CN109265540A - 一种新型鹅星状病毒卵黄抗体的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种使用新型鹅星状病毒制备的卵黄抗体，本发明的卵黄抗体，是用保藏编号为CCTCC No：V201820的新型鹅星状病毒GD 0122株制备的灭活疫苗作为抗原制备的。本发明所制备的抗体，安全性良好，接种雏鹅后，未出现因注射抗体引起的任何局部和全身不良反应。采用抗体效价测定和攻毒保护试验对制备的抗体进行评价，结果显示：本发明中制备的抗体琼扩抗体效价均不低于1：16，注射抗体后雏鹅能够抵御强毒的攻击，说明本发明制备的抗体对鹅群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

Description

一种新型鹅星状病毒卵黄抗体的制备及其应用

技术领域

本发明属于免疫制品技术领域，具体涉及一种使用新型鹅星状病毒制备的卵黄抗体。

技术背景

痛风亦称尿酸盐沉积，肾病综合征，是由于体内尿酸产生过多或排泄障碍，造成体内大量尿酸蓄积，并以尿酸盐的形式沉积在关节、内脏器官浆膜面及其他组织间质，从而引起患禽运动迟缓、排白色稀粪、厌食、衰竭，甚至死亡，是特殊种类的蛋白质代谢紊乱性疾病。

当前鹅痛风主要发生在雏鹅，5～15日龄多发，有时可见1日龄雏鹅发病，多种品种鹅均可发病，死亡率在30％～70％，发病前2～3天病鹅排石灰样稀便，脱水变瘦，然后大群出现精神沉郁、减料、干脚、脱水、呼吸困难等症状。剖检可见心包由白色尿酸盐包被，俗称“绒毛心”，肝脏、气囊浆膜面及关节处均有白色尿酸盐沉积，肾脏肿大、斑驳，输尿管扩张并有尿酸盐沉积。

引起雏鹅痛风的诱因很多，通常认为与饲料蛋白含量过高、肾功能不全、引种、饲养管理不当等有关，但最近研究发现排除这些因素后，还是会发生痛风，将病死鹅剖检脏器进行触片染色，经革兰氏染色和瑞氏染色后镜下观察未发现细菌。刮取肠内容物，生理盐水涂片，置低倍镜下观察，未见球虫卵囊。取气囊及关节处石灰样物做涂片，置低倍镜下观察，可见大量针尖大小的尿酸盐结晶物。根据养殖户描述、临床症状、剖检病变，初步诊断为疑似鹅病毒性感染引发破坏肝肾功能，导致尿酸盐沉积。

通过对雏鹅痛风的流行病学调查，发现该病在我国鹅群中发病率呈日益上升趋势。基于目前，国内外没有预防和治疗该病的商品化疫苗(或抗体)，该病还在不断蔓延。研制安全有效的疫苗及预防和治疗用卵黄抗体迫在眉睫，必须通过创新技术克服这一问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用新型鹅星状病毒制备的卵黄抗体，制备的卵黄抗体能有效的预防雏鹅痛风，从而弥补现有技术的不足。

本发明的卵黄抗体，是用保藏编号为CCTCC No：V201820的新型鹅星状病毒GD0122株制备的灭活疫苗作为抗原制备的；

其中新型鹅星状病毒GD 0122株，于2018年5月13日保藏在武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：V201820。

本发明的卵黄抗体，其一种具体的制备方法如下：

1)对产蛋鸡进行免疫

用GD 0122株制备的灭活疫苗进行免疫；具体如下：

基础免疫 每只鸡胸部肌肉注射疫苗0.5ml；

二次免疫 在基础免疫后14日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.0ml；

三次免疫 在二次免疫后14日进行第3次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.0ml；

维持免疫：当卵黄中鹅星状病毒琼扩抗体效价1:96时，维持接种1次，每只鸡胸部肌肉注射疫苗1.0ml；

收蛋：三次强化免疫后10日，抽样取蛋，分离卵黄，提取抗体，鹅星状病毒琼扩抗体效价≥1:64为合格，收集高免鸡蛋。

2)抗体制造

收集蛋黄将蛋黄液加入巴氏灭菌罐中，加入适量的注射用水，搅拌混匀后，加热至65℃，保温灭活15分钟，灭活结束后，水浴冷却至30℃以下；

于酸化反应罐中加入相当于原蛋黄体积4倍的注射用水，用1mol/L HCL溶液调节pH值至4.2，并将水温降至2～4℃，然后将灭活I的蛋黄液加入，边加边搅拌，4～8℃保温静置4小时；

