CN106065030A - 鸡包涵体肝炎的卵黄抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了鸡包涵体肝炎的卵黄抗体及其制备方法，卵黄抗体为含有鸡包涵体肝炎病毒株，所述病毒为禽腺病毒I群血清4型病毒，命名为SDJ15‑8，其保藏号为CCTCC NO:V201636，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心。制备方法包括以下步骤：1)用鸡包涵体肝炎病毒株SDJ15‑8制成灭活疫苗；2)步骤1)制备的灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，制备高免蛋；3)由高免蛋收集卵黄用酸化水‑辛酸的方法萃提、灭活后制备成鸡包涵体肝炎的卵黄抗体。该卵黄抗体能够有效预防与治疗鸡包涵体肝炎，治愈率达到82％以上。

Description

鸡包涵体肝炎的卵黄抗体及其制备方法

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸡包涵体肝炎的卵黄抗体及其制备方法。

背景技术

鸡包涵体肝炎特征为病鸡死亡突然增多，严重贫血、黄疸，肝肿大，有出血和坏死灶，心包积液。本病多发于4-10周龄的鸡，5周龄鸡最易感，产蛋鸡则很少发病，肉鸡多发。该病的致病原属于禽腺病毒I群，有12个血清型，1951年美国首次报道该病，随着我国鸡养殖业的快速发展，近年来该病在我国肉鸡养殖区呈局部流行趋势，通过对万方和维普数据库搜索，近2年该病以血清4型流行为主。该病目前无疫苗预防，肉鸡临床发生包涵体肝炎时常见的抗病毒和抗菌治疗效果不佳，治愈率低于40％，耐过鸡发育受阻，与正常肉鸡比较，料肉比高7-13％，出栏时间延长7-12天，发育不整齐，严重影响经济效益。

卵黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，由于卵黄中仅有IgG类抗体，故称其为卵黄免疫球蛋白IgG(egg yolkimmunoglobulins)，简称为IgY。卵黄抗体的研究始于19世纪末，1893年，Klemperer发现了卵黄中富含抗体；1934年Jukes的实验证明母鸡血清中的抗体可以转移到卵黄中，从而为雏鸡提供被动免疫保护。Patters等的试验证实，相对别的血浆蛋白，IgG被选择性的转运到卵泡中。1969年，Leslie和Clem将这种抗体命名为IgY。

卵黄抗体在多种环境中有较高的稳定性，在低于75℃条件下，卵黄抗体具有良好的热稳定性，90℃处理15min后，大部分卵黄抗体丧失结合活性，在pH＜4时，仅有少量卵黄抗体失去活性。在pH4-12范围内，卵黄抗体的活性几乎不受影响，在pH＞12时，卵黄抗体迅速失去结合活性。实验表明，卵黄抗体具有耐受反复冻融的特性，即使经过5次冻融，其抗原结合活性几乎不受影响。

对于鸡包涵体肝炎的预防和治疗，目前除了加强消毒和疫苗免疫外，抗体免疫也在控制该病的流行中发挥着重要作用。

发明内容

为解决现有鸡包涵体肝炎没有有效抗体的问题，本发明提出一种鸡包涵体肝炎的卵黄抗体，该卵黄抗体能够有效预防与治疗鸡包涵体肝炎，治愈率达到82％以上。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种鸡包涵体肝炎的卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体为含有鸡包涵体肝炎病毒株，所述病毒为禽腺病毒I群血清4型病毒，命名为SDJ15-8，其保藏号为CCTCC NO:V201636，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心。

