CN106729690A - 鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：1)将禽腺病毒4型病毒接种于LMH细胞，经培养、冻融、离心、浓缩等步骤得到制苗病毒液；2)将鸡新城疫病毒La Sota株和禽流感H9亚型分别接种于鸡胚尿囊腔，经培养，收获鸡胚病毒尿囊液，然后进行离心、浓缩，分别得到鸡新城疫、禽流感H9亚型制苗病毒液；3)将三种病毒的制苗病毒液进行灭活后，等体积混合，乳化制成乳剂型灭活疫苗。本发明提供的三联疫苗效价高，对鸡新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型病毒具有完全的免疫保护作用，安全性良好，稳定有效，保护期长。

Description

鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗的制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗的制备方法。
背景技术
鸡新城疫(ND)俗称鸡瘟，是由鸡新城疫病毒引起的鸡的一种高度接触性、急性、烈性传染病，具有很高的发病率和病死率，世界各地多有发生，且一旦爆发将给禽养殖业带来毁灭性打击。
H9N2亚型禽流感属于低致病性禽流感，发病率高，但死亡率低。主要表现仅为轻度呼吸道症状，采食量减少，产蛋率可从90％降至20％以下，甚至绝产，对商品肉鸡可导致30％左右死亡，极易与大肠杆菌混合感染，严重影响家禽的生产性能，给养禽业带来严重的经济损失。更重要的是，H9N2亚型AIV可以穿越宿主障碍感染哺乳动物包括人，也有机会在人类大流行，给人类健康带来了严重的威胁。
禽I群腺病毒是家禽常见的感染病原体，呈世界性分布，目前发现所有年龄的家禽均易感，只是鉴于家禽的品种、年龄所形成的致病力不同。目前发现禽I群腺病毒对鸡具有强致病性，主要病变表现为包涵体肝炎及心包积液-肝炎综合征，该病可直接引发养鸡场20～40天龄鸡只出现30％以上的死亡率，此外其临床上也常常与传染性支气管炎病毒，呼肠孤病毒，H9亚型禽流感病毒等并发感染，导致种蛋鸡出现明显呼吸道病，关节炎，及严重的产蛋下降及畸形蛋等问题。因此目前该病已经成为严重影响养鸡场生产性能的重大疫病之一。其中，禽I群腺病毒中的禽腺病毒4型(FAV-4)目前是世界上的研究热点，其具备高致病性，可直接引发的心包积液-肝炎综合征(或安卡拉病)，该病于1987年首发于巴基斯坦，在不到一年的时间内殃及整个巴基斯坦肉鸡养殖企业，之后在科威特、伊朗、前苏联，日本，中南美洲及墨西哥等地具有发生，甚至该病在鸽子也曾大面积爆发。
目前针对鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒的三联疫苗不断推出，可避免需要多次应用相应的单项灭活疫苗引起的手续繁琐、使用不便、防疫成本较高等问题。如公开号为CN 105664150 A的中国专利申请“一种鸡新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒三联灭活疫苗”中所述三联疫苗的制备方法为分别将鸡新城疫、禽流感病毒接种鸡胚收获抗原，将禽腺病毒接种鸡肝细胞收获抗原，然后将各自抗原混合，再进行抗原的浓缩灭活、成品乳化。但所述的禽腺病毒以原代鸡肝细胞进行培养，制备繁琐、易污染、难以到达高效转染，不利于实验操作。因此，有必要提供一种优化病毒培养工艺，降低生产成本，提高抗原效价，提高成品疫苗免疫效果的鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒的三联疫苗的制备方法。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种优化病毒培养工艺，降低生产成本，提高抗原效价，提高成品疫苗免疫效果的鸡新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒的三联疫苗的制备方法。
本发明提供的技术方案为如下：
本发明提供一种鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将禽腺病毒4型病毒接种于LMH细胞，于37℃、5％CO2培养，直至细胞出现明显病变时终止培养，将病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液，然后进行超滤浓缩即为禽腺病毒4型制苗病毒液；
(2)将鸡新城疫病毒La Sota株和禽流感H9亚型分别接种于鸡胚尿囊腔，分别收获鸡新城疫和禽流感H9亚型的鸡胚病毒尿囊液，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液，然后分别进行超滤浓缩即为鸡新城疫制苗病毒液和禽流感H9亚型制苗病毒液；
(3)将上述三种病毒的制苗病毒液进行灭活后，等体积混合，乳化制成乳剂型灭活疫苗。