将酸化萃取液冷冻离心，去沉淀，取上清液备用；

加入辛酸至终浓度0.02％，搅拌混匀，室温放置4小时；用K型多层板框过滤澄清；

按终浓度0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封60分钟；

用截留分子量为1000KD的超滤膜过滤除病毒；

加入吐温-80至终浓度0.02％，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值6.8；

将调配合格的抗体用0.22um微孔滤膜进行过滤除菌，无菌分装，100ml/瓶，即为雏鹅痛风精致卵黄抗体。

本发明所提供的抗体用于预防和治疗雏鹅痛风。

本发明所制备的抗体，安全性良好，接种雏鹅后，未出现因注射抗体引起的任何局部和全身不良反应。采用抗体效价测定和攻毒保护试验对制备的抗体进行评价，结果显示：本发明中制备的抗体琼扩抗体效价均不低于1：16，注射抗体后雏鹅能够抵御强毒的攻击，说明本发明制备的抗体对鹅群能够提供有效的免疫保护，具有很好的商品化开发前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1 GD 0122株的分离与鉴定

1、流行病学调查 自2017年10月份以来，广东、四川、湖北等地区的雏鹅出现了一种死亡率较高、痛风症状明显的传染性疾病。该病多发于5～15日龄雏鹅，各种品种鹅均易感，对病死的雏鹅进行剖检，主要的病理变化如下：心包增厚，有白色结晶物附着或包被，俗称“绒毛心”，肝脏被尿酸盐覆盖，输尿管变粗、代谢受阻，肾脏红肿或苍白肿大、花斑肾，直肠末端内容物白色稀粪积聚，脾脏肿大，肠壁变薄，严重的病例可见关节红肿、关节腔内有尿酸盐沉积。发明人从广东、四川等地采集发病鹅的病料进行实验室检测及病原分离鉴定，初步诊断为新型鹅星状病毒。最后成功从广东某鹅场的10日龄发病鹅群中分离出一株病毒。

2、病毒分离 选取发病症状典型的病死鹅肝脏、脾脏、肾脏，胰腺等组织50～100g，用研钵研磨组织，按1∶5(w/v)比例加含双抗(含1000U青霉素/ml+1000ug链霉素/ml)的无菌PBS(0.1mol/L，pH值7.2)匀浆，反复冻融3次后6000r/min离心10分钟，取上清液经0.22um滤器过滤除菌，无菌检验合格后保存备用。将病毒过滤液接种12～13日龄鹅胚，每胚0.2ml，36～37℃孵育，每日照胚2次，弃去24小时内死亡的鹅胚，收获24～168小时死亡鹅胚和168小时存活鹅胚尿囊液，置2～8℃冷却12～24小时，收获鹅胚尿囊液。

3、病毒的鉴定

3.1血凝性鉴定 分别无菌采集SPF鸡和鹅血液5ml，按照2015版《中国兽药典》方法分别制备成0.8％、1％和2％浓度的红细胞悬液，4℃保存备用。将收获的鹅胚病毒液进行HA效价测定，检测分离毒株是否具有凝集这些红细胞的特性。结果：分离毒不能凝集SPF鸡和鹅红细胞，即使改变红细胞悬液的浓度，也不能使之凝集，红细胞对照成立。

3.2理化特性检验 病毒液分别经氯仿、乙醚、盐酸(pH3)、温度(50℃、1小时)处理后，接种12日龄鹅胚(0.2ml/胚)，另设生理盐水处理组作为对照。37℃培养7日。结果：分离毒经乙醚、氯仿和盐酸(pH3)处理的毒株，不影响病毒鹅胚中的增殖，鹅胚出现死亡，PCR检测结果阳性，表明病毒没有脂质囊膜，对乙醚和氯仿有抵抗力，耐酸。病毒对热处理稳定，能抵抗50℃、1小时。分离毒株的核酸类型为RNA。

3.3 PCR鉴定 取分离株病毒200ul，利用RNA提取试剂盒提取病毒RNA，DNA提取试剂盒提取病毒DNA，RNA反转录后，PCR检测鹅副粘、H5、H7、H9亚型禽流感、呼肠孤病毒及星状病毒，DNA PCR检测圆环病毒、禽腺病毒、小鹅瘟、番鸭细小病毒。PCR结束后1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

