构简称：CCTCC

地址：中国武汉，武汉大学

保藏日期：2020年1月12日

保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：V202019。

实施例2：新型鹅星状病毒SDTA的特性考察

1.病毒的致病性：

1.1对雏鸭的致病性：将20只5日龄的健康雏鸭随机分为两组：实验组和对照组，实验组肌肉注射新型鹅星状病毒SDTA的病毒液，0.2ml/只；对照组注射等量的无菌生理盐水，观察各组雏鸭的临床表现，观察14日。

实验组的雏鸭在攻毒后第4日、第6日、第7日和第9日各死亡一只，死亡率达40％(4/10)。剖检病死雏鸭，可见肾脏肿大出血，肾小管上皮细胞发生变性、坏死、脱落，。

对照组雏鸭均健活，无任何临床表现，14日后剖检，未见任何病变。

1.2对雏鹅的致病性：将20只5日龄的健康雏鹅随机分为两组：实验组和对照组，实验组肌肉注射新型鹅星状病毒SDTA的病毒液，0.2ml/只；对照组注射等量的无菌生理盐水，观察各组雏鹅的临床表现，观察14日。

实验组的雏鹅在攻毒后第5日、第7日和第10日各死亡一只，死亡率达30％(3/10)。剖检病死雏鹅，可见肾脏肿大出血，肾小管上皮细胞发生坏死、脱落。

对照组雏鹅均健活，无任何临床表现，14日后剖检，未见任何病变。

由此可见，本发明的新型鹅星状病毒SDTA具有跨种传播的能力。

2.病毒的免疫原性：

将新型鹅星状病毒SDTA制成活毒抗原和灭活抗原，分别免疫未接种疫苗的健康5日龄雏鸭，收集免疫后5d、10d、20d，攻毒后7d、12d的血清，采用间接ELISA法检测血清中的抗体。

结果表明：接种活毒抗原雏鸭的抗体水平低于接种灭活抗原的雏鸭；即灭活抗原比活毒抗原具有更好的免疫原性。

将新型鹅星状病毒SDTA制成的灭活疫苗接种成年雌性种鸭，经灭活抗原免疫后的种鸭所产子代均能够产生完全的攻毒保护，说明该新型鹅星状病毒SDTA毒株具有优异的免疫原性。

3.病毒的细胞嗜性：

为了确定新型鹅星状病毒SDTA的细胞嗜性，本研究运用细胞病变观察的方法检测新型鹅星状病毒SDTA在鸭胚肾细胞(DEK)、鸡肝癌细胞(LMH)等不同细胞上的增殖情况，具体如下：

3.1试验方法：

健康细胞形成致密单层后，弃掉生长液，接种新型鹅星状病毒SDTA并吸附1h，期间间隔晃动，保证病毒吸附均匀。加入与生长液等量、含2％新生牛血清的病毒维持液，期间不再更换新的培养液；同时设未接病毒的健康细胞作为对照。

置37℃培养箱中静置培养，每日观察并记录细胞病变情况，75％细胞出现病变时收获，通过冻融释放细胞内病毒，按Reed-Muench法计算病毒含量。

3.2试验结果：

(1)病变情况：

将新型鹅星状病毒SDTA接种至DEK细胞24h后形成明显的细胞病变，即表现为细胞变圆、聚集、脱落呈现结网状病变，未接病毒的对照细胞正常。新型鹅星状病毒SDTA接种至LMH细胞，56h后形成明显的细胞病变(图2A)；未接病毒的对照细胞正常，未出现细胞病变(图2B)。

(2)病毒含量测定结果：

新型鹅星状病毒SDTA在不同细胞上增殖的病毒含量结果见表1。

表1：新型鹅星状病毒SDTA在不同细胞上增殖的病毒含量

细胞种类	TCID<sub>50</sub>
		DEK	10<sup>7.6</sup>
LMH	10<sup>4.5</sup>

鹅星状病毒的纯化培养一直是病毒及疫苗研究中的难点，能否获得适应体外细胞培养的疫苗株是疫苗研制和生产的关键所在。与现有报道的鹅星状病毒不同的是，本发明的新型鹅星状病毒SDTA具有广泛的细胞嗜性，能感染多种动物细胞并较好的增殖，同时产生明显的细胞病变。因此，本发明的新型鹅星状病毒SDTA可以作为优异的疫苗株。