本发明的另一个目的是提供一种鸡包涵体肝炎的卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

1)用鸡包涵体肝炎病毒株SDJ15-8制成灭活疫苗；

2)步骤1)制备的灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，制备高免蛋；

3)由高免蛋收集卵黄用酸化水-辛酸的方法萃提、灭活后制备成鸡包涵体肝炎的卵黄抗体。

进一步，所述步骤1)鸡包涵体肝炎病毒株SDJ15-8是被甲醛灭活的。

进一步，所述步骤1)灭活疫苗制备包括以下步骤：

a、接种：将鸡包涵体肝炎病毒株SDJ15-8用灭菌生理盐水稀释后经卵黄囊接种于SPF鸡胚，37℃进行静置孵化，收集48～120小时内死亡的鸡胚，收获尿囊液；

b、向步骤a中的尿囊液中加入终浓度为0.1wt％甲醛溶液，灭活后，离心去沉淀物，将上清液浓缩制得鸡包涵体肝炎病毒株SDJ15-8抗原；

c、按常规法制备成油佐剂灭活疫苗。

进一步，所述步骤b的浓缩倍数为15倍。

本发明制备的鸡包涵体肝炎病毒血清4型精制卵黄抗体，用于预防：在鸡高发该病的日龄，保护率96％以上。用于治疗：1次用药，治愈率达到82.0％以上，配合抗生素，治愈率大于87.5％，病鸡愈后发育良好，不影响养殖经济效益。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为PCR产物凝胶电泳图；

图2为鸡包涵体肝炎卵黄中和抗体效价变化趋势。

具体实施方式

实施例1

病毒株的分离与鉴定

1.1病毒分离

2014年3月，从山东济南市章丘市辛寨镇大高村肉鸡养殖场采集临床诊断为鸡包涵体肝炎的死亡鸡肝脏，按质量体积比1:5(W/V)用生理盐水匀浆，于-20℃和4℃反复冻融2次，在4℃条件下12000rpm离心30分钟，收集上清液，过滤除菌，分装，-40℃保存。同时取样，按现行《中华人民共和国兽药典》方法进行无菌检验合格。

1.2PCR鉴定

1.2.1引物设计

根据Genbank上鸡包涵体肝炎I群基因序列，设计一对引物，目标片段约1300bp，引物序列如下：

FAdvF1:5’-atgctccgagcccctaaaagaagacattcc-3’(见SEQ ID NO:1所示)；

FAdvR1:5’-ttacgggagggagcccgctggacagctgtagagc-3’(见SEQ ID NO:2所示)。

1.2.2PCR

1.2.2.1模板制备

取1.1中病料上清液，参照DNA提取试剂盒方法，提取DNA作为模板。

1.2.2.2PCR反应体系及条件

反应体系：ddH2O 13μl,模板2μl，上下游引物各1μl，25mM MgCl22.5μl,dNTPMixture 2.5μl，γTaq酶0.5μl。

反应条件：94℃5min，94℃40s，54℃50s，72℃50s，30循环，72℃10min。

反应结束后，取PCR产物进行凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察，扩增出约1300bp的目的条带(图1)，其中M为DNA Marker DL2000，1和2泳道为PCR产物，3泳道为阴性对照。

1.2.2.3测序

剩余PCR产物送哈尔滨博仕生物科技有限公司进行测序，结果如下：atcatggttccgctgttgtttggattaaaaatgctcgcgttcgtgcactgcagactatagcatagaagggtgtatcgctctccggaggccgaaaccggcacggggaggacgcggatccctatgtttcccgggttccaggcacctgttaccaccgggctgaacacttggaattccccgatggatggttcatagtatccattggccgagtacgtccatgggctggtcacgctcctattggccatgggttcaaagtccgtgagggtggcggtggaggggctgaccgttcccgcttgaatcccggaggggttgcattgctggagataggcggacacccaaaaggtgaaccatttggcattggcggagttgaggtccccagggcgattccccatggtggcgctgtccaatttcaagtagagggaggtaacaaggagcccctgtatgttccactgttgaaggtagtaggcgcaagagaaggcgttcgcgctggaattgacggtcgtggcattgtaggtgttgaggctgggacttcccgagacaaaagtagcgatgggtgtggagacgctcccccctccgaccacggttaaagcgcccgcggtcaccgctagggtattagtgtcgtacttcagccctaggccattggcggagaccgtaagcggtccgctgggatccggtttcacttccagagtgttgttgacaatctgtaggctttcatccacggaaacgcccactcccgaactgtcggcttggatgcctccctgcgcttttaggttgagttccagcactccgcttccggtcgaggtgttgaccgtgaacatgttaggattgatctcgaggtcgataccactgctatcggcagtgatgggtccttgttggttgaggtgtacgcccagttctccctgatccacgagcaaggtgtcgtccacgctgacccccagtccacccgcggtggaatccaatccgccggacgggtcgacttttacggccagttcccagtcatcgttgaccattacggtcactccgtcgaccttgacgtccagtccatcgggggtgatgtccagggccccttcggggtcaacggccaccgccagttgaccttgggcgttgacatcgagactggggtcgtgggccaagtccaccgatctgttcttgatgatgatgggatcggtgacgttgagcgtaagctgtccgccctggtccactaggggtcctgagcctcccaaaaaaggcgggttgagccctccgacggggtcggccacgtaatcgaaaggataaaccaggtcaagctgggatgctctcaccatgcgtttggcgcgcttgattggagccggggaaggtcccgctcgg