PCR反应体系：总体积25ul

在0.5m1 PCR管中依次加入

10×Ex Taq Mix-----------------12.5u1

上游引物(20pmol)---------------1u1

下游引物(20pmol)---------------1u1

DNA----------------------------2ul

用灭菌去离子水8.5ul补足至总体积25u1，PCR反应在PTC-100基因扩增仪内进行。PCR反应参数：预变性条件为94℃，3分钟，变性条件为94℃，30秒，退火温度和时间为50℃，30秒，延伸温度为72℃延伸45秒，35个循环，最后72℃延伸10分钟。

经扩增，分离毒株仅扩增出了星状病毒相应的目的片段，与预期目的片段大小相符。鹅副粘、H5、H7、H9亚型禽流感、呼肠孤病毒、圆环病毒、腺病毒、小鹅瘟、番鸭细小病毒等检测均为阴性。对扩增的目的片段进行测序后，通过NCBI BLAST比对分析，分离毒与NCBI公布的星状病毒序列同源性最接近，但也存在较大的差异，同源性仅有60％左右，表明所筛选的病毒为一种新型的病毒。

3.4病毒致病性

3.4.1对鸡的致病性 将GD 0122株分别以静脉注射和胸部肌肉途径接种7日龄SPF鸡各5只，1.0ml/只，观察14日，SPF鸡均健活，无任何临床表现，攻毒后14日剖检，未见任何病变。

3.4.2对鸭的致病性 将GD 0122株分别以静脉注射和胸部肌肉途径接种2日龄雏鸭，1.0ml/只，观察14日，雏鸭均健活，无任何临床表现，攻毒后14日剖检，未见任何病变。

3.4.3对雏鹅的致病性 将GD 0122株以肌肉注射途径接种2日龄雏鹅10只，1.0ml/只，雏鹅在攻毒后第4日开始出现死亡，死亡高峰集中在攻毒后7～9日，死亡率可达到8/10，发病雏鹅排白色稀粪，剖检病死雏鹅，可见肾脏发白或斑驳，输尿管肿大，肝脏遍布白点，严重者可见心包外尿酸盐沉积，在关节处出现干酪样尿酸盐沉积。

3.5病毒免疫原性检验 将继代后的病毒液经纯化进行了免疫原性试验。该毒株制成灭活疫苗免疫成年雌性种鹅，免疫后2月龄所产子代均能够产生完全的攻毒保护，说明该毒株是一株理想的抗原。

3.6病毒特异性与中和效果检验 该毒株和同期分离的其他流行毒株经继代和纯化制成灭活疫苗，分别免疫30日龄SPF鸡，首免剂量0.5ml/只，加强免疫剂量为1.0ml/只，每隔2周免疫一次，共免疫3次，3免后10天进行采血,分离血清，经56℃灭活1小时进行特异性试验。

将GD 0122株病毒液10倍稀释，分别与该毒株和流行株的阳性血清等体积混合，37℃中和1小时后，接种12日龄鹅胚，0.2ml/枚，接种后观察168小时。结果发现该病毒的阳性血清中和组鹅胚全部健活，其他流行株的阳性血清中和组仅70％～80％健活，未加血清中和的病毒组鹅胚全部死亡，说明本发明筛选的毒株作为抗原制备的阳性血清对本发明筛选的病毒的中和能力明显好于流行毒株制备的阳性血清。

实施例2疫苗的制备

GD 0122株毒种的制备

将GD 0122株毒种10倍稀释，接种12～13日龄健康鹅胚，0.2ml/胚，置60％湿度、37℃温箱内培养168小时，24小时内死亡的鹅胚弃去，24～168小时死亡的鹅胚随即取出，置4℃保存，至168小时，将未死亡胚全部取出，4℃存放12～24小时后，收取鹅胚尿囊液。依此方法将上述收获的鹅胚尿囊液继续在12～13日龄鹅胚中继代5代，分别标记为D2～D6代。测定每代次病毒含量。将检验无菌且病毒含量≥10^5.0TCID₅₀病毒液混合，定量分装，冻干保存。

GD 0122株抗原的制备

1、接种 取GD 0122株毒种，用灭菌PBS(0.1mol/L，pH值7.2)作10倍稀释，尿囊腔途径接种12～13日龄健康鹅胚，0.2ml/胚，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

2、孵育和观察 鹅胚接种后，每日照胚2次，将24小时前死亡的鹅胚弃去。直至168小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。

3、收获 将冷却的鹅胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌方法剥除气室部卵壳，揭去卵膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，吸取胚液。在吸取胚液前对每个鹅胚仔细检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，都弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干个鹅胚分为一组，吸取胚液放入同一灭菌的容器内，置-20℃保存。