而且，与其他种类的细胞相比，新型鹅星状病毒SDTA在DEK细胞上出现病变时间早，收获时间早，病毒含量高，非常适合进行高抗原滴度的优质灭活疫苗的生产。

实施例3：灭活疫苗的制备

(1)病毒的增殖与收获：

将分离鉴定后的新型鹅星状病毒SDTA接种到生长良好的DEK细胞中，接种体积比为1：100；37℃吸附1h，然后用含2％新生牛血清的DMEM培养基于37℃、5％CO2的条件下进行培养，至75％细胞出现病变时收获，获取细胞病毒液。将获得的足量细胞病毒液置于-20℃冷冻，经两次冻融后，离心收集上清液得到病毒液。计算TCID₅₀，每0.1ml病毒液中病毒含量为10^7.5TCID₅₀。

(2)病毒的纯化：

用已建立的PCR、RT-PCR等检测方法，检测获取的病毒液中是否含其他常见病毒。检测项目包括禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸭坦布苏病毒(TMUV)、鸭星状病毒(DAstV)、鸭甲型肝炎病毒(DHAV)等，并对种毒进行纯化。

(3)病毒液的灭活：

菌检合格的病毒液用甲醛进行灭活，其最佳的灭活条件为加入终浓度0.2％的甲醛，37℃搅拌灭活16h。

(4)疫苗的制备：

①油相的准备：取10号药用白油与司班-80(Span-80)按照94:6的比例充分混合均匀，然后加入2％的硬脂酸铝(Aluminum tristearate)，搅拌至淡黄色且澄清透明后,121℃高压蒸气灭菌备用。

②水相的准备：灭活完全的病毒液与无菌吐温-80(Tween-80)按照96:4的比例振荡混匀，使Tween-80彻底溶解。

③乳化：油相和水相按2：1的比例混合，在超净台内将2份油相加入组织匀浆机，缓慢地将1份水相，期间不断搅拌，水相全部加入后6000rpm混合10min，再8000r/min乳化20min，分装备用，即制备得到灭活疫苗。

实施例4：灭活疫苗的质量检验

将实施例3制备的灭活疫苗进行包括：剂型、离心稳定性、粘度、无菌和保存期的质量检验，具体方法参考《中华人民共和国兽药典》(2015版)。

结果为：本发明制备的灭活疫苗的剂型为油包水型(W/O)；离心稳定性、粘度和无菌检查符合《中华人民共和国兽药典》(2015版)的规定。

实施例5：灭活疫苗的安全性检验

取5日龄雏鸭20只，随机均分为2组，每组10只。其中第1组为实验组，腿部肌肉注射实施例3制备的新型鹅星状病毒灭活疫苗，0.5mL/只，第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂，接种后每日观察各组动物的精神状态，以及注射部位是否出现红肿热痛等局部炎症反应，持续观察2周，2周后对试验动物进行解剖，观察注射部位疫苗吸收情况；

结果：试验组出现短暂的精神沉郁，但很快恢复，持续观察两周，试验组和对照组生长发育均正常，精神状态良好，剖检试验组发现注射部位疫苗吸收良好，无红肿、组织坏死等炎症反应。结果证明试制疫苗安全无害，对动物生长无影响。

实施例6：灭活疫苗的保护性检验

取5日龄雏鸭20只，随机均分为2组，每组10只。其中第1组为免疫组，腿部肌肉注射实施例3制备的灭活疫苗，0.5mL/只；第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂，在免疫后10日，对两组雏鹅腿部注射0.2mL新型鹅星状病毒液，并分组隔离饲养，观察两组雏鹅的精神状况及死亡情况。

结果：免疫组出现短暂的精神沉郁，但未表现出鹅星状病毒病的临床症状(肾炎和内脏器官尿酸盐沉积)，未有雏鸭死亡；对照组的雏鸭在攻毒后出现明显的临床症状(肾炎和内脏器官尿酸盐沉积)，死亡只数为3只，结果显示，本发明制备的灭活疫苗的免疫保护率能达到100％。