1.2.2.4序列比对

核酸序列与Genbank上禽腺病毒I群血清4型同源性为99％，证明分离到的病毒为禽腺病毒I群血清4型。

1.3命名

根据基因测序时间，将分离到的病毒命名为鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株，该毒株部分基因序列在Genbank注册号为KU589231，其保藏号为CCTCCNO:V201636，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心。

实施例2

病毒的传代培养及鉴定

2.1传代培养

鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株病料上清液用生理盐水10倍稀释，经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚，0.1ml/胚，收集接种24-120小时死亡鸡胚尿囊液，标记为鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株E1，无菌检验合格后再连续传代培养，病毒传代培养过程中，根据各代病毒接种后鸡胚死亡时间段，适当调整病毒得稀释倍数，直至在接种后60％以上鸡胚死亡时间段集中在60-92小时止。病毒传代至第7代时，70％以上鸡胚死亡时间段集中在60-92小时，收集尿囊液，标记为鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株E7，无菌检验合格，于-40℃保存。

2.2鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株E7鉴定

2.2.1血凝性

按照现行《中华人民共和国兽药典》中方法制备1％鸡红细胞悬液，以新城疫病毒(Losta株，HA为1:210)为阳性对照，参照现行《中华人民共和国兽药典》中96孔微量板法进行检测,室温放置20～40分钟，当阴性对照孔中红细胞呈纽扣状时判定结果。阳性对照和阴性对照成立，结果为E7无血凝性。

2.2.2病毒含量

E7用生理盐水10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6和10-7 4个稀释度接种7日龄SPF鸡胚，每个稀释度各接种5枚，0.1ml/胚，用蜡封孔，于37.5℃静置孵化，24小时以前死亡的鸡胚弃去不计，收集24～168小时死亡鸡胚，按Reed-Muench法计算病毒含量为10-5.75ELD50/0.1ml。

2.2.3纯净性

E7按照现行《中华人民共和国兽药典》进行细菌、支原体和外源病毒检验合格。

2.2.4特异性

E7用生理盐水稀释至200ELD50/0.1ml，与等量抗鸡包涵体肝炎特异性血清混合，37℃水浴中和1小时，尿囊腔接种7日龄SPF鸡胚10枚，0.1ml/胚；同时设病毒对照10枚，接种同条件处理的病毒与生理盐水混合液0.1ml/枚，上述鸡胚用蜡封孔，于37℃静置孵育，观察至168小时。中和组鸡胚全部健活，对照组鸡胚全部死亡。说明病毒能被抗鸡包涵体肝炎抗体中和。

2.2.5免疫原性

2.2.5.1鸡包涵体肝炎油乳剂灭活疫苗制备

2.2.5.1.1油相制备 取注射白油94.0ml，加入硬脂酸铝2.0g，边加边搅拌，而后加热直至完全透明，再加入6.0ml司本-80，充分混匀，高压灭菌备用。

2.2.5.1.2水相制备 E7含毒尿囊液96.0ml，加入终浓度为0.2％的甲醛，37℃灭活24小时，期间振摇4～6次，而后加入4.0ml灭菌吐温-80，充分振摇后使吐温-80完全溶解。