进一步地，上述步骤(1)禽腺病毒4型制苗病毒液的制备具体为：
①细胞的制备：将LMH细胞用胰酶-EDTA消化液进行消化分散传代，加入DMEM培养液，在37℃、5％CO2培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽腺病毒4型病毒接种；
②禽腺病毒4型的接种和培养：将禽腺病毒4型毒种按终体积1:200接种到步骤①制备的细胞，并在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，加入细胞维持液，于37℃、5％CO2培养58±2小时，直至细胞病变CPE达到80％以上时，收集细胞毒液；
③制苗病毒液的制备：将收集的细胞毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液用50K中空纤维柱将其进行浓缩后，即得禽腺病毒4型制苗病毒液；
其中，所述步骤①中胰酶-EDTA消化液为含有0.025％(m/v)的胰酶，0.02％(m/v)EDTA的Hank’s溶液。
所述的DMEM培养液中含5～10％(v/v)新生牛血清、1.0～1.2％(v/v)双抗和0.5～2.5％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。
所述步骤②中的细胞维持液为包含有0.5～1.5％(v/v)新生牛血清、0.2～0.5％(m/v)谷氨酰胺、1.0～1.2％(v/v)双抗、1～3％(v/v)脂质体复合物和1～2％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。
进一步地，所述步骤②中的细胞维持液还包含有0.05～0.2％(m/v)硫辛酸。
进一步地，所述的脂质体复合物为内部包含过氧化氢酶的复合物，所述的脂质体复合物的制备包括以下步骤：
(1)称取0.2g磷脂酰胆碱、0.08g胆固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于50mL乙醇，超声处理5min；
(2)然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去乙醇，静置30min，加入100mL pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，在35℃水浴中振荡水化反应约1h，得脂质体悬浮液；
(3)使用注射器式滤器调整脂质体悬浮液的粒径至150～200nm，得到内部包含有过氧化氢酶的脂质体。
其中，上述pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中含0.2～0.6％(m/v)过氧化氢酶。
进一步地，上述三种病毒的制苗病毒液在进行灭活前需进行病毒含量测定，其中，禽腺病毒4型病毒含量测定为：取浓缩后的病毒液用DMEM细胞培养液做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 5个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞，每孔0.1mL，37℃吸附30min后，补加细胞维持液0.3mL于37℃、5％CO2培养120小时，观察细胞病变，计算TCID50。
鸡新城疫病毒和禽流感H9亚型病毒含量测定为：取浓缩后的病毒液用PBS按照10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共5个稀释度经尿囊腔接种SPF鸡胚，0.1mL/胚，每个稀释度接种5枚鸡胚，于37℃培养箱中培养观察7天，每天记录鸡胚死亡情况，如果有死亡鸡胚放入4℃冰箱保存，观察时间结束后利用Reed-Muench方法计算离心收获的上清液的EID50。
进一步地，将三种病毒的制苗病毒液按等体积混合后，使0.1ml水相中鸡新城疫病毒含量不低于108.3EID50，禽流感H9亚型病毒含量不低于107.5EID50，禽腺病毒4型TCID50≥108.0/mL。
进一步地，上述三种病毒的制苗病毒液的灭活采用0.1％福尔马林灭活，灭活时间为12～24小时。
其中，禽腺病毒4型病毒灭活检验为：取灭活检验的样品，用DMEM营养液以10-1、10-2、10-3三个比例稀释待检样品，同时设立同样稀释比例的灭活前病毒样品用于阳性对照，分别接种于48孔LMH细胞单层细胞，每组重复接种5孔，每孔0.4mL 37℃、5％CO2培养96小时。灭活样品各组稀释度孔中均没有出现细胞病变，阳性对照组各稀释度孔中细胞病变均明显，达80％以上，判定为灭活检验合格。
鸡新城疫、禽流感H9亚型灭活检验为：将灭活的病毒液接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置于36～37℃继续孵育，不必翻胚。每天照胚两次，弃去24小时之内的死亡鸡胚，孵育至4天，收获尿囊液测定其血凝价(HA)，HA＜1:4即为灭活合格。