实施例7：灭活疫苗的免疫持续期测定

取5日龄雏鸭20只，随机均分为2组，每组10只。其中第1组为免疫组，每只腿部肌肉注射实施例3制备的灭活疫苗，0.5mL/只；第2组为对照组，腿部肌肉注射等量灭菌白油佐剂；免疫后每隔两天采集血清采用间接ELISA检测抗体。

结果发现，免疫组的抗体水平在第3天的时候开始显著升高，第7天达到高峰，此后45天内稍有下降但仍维持较高水平；而对照组的抗体水平在整个实验中均为阴性。说明本发明的灭活疫苗能够在短时间内快速达到高浓度的抗体水平，且免疫持续期长，能够为雏鹅提供快速、长期的免疫保护。

实施例8：卵黄抗体的制备

1.采用灭活疫苗免疫产蛋鸡：

将实施例3制备的新型鹅星状病毒灭活疫苗免疫蛋鸡，首次免疫每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，14天后进行第二次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，二免后14天进行第三次免疫，每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，三免后14天进行加强免疫,每只鸡颈部皮下注射2.0ml灭活疫苗，加强免疫之后14天，采集卵黄测定新型鹅星状病毒中和抗体效价应≥1:1024。

2.卵黄抗体制造：

(1)蛋壳消毒：收集高免鸡蛋浸泡于1％新洁尔灭溶液中15min。取出后自然晾干或吹干后，喷洒75％的酒精对蛋壳表面消毒备用。

(2)卵黄分离：采取机械打蛋方式，打蛋时应充分除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄。

(3)灭活Ⅰ：将收集的蛋黄充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，启动蠕动泵，将蛋黄液泵入夹层反应罐中，加入与蛋黄等体积的注射用水(注射用水先经80℃30min消毒，并冷却至65℃以下)，搅拌混匀后，60～65℃保温(灭活)30min。

(4)酸化萃提：先在隔离反应罐中加入相当于原蛋黄3倍体积的pH值5.0的醋酸缓冲液，然后加入卵黄液，开启搅拌机，充分拌搅30分钟。

(5)灭活Ⅱ：卵黄液液中加入终浓度(V/V)为4％的辛酸作灭活剂和萃提剂，剧烈搅拌90min，2～8℃放置4～8小时。

(6)粗滤：用丙纶750B滤布过滤后，再用柱芯滤器过滤至澄清。

(7)除菌过滤：用0.22μm滤膜过滤除菌。置2～8℃存放，应不超过14日。同时取样检测新型星状病毒的中和抗体效价。

(8)浓缩：如检测的新型鹅星状病毒的中和抗体效价低于1:1024，应将除菌过滤后的卵黄抗体在2～8℃条件下，用30～50KD的浓缩膜包进行适当倍数的超滤浓缩，浓缩后的新型星状病毒中和抗体效价应均不低于1:1024。

(9)灭活Ⅲ：将浓缩后的溶液导入灭活罐中，计量加入10％的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度(V/V)为0.1％，37℃灭活16小时。

(10)分装贮存：在无菌条件下将灭活好的滤液分装于无菌玻璃瓶中，盖好胶塞，轧铝盖，贴上标签，保存备用，保存温度为-20℃。

实施例9：卵黄抗体质量检验

1.安全性检验：

用5日龄易感雏鸭(新型鹅星状病毒母源抗体均＜1:4)10只，各肌肉分点注射本发明实施例8制备的卵黄抗体2.0ml，观察14日，易感雏鸭全部健康存活，说明本发明的卵黄抗体的安全性好。

2.无菌检验：

按照《中华人民共和国兽药典》(2015版)进行，结果为：无细菌、支原体和外源病毒污染。

3.效力检验(免疫攻毒法)：

5日龄易感雏鸭(新型鹅星状病毒母源抗体均＜1:4)20只，随机分为A、B四组，每组10只。其中，A为免疫组，颈部皮下或肌肉注射实施例8制备的卵黄抗体，每只0.5ml；B为攻毒对照组，皮下或肌肉注射生理盐水，每只0.5ml。隔离饲养。