2.2.5.1.3乳化 将油相导入胶体磨乳化1分钟后缓慢加入水相，水相全部加入后再乳化3～5分钟。

2.2.5.1.4分装 定量分装，加盖密封,2-8℃保存。

2.2.5.2检验

2.2.5.2.1外观 为乳白色均匀乳剂。

2.2.5.2.2剂型 油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，除第一滴外，应呈油滴状，不扩散。

2.2.5.2.3稳定性 吸取疫苗加入离心管中，3000转/分钟离心15分钟，应不出现分层。

2.2.5.2.4黏度 按现行《中华人民共和国兽药典》检验，应符合规定。

2.2.5.2.5无菌检验 按现行《中华人民共和国兽药典》检验，应无菌生长。

2.2.5.2.6安全检验 疫苗皮下或肌肉注射4～5周龄SPF鸡10只，2.0ml/每只。饲养观察14日，应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。

2.2.5.3免疫接种

疫苗按如下免疫程序接种90～120日龄SPF鸡10只，同时设5只对照，不做任何处理，免疫程序如下：

基础免疫 每只鸡腿部肌肉注射油乳剂灭活疫苗0.5ml。

加强免疫 在基础免疫后21日进行第2次接种，每只鸡胸部肌肉注射油乳剂灭活疫苗1.5ml。

强化免疫 在加强免疫后10日进行第3次接种，每只鸡颈背部皮下注射油乳剂灭活疫苗2.0ml。

2.2.5.4抗体效价检测

强化免疫后14日宰杀试验组和对照组的鸡，分别分离血清，按组混合，按现行《中华人民共和国兽药典》的中和试验法检测血清中鸡包涵体肝炎特异性抗体效价。结果为：试验组中和抗体效价为1:320，对照组中和抗体效价＜1:4。结果说明鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株免疫原性良好。

实施例3

鸡包涵体肝炎病毒血清4型精制卵黄抗体制备

3.1抗原制备

3.1.1接种 将鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株E7用灭菌生理盐水作15000倍稀释，经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，用蜡封孔，于37℃静置孵化。

3.1.2孵育和观察 弃去48小时前死亡的鸡胚，以后每隔6小时照蛋1次，收集48～120小时内死亡的鸡胚，于2～8℃冷藏12～24小时。

3.1.3收获 鸡胚用碘酊消毒蛋壳表面气室部，无菌操作除去气室部蛋壳，收获尿囊液，分组置于无菌容器内，标记为鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株E8，置-20℃及以下温度保存。

3.2抗原检验

3.2.1无菌检验 将E8以瓶为单位，按现行《中华人民共和国兽药典》附录检验，应无细菌生长。

3.2.2病毒含量 为10^-5.50ELD50/0.1ml。

3.3抗原灭活与浓缩 将检验合格的E8加入终浓度为0.1％甲醛溶液(含36～40％甲醛)，密闭后置37℃灭活24小时(其间4～6小时振摇1次，每次3分钟)后，经4000转/分钟离心20分钟，弃去沉淀物，分成2份。将2份上清液用截留分子量为10KD的中空纤维超滤器分别浓缩10倍和15倍，即为制备疫苗用抗原，分别标记为鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株抗原1和抗原2。

3.4抗原灭活检验

3.4.1无菌检验

鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株抗原1和抗原2按现行《中华人民共和国兽药典》检验，应无细菌生长。

3.4.2灭活检验

鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株抗原1和2分别经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.1ml，用蜡封孔，37℃静置孵化，观察至168小时，SPF鸡胚应全部健活，胚体无鸡包涵体肝炎感染导致的典型病变。