进一步地，所述的乳化制成乳剂型灭活疫苗包括以下步骤：
(1)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司盘-80 4份，先将白油缓慢加温，然后加入司盘-80和硬脂酸铝，边搅拌边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌，制成油相；
(2)水相制备：取灭活后的鸡新城疫制苗病毒液、禽流感病毒H9亚型制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液各32份，混合，加入灭菌后的吐温-80 4份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；
(3)乳化：将水相加入到油相中，利用IKA乳化机进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即得乳剂型灭活疫苗；
(4)分装：将制备的乳剂型灭活疫苗按照每瓶250mL进行分装。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
(1)采用本发明提供的三联灭活疫苗免疫动物后抗体产生快，效价高，降低了疫病的发生及蔓延，对鸡新城疫病毒、禽流感病毒H9亚型和禽腺病毒4型病毒具有完全的免疫保护作用。且安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应，稳定有效，成品在2～8℃长时保存不会出现分层现象，保护期长。
(2)与传统使用鸡胚法或原代鸡肝肾细胞培养禽腺病毒4型病毒比较，本发明采用LMH传代细胞培养禽腺病毒4型增殖，利用Reed-Muench方法测定其TCID50可以稳定达到107.0-107.5/0.1mL，所得的禽腺病毒4型增殖的病毒滴度提高达10倍以上，并且得到的抗原高度澄清，容易进行浓缩处理，适合进行高抗原滴度的优质灭活疫苗生产。
(3)本发明通过优化细胞培养液的配方，创造性地添加过氧化氢酶脂质体复合物和硫辛酸，使接毒后的LMH细胞在低含量新生牛血清的DMEM培养液中仍能保持良好的生长状态，避免细胞过早出现死亡，从而提高制毒疫苗的效价，并在较短的培养时间58±2小时，即可收获滴度较高的病毒液，大大节约了生产成本，提高生产效率。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。
实施例1 脂质体复合物的制备：
(1)称取0.2g磷脂酰胆碱、0.08g胆固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于50mL乙醇，超声处理5min；
(2)然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去乙醇，静置30min，加入100mL pH为7.4含0.5％(m/v)过氧化氢酶的磷酸盐缓冲溶液，在35℃水浴中振荡水化反应约1h，得脂质体悬浮液；
(3)使用注射器式滤器调整脂质体悬浮液的粒径至150nm，得到内部包含有过氧化氢酶的脂质体。
实施例2 禽腺病毒4型制苗病毒液的制备和病毒含量测定
(1)禽腺病毒4型制苗病毒液的制备：
①细胞的制备：将LMH细胞用质量体积比为0.025％的胰酶-0.02％EDTA消化分散，加入含10％(v/v)新生牛血清、1.0％(v/v)双抗和2.0％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液，在37℃、5％CO2培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽腺病毒4型病毒接种；
②禽腺病毒4型的接种和培养：将禽腺病毒4型毒种按终体积1:200接种到步骤①制备的细胞，并在37℃吸附40分钟后吸弃病毒液，加入含有1.0％(v/v)新生牛血清、0.4％(m/v)谷氨酰胺、1.0％(v/v)双抗、2.5％(v/v)脂质体复合物、0.15％(m/v)硫辛酸和2％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液，于37℃、5％CO2培养60小时，直至细胞病变CPE达到80％以上时，收集细胞毒液；
③制苗病毒液的制备：将收集细胞毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液用50K中空纤维柱将其进行浓缩后，即得禽腺病毒4型制苗病毒液。
(2)禽腺病毒4型病毒含量测定：
取浓缩后的病毒液用DMEM细胞培养液做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 5个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复5孔，同时设立阴性对照细胞，每孔0.1mL，37℃吸附30min后，补加细胞维持液0.3mL于37℃、5％CO2培养120小时，观察细胞病变，计算TCID50。