16小时后，A、B两组雏鸭分别肌肉注射用生理盐水做10倍稀释的新型鹅星状病毒，每只0.5ml。攻毒后观察10日，记录每组雏鹅发病、死亡情况。

结果：A组攻毒后10/10保护；B组攻毒12小时后开始发病，10日内死亡4只。

实施例10：卵黄抗体的应用

1.在对新型鹅星状病毒预防中的应用

以5日龄易感雏鸭(新型鹅星状病毒母源抗体均＜1:4)30只为试验对象，随机分为三组，每组10只。其中：

试验组：颈部皮下或肌肉注射实施例8制备的卵黄抗体，每只0.5ml；

对照组：以目前市售的禽星状病毒灭活疫苗对产蛋鸡进行免疫，并按实施例8的方法制备得到卵黄抗体，颈部皮下或肌肉注射该卵黄抗体，每只0.5ml；

空白对照组：皮下或肌肉注射生理盐水，每只0.5ml。

将上述三组雏鸭隔离饲养，16小时后，分别肌肉注射用生理盐水做10倍稀释的新型鹅星状病毒，每只0.5ml。攻毒后观察10日，记录每组雏鸭发病、死亡情况。结果见表2。

表2：

组别	攻毒毒株	预防保护
			试验组	新型鹅星状病毒	10/10
对照组	新型鹅星状病毒	7/10
			空白对照组	新型鹅星状病毒	5/10

注：预防保护为攻毒后健康存活雏鸭数/雏鹅总数。

由表2可以看出，本发明的卵黄抗体具有极佳的预防保护效力，对于该新型鹅星状病毒能够提供100％的预防保护，保护效力优于采用现有的灭活疫苗制备的卵黄抗体。

2.在对新型鹅星状病毒治疗中的应用

在新型鹅星状病毒感染发病区，症状为肾炎和内脏器官尿酸盐沉积，以病程相近的30只雏鸭为试验对象，随机分为3组，每组10只，全部隔离饲养，其中：

试验组：颈部皮下或肌肉注射实施例8制备的卵黄抗体，每只1.0ml；

对照组：以目前市售的禽星状病毒灭活疫苗对产蛋鸡进行免疫，并按实施例8的方法制备得到卵黄抗体，颈部皮下或肌肉注射该卵黄抗体，每只1.0ml；

空白对照组：皮下或肌肉注射生理盐水，每只1.0ml。

观察10日，记录每组雏鸭病情、死亡情况。

结果为：试验组注射卵黄抗体2天后，患病雏鸭的采食量开始增加，精神状态明显好转，10日内未有雏鸭死亡；10日后将其中1/2的雏鸭扑杀并解剖，结果发现患病雏鸭肾炎症状已基本消失。对照组注射卵黄抗体后，患病雏鸭的采食量和精神状态未有显著好转，从注射卵黄抗体第4日开始有患病雏鸭死亡，10日内患病雏鸭的死亡率为20％；10日后将存活的雏鸭扑杀并解剖，结果发现患病雏鸭表现轻度肾脏肿大。空白对照组的患病雏鸭10日内的死亡率达40％。

以上试验结果表明，本发明的卵黄抗体安全性好、预防效果好、治愈率高，可以用于新型鹅星状病毒感染的防治，具有重大的经济和社会效益。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 防治具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒的卵黄抗体及其制备方法

<130> 2020

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

attcttggct cggttgtc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctgtgttgc tccttctc 18