GD 0122株病毒液的灭活及半成品检验与疫苗的制备

1灭活 将GD 0122株病毒液导入灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后导入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。4℃灭活36小时，如有剩余放2～8℃保存，应不超过1个月。

2半成品检验

2.1无菌检验 取灭活的病毒液，按2015年版《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

2.2灭活检验 将灭活后的病毒液，接种12～13日龄鹅胚5枚，0.2ml/胚，每日照胚2次，观察7日，收获鹅胚尿囊液，PCR检测阴性，然后将胚液再盲传一次，观察7日，PCR检测仍未阴性时，认为灭活完全。

2.3病毒含量测定 将毒种用灭菌PBS(0.1mol/L，pH值7.2)进行10倍系列稀释，取10^－3、10^－4、10^－5、10^－64个稀释度，分别接种于12～13日龄鹅胚，每个稀释度接种5枚，每胚0.2ml。同时设病毒阳性对照和PBS阴性对照，置60％湿度、37℃培养箱培养和观察168小时，鹅胚死亡或活胚PCR检测阳性者判为感染，计算EID₅₀。

3灭活疫苗的制备

取灭活的抗原液与SEPPIC ISA71油佐剂按适当比例进行乳化，先开动电机低速搅拌ISA71佐剂2分钟，同时徐徐加入抗原液，10000r/min，乳化15分钟，即成油乳剂灭活疫苗。

4分装 定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。

实施例3：新型鹅星状病毒精制卵黄抗体制造及检验

1高免鸡蛋的生产

1.1产蛋鸡应具有商品蛋鸡的生产性能。

1.1.1无禽白血病和禽流感感染 按鸡群0.5％抽样采血，应全部为阴性。

1.1.2鸡白痢和鸡支原体 按NY/T536-2002《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》和NY/T553-2002《禽支原体病诊断技术》进行检测，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率应≤0.1％。

1.1.3产蛋鸡的饲养管理 鸡场建设必须符合兽医卫生防疫规范要求。鸡场应离交通要道500米以上，进、出口道路应分开。场内料、粪道路分开。鸡场进出口应设有消毒池。育雏舍与成鸡舍应设隔离带。此外，鸡场应具备粪污处理设施，实施全进全出制，鸡场饮水应达到卫生标准，饲养人员应卫生健康。

1.1.4鸡的疫病防治 根据当地疫病发生的实际情况，按科学免疫程序适时接种相关疫苗，根据情况需要，按常规在饲料中添加抗菌药物防治细菌感染及添加抗球虫药预防球虫感染等。

1.1.5鸡的日龄 100～150日龄。

1.2鹅星状病毒灭活疫苗免疫

基础免疫 每只鸡胸部肌肉注射疫苗0.5ml；

二次免疫 在基础免疫后14日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.0ml；

三次免疫 在二次免疫后14日进行第3次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.0ml；

维持免疫：当卵黄中鹅星状病毒琼扩抗体效价1:96时，维持接种1次，每只鸡胸部肌肉注射疫苗1.0ml。

收蛋 三次强化免疫后10日，抽样取蛋，分离卵黄，提取抗体，鹅星状病毒琼扩抗体效价≥1:64为合格，收集高免鸡蛋，4～8℃贮存，应不超过10日。

2抗体制造

2.1蛋壳消毒

将高免蛋浸入42℃的0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，蛋壳污染严重的，事先选出，单独消毒并用清水冲洗干净后，再浸泡消毒一次。随后，鸡蛋浸入95℃以上的水浴中消毒5秒钟，取出后晾干或吹干备用。

2.2分离蛋黄 手工或机械打蛋，充分除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集蛋黄。

2.3灭活I

将蛋黄液加入巴氏灭菌罐中，加入适量的注射用水，搅拌混匀后，加热至65℃，保温灭活15分钟，灭活结束后，水浴冷却至30℃以下。

2.4酸化萃取

于酸化反应罐中加入相当于原蛋黄体积4倍的注射用水，用1mol/L HCL溶液调节pH值至4.2，并将水温降至2～4℃，然后，将灭活I的蛋黄液加入，边加边搅拌，4～8℃保温静置4小时。

2.5离心分离 将酸化萃取液冷冻离心，去沉淀，取上清液备用。

2.6灭活II加入辛酸至终浓度0.02％，搅拌混匀，室温放置4小时。

2.7深滤 用K型多层板框过滤澄清。

2.8灭活III按终浓度0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封60分钟。

2.9超滤除病毒 用截留分子量为1000KD的超滤膜过滤除病毒。

2.10调配总混 加入吐温-80至终浓度0.02％，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值6.8。