3.5油乳剂灭活疫苗的制备及检验

取鸡包涵体肝炎病毒SDJ15-8株抗原1和2，按2.2.4.1制备油乳剂灭活疫苗，分别标记为鸡包涵体肝炎病毒油乳剂灭活疫苗1和2，按2.2.4.2检验合格。

3.6鸡包涵体肝炎病毒血清4型油乳剂灭活疫苗1和2免疫后抗体效价监测

120日龄商品蛋鸡(按鸡群0.5％抽样采血检测，应无禽白血病和禽网状内皮增生症，鸡白痢和鸡支原体阳性率应≤0.1％)100只，分为2组，每组50只，分别用鸡包涵体肝炎病毒油乳剂灭活疫苗1和2按2.2.4.3免疫。3次免疫后1周收集高免鸡蛋，分离卵黄，按卵黄与注射用水(V/V)1:3稀释，充分搅拌，加入终浓度20％的氯仿，剧烈震荡20分钟，4000转/分钟离心20分钟，收集上清，过滤除菌，按现行《中华人民共和国兽药典》的中和试验法检测上清中鸡包涵体肝炎特异性抗体效价。结果：鸡包涵体肝炎病毒油乳剂灭活疫苗1和2免疫鸡所收集高免鸡蛋的鸡包涵体肝炎卵黄中和抗体效价分别为1:320和1:640。随后每隔1周收集高免鸡蛋1次，检测鸡包涵体肝炎卵黄中和抗体效价直至第8周，具体的中和抗体效价变化趋势见图2。分析图2结果，鸡包涵体肝炎病毒油乳剂灭活疫苗2比疫苗1免疫后产生的鸡包涵体肝炎卵黄中和抗体效价高且持续时间长。

3.7鸡包涵体肝炎血清4型精制卵黄抗体制造及检验

3.7.1高免鸡蛋的生产

3.7.1.1产蛋鸡 应具有商品蛋鸡的生产性能。

3.7.1.1.1按鸡群0.5％抽样采血，分别按ELISA和AGP法检测抗体，应全部为阴性.

3.7.1.1.2鸡白痢和鸡支原体 按NY/T 536-2002《鸡伤寒和鸡白痢诊断技术》和NY/T553-2002《禽支原体病诊断技术》进行检测，鸡白痢和鸡支原体感染阳性率应≤0.1％。

3.7.1.1.3产蛋鸡的饲养管理 鸡场建设必须符合兽医卫生防疫规范要求。鸡场应离交通要道500米以上，进、出口道路应分开。场内料、粪道路分开。鸡场进出口应设有消毒池。育雏舍与成鸡舍应设隔离带。此外，鸡场应具备粪污处理设施，实施全进全出制，鸡场饮水应达到卫生标准，饲养人员应卫生健康。

3.7.1.1.4鸡的疫病防治 根据当地疫病发生的实际情况，按科学免疫程序适时接种相关疫苗，根据情况需要，适时、适量投喂抗生素和抗球虫药品等。

3.7.1.1.5鸡的日龄 100～120日龄。

3.7.1.2疫苗免疫

3.7.1.2.1疫苗制备

按3.1-3.5，制备鸡包涵体肝炎病毒血清4型油乳剂灭活疫苗2并检测合格。

3.7.1.2.2免疫程序

按2.2.5.3执行。维持免疫：当卵黄中鸡包涵体肝炎中和抗体效价临界1:640时，维持接种1次，每只鸡颈背部皮下注射疫苗2 2.0ml。

3.7.1.3收蛋 强化免疫后7日，抽样取蛋，分离卵黄，按3.6检测鸡包涵体肝炎中和抗体效价应≥1:640为合格，收集高免鸡蛋，8～12℃贮存，应不超过10日。

3.7.2抗体制造

3.7.2.1消毒

高免鸡蛋摆入塑料蛋盘，浸入40℃、0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15～20分钟。而后将高免鸡蛋用福尔马林密闭熏蒸消毒30分钟。