<210> 3

<211> 2115

<212> DNA

<213> ORF2基因

<400> 3

atggcagaca gggcggtggc cccgcgcgag aaggtgacca agaaggttac aaaagtagtc 60

accgttaaga aaaaacaccc aaagaagaaa ccaaagcaga aagtacataa accccaaaaa 120

ttacccatga aggccgagag gaagcttgag agagaagtga aaggtttgaa gaaaagagta 180

gctggaccac ccgttaatga caaaatgact accacgataa cacttggtca gatcactggg 240

aattcaacag acacactcga ccggaagcat aaatacttca caaatccact catgatgaaa 300

aaccaggaaa atgggcaaac agcaactcct ctaagtataa gggcctcaca atataacttg 360

tggaggatca gaaagctgca tatccgcctt gttccacttg ctggtagagc caatattctt 420

ggctcggttg tcttcctaga tatagaacag gaagctaaca cagctgggcc agagtccata 480

gataccataa aagctcggcc gcatcttgaa ctcccgattg gctcaaaaca tctttggagg 540

gttcaaccca ggctgatgca gggaccccgg caaggatggt ggaatgtaga ccccggggat 600

tcacccaccg actcacttgg tccagcaatc aatatgtgga catatttgaa aacagtaaat 660

gcactttcag cacgggcgca ggcacaacaa gttccctata cttctgccct cttcctggtt 720

gaagcaacgg tcacttatga gttctcgaac tatggtccaa agccagggct ctcactcatg 780

accagtgaaa cactttcagc atcagggaaa acggcaaccc ttgtaaatac ccaggatggt 840

gcacttgctt taacagttag tggcacattg cagagattcc tcgatgagaa ggagcaacac 900

aggcgcgtct caaatgcgca gacctctggt gtcggtgagg tgttttgggc tgtttccaca 960

gaagtggtcg agaccgtagc gagtgcactt ggaggctggg gttggctctt gaaaggagga 1020

tggttcgtga tcagaaaatt gtttggtgct gcttcaaatt ctggttccac ttatctgatc 1080

tattcctcag tttcagacgc ccagatagac agcaggattt atcagacagt tccaccgaac 1140

acgccactac agctggctgc aaaaacagtt aagcttgtac agctaacaca gccaaatgtg 1200

aatacaactg gacaaggtac cactgtcctt tcacgggatg ccgattacct gcctctgcca 1260

gtggcaccga tgcaggttac tccctcgctt gtgtacaact tccagggtga aaggcagagc 1320

actacagaat cgtgctcatt cctggtgttt ggaataccac aggcagaatc caggtcaaga 1380

tacaatgcaa atataacctt caatgttggc tatcgtggaa ggacttcaac atcatttaca 1440

cttggaacac acaattggtg ggctgttatg acactctcac aaacaggagt aatttttgca 1500

ccaccggctg tgggcacagg ggtctgtaat acattggcta cagccataca acacttaaac 1560

cctgagcttg aaacagcagt cctgcgtgtg aataccagta caacatctac tggtgggcta 1620

ataacggaac tcaggaatcg gctcaacatc gctgatgggg actatgtgat ttcaatgggt 1680

gatccgcaag gaaataggtc agcactgtac tttaggaatt cagaccagaa atgggtgtgg 1740

ctctgggctg gcgactctaa ccctggtgaa actttccaaa gttttaagat gccagtccta 1800

attaattggt cagtgtcaga ttcccaggaa caatataatg ctagagtcag gatggtacag 1860

tatgctaatg cacaacagca gactttgaca gaccctgagg aagatgatga tcccctctct 1920

gatgtcactt cgcttttcga tccaacagcg gaagatgaga ctgacttcca cctagcaggc 1980

tcgctcaaga cctctgacta cttaaaagaa gaggctgagt actggaaagc gaaggcgcag 2040

gccttgctta tggagaaggc actaagtgca ccacaagcag gggcagtccg ctttgagaag 2100

ggcggacatg agtga 2115

Claims

1.一种防治具有跨种传播能力的新型鹅星状病毒的卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体是以灭活的保藏编号为CCTCC NO：V202019的新型鹅星状病毒作为抗原制备的疫苗免疫蛋鸡，然后从高免鸡蛋蛋黄中提取纯化得到。

2.权利要求1所述的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)用制备的灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，制备高免蛋；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述灭活疫苗由如下方法制备而成：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述鹅星状病毒株病毒液中的病毒滴度为10^7.0-10^7.6TCID₅₀/0.1ml。

5.权利要求1所述的卵黄抗体在制备用于预防和/或治疗新型鹅星状病毒感染的制品中的应用；所述新型鹅星状病毒的保藏编号为CCTCC NO：V202019。

6.保藏编号为CCTCC NO：V202019的鹅星状病毒在制备防治雏鸭或雏鹅肾炎的卵黄抗体中的应用；所述雏鸭或雏鹅肾炎是由保藏编号为CCTCC NO：V202019鹅星状病毒引起的。