2.11除菌过滤 将调配合格的抗体用0.22um微孔滤膜进行过滤除菌，无菌分装，100ml/瓶，即为雏鹅痛风精致卵黄抗体。

3抗体检验

3.1纯净性 按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，无细菌、支原体和外源病毒污染。

3.2辛酸及甲醛残留 分别按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，应符合规定。

3.3安全性检验 1日龄健康雏鹅10只，每只皮下注射1.0ml，观察14日，全部健活。

3.4效力检验

3.4.1抗体琼扩效价检测 按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测抗体琼扩抗体效价，记录抗体结果。

3.4.2免疫攻毒法 用2日龄雏鹅30只，随机分成3组，每组10只，1组为接种抗体组，每只皮下注射抗体1.0ml，2组为市售某抗体制品，每只皮下注射抗体1.0ml，3组为攻毒对照组，每只皮下注射生理盐水1.0ml，3组雏鹅分别在接种后24小时进行攻毒，每只鹅肌肉注射鹅星状病毒GD 0122株0.5ml/只，连续观察14日，比较3组雏鹅发病死亡情况。

结果可见：1、琼扩抗体效价测定结果显示3批鹅星状病毒琼扩抗体效价均不低于1:16；

2、免疫攻毒结果显示，2日龄雏鹅接种抗体后，3批抗体接种组攻毒后，均能提供8/10以上的保护，市售某抗体攻毒后，能提供7/10的保护，而生理盐水对照组攻毒后8/10发病死亡，剖检病死鹅，可见肾脏发白肿大，肝脏有白点，脾脏肿大，个别鹅可见心包出现白色被膜，关节处干酪样尿酸盐沉积。

表1抗体效价及攻毒保护结果

用GD 0122株制备的抗体的免疫效果明显好于市售的抗体，推测是由于鹅星状病毒基因发生变异导致。

鹅胚中和试验：用制备的抗体和市售某抗体分别与GD 0122毒株进行中和，37℃中和1小时后接种12日龄鹅胚，观察168小时，结果可见制备的抗体中和组鹅胚均≥90％存活，而市售抗体中和组鹅胚60％存活，说明本发明制备的抗体对该毒株的中和效果要明显好于市售抗体。

表2中和试验结果

Claims (3)

1.一种卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体是用保藏编号为CCTCC No：V201820的新型鹅星状病毒GD 0122株制备的灭活疫苗作为抗原制备的。

2.如权利要求1所述的卵黄抗体，其特征在于，所述的卵黄抗体的制备方法如下：

1)对产蛋鸡进行免疫

用GD 0122株制备的灭活疫苗进行免疫；具体如下：

基础免疫每只鸡胸部肌肉注射疫苗0.5ml；

二次免疫在基础免疫后14日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.0ml；

三次免疫在二次免疫后14日进行第3次接种，每只鸡胸部肌肉注射1.0ml；

维持免疫：当卵黄中鹅星状病毒琼扩抗体效价1:96时，维持接种1次，每只鸡胸部肌肉注射疫苗1.0ml；

收蛋：三次强化免疫后10日，抽样取蛋，分离卵黄，提取抗体，鹅星状病毒琼扩抗体效价≥1:64为合格，收集高免鸡蛋；

2)抗体制造

收集蛋黄将蛋黄液加入巴氏灭菌罐中，加入适量的注射用水，搅拌混匀后，加热至65℃，保温灭活15分钟，灭活结束后，水浴冷却至30℃以下；

于酸化反应罐中加入相当于原蛋黄体积4倍的注射用水，用1mol/L HCL溶液调节pH值至4.2，并将水温降至2～4℃，然后将灭活I的蛋黄液加入，边加边搅拌，4～8℃保温静置4小时；

将酸化萃取液冷冻离心，去沉淀，取上清液备用；

加入辛酸至终浓度0.02％，搅拌混匀，室温放置4小时；用K型多层板框过滤澄清；

按终浓度0.05％加入甲醛溶液，充分搅拌混匀，密封60分钟；

用截留分子量为1000KD的超滤膜过滤除病毒；

加入吐温-80至终浓度0.02％，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值6.8；

将调配合格的抗体用0.22um微孔滤膜进行过滤除菌，无菌分装，100ml/瓶，即为雏鹅痛风精致卵黄抗体。

3.权利要求1所述的卵黄抗体在制备预防和治疗雏鹅痛风的制品中的应用。