3.7.2.2分离卵黄

手工或机械打蛋，除去蛋清(白)、胚盘和系带，收集卵黄。

3.7.2.3抗体萃取

充分搅拌使卵黄呈均匀膏状，装入500L搅拌罐中，按体积比1:1加入25℃左右的灭菌注射用水(用0.2M盐酸调节pH4.3)，200转/分钟，搅拌30分钟，将卵黄液转入不锈钢桶中，加入终浓度为4％正辛酸，用转头装有桨叶的电转搅拌30分钟，室温放置12～24小时，用40目滤网撇去漂浮在上层的蛋黄，用80目滤布过滤，收集滤液，滤出液和下层液体合并，用板框过滤器加滤板和0.4微米滤膜过滤，即为抗体半成品，将抗体半成品转入用0.2％甲醛溶液消毒的500L冰柜中，4℃冷藏5小时，使残留的辛酸结晶凝结析出，用80目滤网撇去浮在上层的辛酸结晶，用0.2M氢氧化钠溶液调pH7.0，再后用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液调节pH6.9。

3.7.2.4过滤

pH6.9抗体半成品用过滤精度0.45μm的筒式滤芯精滤,而后用过滤精度0.2μm的筒式滤芯过滤除菌，无菌操作分装，装量为250ml/瓶，即为鸡包涵体肝炎病毒血清4型精制卵黄抗体。

3.7.3抗体检验

3.7.3.1纯净性

按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，无细菌、支原体和外源病毒污染。

3.7.3.2效价检测

按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，鸡包涵体肝炎病毒血清4型中和抗体效价应≥1:320。

3.7.3.3安全性检验

5日龄健康肉鸡雏10只，每只皮下注射1.0ml，观察14日，应全部健活。

3.7.3.4辛酸和甲醛残留

按照现行《中华人民共和国兽药典》进行检测，应符合规定。

实施例4

鸡包涵体肝炎病毒血清4型精制卵黄抗体临床使用剂量、方法研究

4.1用于预防

4.1.1按日龄

4.1.1.1 5日龄雏鸡试验

5日龄肉鸡雏70只，分为7组，每组10只，1-3组分别经肌肉注射鸡包涵体肝炎精制卵黄抗体0.1ml/只、0.3ml/只、0.5ml/只；4-6组分别经皮下注射鸡包涵体肝炎精制卵黄抗体0.1ml/只、0.3ml/只、0.5ml/只；7为对照组，不做任何处理。在接种抗体后24小时，对1-7组所有鸡雏肌肉注射接种鸡包涵体肝炎SDJ15-8株100LD50/只，接种病毒后观察10天，统计各组鸡雏发病及死亡情况。结果显示：7组发病率100％，死亡率90％；1组和4组雏鸡发病率分别为70％和60％，未死亡；其它组鸡雏均健活，未出现包涵体肝炎临床发病症状(临诊症状及病理变化参照《兽医传染病学》第五版，p369)，说明抗体接种途径不影响预防保护率。

4.1.1.2 10日龄雏鸡试验

10日龄肉鸡雏40只，分为4组，每组10只，1-3组分别经肌肉注射鸡包涵体肝炎精制卵黄抗体0.2ml/只、0.3ml/只、0.5ml/只；4组为对照组，不做任何处理。在接种抗体后24小时，对1-4组所有鸡雏肌肉注射接种鸡包涵体肝炎SDJ15-8株100LD50/只，接种病毒后观察10天，统计各组鸡雏发病及死亡情况。结果显示：4组发病率100％，死亡率70％；1组雏鸡发病率为40％，未死亡；其它组鸡雏均健活，未出现包涵体肝炎临床发病症状。

4.1.1.3 15日龄雏鸡试验

15日龄肉鸡雏40只，分为4组，每组10只，1-3组分别经肌肉注射鸡包涵体肝炎精制卵黄抗体0.3ml/只、0.5ml/只、0.8ml/只；4为对照组，不做任何处理。在接种抗体后24小时，对1-4组所有鸡雏肌肉注射接种鸡包涵体肝炎SDJ15-8株100LD50/只，接种病毒后观察10天，统计各组鸡雏发病及死亡情况。结果显示：4组发病率100％，死亡率60％；1组雏鸡发病率为50％，未死亡；其它组鸡雏均健活，未出现包涵体肝炎临床发病症状。

4.1.2按体重(对于15日龄以上雏鸡)

25日龄肉雏鸡40只，随机分为4组,1组按0.5ml抗体/kg体重、2组按0.8ml抗体/kg体重、3组按1.0ml抗体/kg体重皮下注射鸡包涵体肝炎精制卵黄抗体，接种抗体后24小时，对1-4组所有鸡雏肌肉注射接种鸡包涵体肝炎SDJ15-8株100LD50/只，接种病毒后观察10天，统计各组鸡雏发病及死亡情况。结果显示：4组发病率100％，死亡率50％；1组雏鸡有1只表现出精神沉郁，发病率为10％，未死亡；其它组鸡雏均健活，未出现包涵体肝炎临床发病症状。

4.1.3结论

鸡包涵体肝炎精制卵黄抗体经肌肉或皮下注射接种，两种途径均可，不影响预防保护率。用于预防：15日龄及以下肉雏鸡，每只接种剂量为0.3-0.5ml；15日龄以上肉雏鸡，接种剂量为0.8ml/kg体重。

4.2用于治疗

4.2.1按日龄

4.2.1.1 5日龄雏鸡试验

5日龄肉鸡雏40只，分为4组，每组10只，1-4组鸡雏分别肌肉注射接种鸡包涵体肝炎SDJ15-8株100LD50/只。1-3组为治疗组，待每组有2只雏鸡出现包涵体肝炎临床发病症状时开始全组治疗，分别皮下注射鸡包涵体肝炎精制卵黄抗体0.8ml/只、1.0ml/只、1.5ml/只；4组为对照组，不做任何处理。接种抗体后观察10天，统计各组鸡雏发病及死亡情况。结果显示：4组死亡率80％；1-3组死亡率分别为20％、0和0，治愈率(以观察期结束无包涵体肝炎临床症状为治愈)60％、80％和90％。

4.2.1.2 10日龄雏鸡试验

10日龄肉鸡雏40只，分为4组，每组10只，1-4组鸡雏分别肌肉注射接种鸡包涵体肝炎SDJ15-8株100LD50/只。1-3组为治疗组，待每组有2只雏鸡出现包涵体肝炎临床发病症状时开始全组治疗，分别皮下注射鸡包涵体肝炎精制卵黄抗体1.0ml/只、1.5ml/只、2.0ml/只；4组为对照组，不做任何处理。接种抗体后观察10天，统计各组鸡雏发病及死亡情况。结果显示：4组死亡率80％；1-3组死亡率分别为10％、0和0，治愈率(以观察期结束无包涵体肝炎临床症状为治愈)70％、80％和80％。

4.2.2按体重(对于15日龄以上雏鸡)

20日龄肉鸡40只，随机分为4组,1-4组鸡分别肌肉注射接种鸡包涵体肝炎SDJ15-8株100LD50/只。1-3组为治疗组，待每组有2只鸡出现包涵体肝炎临床发病症状时开始全组治疗，分别按1.5ml、1.8ml和2.0ml/kg体重皮下注射鸡包涵体肝炎精制卵黄抗体，观察10天，统计各组鸡死亡情况。结果显示：第4组死亡率80％；第1-3组死亡率均为0，治愈率80％、80％和90％。

4.2.3结论

用于治疗：以≥80％治愈率为标准，10日龄及以下肉鸡雏，1.0-1.5ml抗体/只；大于10日龄肉鸡，1.5-2.0ml抗体/kg体重。

实施例5

鸡包涵体肝炎血清4型精制卵黄抗体保存期

5.1方法

取于2-8℃保存6、12、15个月的鸡包涵体肝炎病毒血清4型精制卵黄抗体，分别肌肉注射10只5日龄AA肉鸡雏0.3ml/只，同时设相同日龄和数量的鸡雏作为对照，在接种抗体后24小时对上述2组鸡雏肌肉注射鸡包涵体肝炎SDJ15-8株100LD50/只，观察10日，统计各组鸡雏发病及死亡情况。

5.2结果

攻毒对照组鸡雏100％发病，死亡率＞70％。接种保存6个月和12个月抗体的鸡雏均健活，接种保存15个月抗体的鸡雏有2只发病，未死亡，其余健活。说明抗体的有效期为12个月。

实施例6

鸡包涵体肝炎血清4型精制卵黄抗体质量标准

本品系用鸡包涵体肝炎SDJ15-8株接种SPF鸡胚培养，收获接种后48～120小时死亡鸡胚的尿囊液，浓缩、灭活，制成油乳剂灭活疫苗，接种健康产蛋鸡，从高免卵黄中提取抗体制成。用于鸡包涵体肝炎的预防和早期治疗。

【性状】本品为无色至微黄色澄明液体，久置瓶底有微量沉淀。

【无菌检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应无细菌生长。

【支原体检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应无支原体生长。

【外源病毒检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应无外源病毒污染。

【安全检验】用5日龄易感健康雏鸡10只，每只皮下注射本品1.0ml，连续观察14日，雏鸡应全部健活。

【效力检验】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，鸡包涵体肝炎病毒血清4型中和抗体效价应≥1:320。

【甲醛残留】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应符合规定。

【辛酸残留】按现行《中华人民共和国兽药典》检测，应符合规定。

【规格】250ml/瓶

【贮藏与有效期】2～8℃贮存，有效期为12个月。

鸡包涵体肝炎精制卵黄抗体使用说明

【作用与用途】用于鸡包涵体肝炎病毒血清4型的预防和早期治疗。

【用法与用量】皮下或肌肉注射。用于预防：15日龄及以下雏鸡，每只接种剂量为0.3-0.5ml；15日龄以上雏鸡，接种剂量为0.8ml/kg体重。用于治疗：10日龄及以下鸡雏，1.0-1.5ml抗体/只；10日龄以上鸡，1.5-2.0ml抗体/kg体重。

【注意事项】

1本品口服无效，预防保护期为6日。

【规格】250ml/瓶。

【贮藏与有效期】8～12℃贮存，有效期为12个月。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种鸡包涵体肝炎的卵黄抗体，其特征在于，所述卵黄抗体为含有鸡包涵体肝炎病毒株，所述病毒为禽腺病毒I群血清4型病毒，命名为SDJ15-8，其保藏号为CCTCC NO:V201636，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心。

2.如权利要求1所述的鸡包涵体肝炎的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用鸡包涵体肝炎病毒株SDJ15-8制成灭活疫苗；

2)步骤1)制备的灭活疫苗注射免疫产蛋鸡，制备高免蛋；

3)由高免蛋收集卵黄用酸化水-辛酸的方法萃提、灭活后制备成鸡包涵体肝炎的卵黄抗体。

3.根据权利要求2所述的鸡包涵体肝炎的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤1)鸡包涵体肝炎病毒株SDJ15-8是被甲醛灭活的。

4.根据权利要求3所述的鸡包涵体肝炎的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤1)灭活疫苗制备包括以下步骤：

a、接种：将鸡包涵体肝炎病毒株SDJ15-8用灭菌生理盐水稀释后经卵黄囊接种于SPF鸡胚，37℃进行静置孵化，收集48～120小时内死亡的鸡胚，收获尿囊液；

b、向步骤a中的尿囊液中加入终浓度为0.1wt％甲醛溶液，灭活后，离心去沉淀物，将上清液浓缩制得鸡包涵体肝炎病毒株SDJ15-8抗原；

c、按常规法制备成油佐剂灭活疫苗。

5.根据权利要求4所述的鸡包涵体肝炎的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤b的浓缩倍数为15倍。