对比例1、2、3禽腺病毒4型制苗病毒液的制备和病毒含量测定
对比例1禽腺病毒4型制苗病毒液的制备步骤与实施例2基本相同，区别在于，所述的步骤②种毒繁殖中，LMH细胞接入毒种后，加入的细胞维持液含有过氧化氢酶，而不是过氧化氢酶脂质体复合物，即将过氧化氢酶直接加入到细胞维持液中。
对比例2禽腺病毒4型制苗病毒液的制备步骤与实施例2基本相同，区别在于，所述的步骤②种毒繁殖中，LMH细胞接入毒种后，加入的细胞维持液不含过氧化氢酶脂质体复合物。
对比例3禽腺病毒4型制苗病毒液的制备步骤与实施例2基本相同，区别在于，所述的步骤②种毒繁殖中，LMH细胞接入毒种后，加入的细胞维持液不含硫辛酸。
并观察按对比例1-3所述的方法制备禽腺病毒4型制苗病毒液，不同时间收获的病毒液TCID50，并与实施例2的方法制备禽腺病毒4型制苗病毒液比较，见下表1。
表1 不同时间收获的病毒液TCID50
由对比例1可知，将过氧化氢酶直接加入到细胞维持液中，LMH细胞在较短时间内出现病变，培养36h后，CPE比例达到65％，48h后达到95％，收获病毒液中病毒的含量远低于实施例2制得病毒液中病毒的含量。由对比例2可知，细胞维持液中不含过氧化氢酶脂质体复合物，LMH细胞在最短时间内出现病变，培养36h后，CPE比例达到85％，收获病毒液的病毒的含量最低。由对比例3可知，细胞维持液中不含硫辛酸，LMH细胞出现病变的时间与对比例1相当，培养36h后，CPE比例达到60％，48h后达到85％。以上结果表明在细胞培养液中加入过氧化氢酶脂质体复合物和硫辛酸可显著改善LMH细胞接毒后的生长状态，延缓其出现细胞病变，提高病毒疫苗的效价。
实施例3 鸡新城疫制苗病毒液、禽流感H9亚型制苗病毒液的制备和病毒含量测定
(1)鸡新城疫制苗病毒液的制备：
将鸡新城疫毒种用灭菌PBS稀释至10-4或10-5，接种10～11日龄鸡胚，每胚尿囊腔内接种0.2ml，置36～37℃继续孵育，不必翻胚，每日照胚1次，孵育至96小时，全部取出，照胚，弃去死胚，将活胚气室向上直立，置2～8℃冷却12～24小时，将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液，吸取鸡胚尿囊液置于灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价，凝集价低于1:256者应弃去，将收获的鸡胚尿囊液置于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液，然后进行超滤浓缩即为鸡新城疫制苗病毒液，亦可将鸡胚尿囊液置于在2～8℃保存备用，但保存应不超过72小时。
(2)鸡新城疫病毒含量测定：
取浓缩后的病毒液用PBS按照10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共5个稀释度经尿囊腔接种SPF鸡胚，0.1mL/胚，每个稀释度接种5枚鸡胚，于37℃培养箱中培养观察7天，每天记录鸡胚死亡情况，如果有死亡鸡胚放入4℃冰箱保存，观察时间结束后利用Reed-Muench方法计算离心收获的上清液的EID50。
(3)禽流感H9亚型制苗病毒液的制备：
将禽流感H9亚型毒种用灭菌PBS稀释至10-4或10-5，接种10～11日龄鸡胚，每胚尿囊腔内接种0.2ml，置36～37℃继续孵育，不必翻胚，每日照胚1次，孵育至72小时，全部取出，照胚，弃去死胚，将活胚气室向上直立，置2～8℃冷却12～24小时，将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液，吸取鸡胚尿囊液置于灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价，凝集价低于1:256者应弃去，将收获的鸡胚尿囊液置于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液，然后进行超滤浓缩即为禽流感H9亚型制苗病毒液，亦可将鸡胚尿囊液置于在2～8℃保存备用，但保存应不超过72小时。
(4)禽流感H9亚型病毒含量测定：
取浓缩后的病毒液用PBS按照10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共5个稀释度经尿囊腔接种SPF鸡胚，0.1mL/胚，每个稀释度接种5枚鸡胚，于37℃培养箱中培养观察7天，每天记录鸡胚死亡情况，如果有死亡鸡胚放入4℃冰箱保存，观察时间结束后利用Reed-Muench方法计算离心收获的上清液的EID50。
实施例4 鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒的灭活及灭活检验
(1)禽腺病毒4型的灭活：将病毒液导入灭活罐内，加入福尔马林溶液，充分混合，福尔马林溶液的最终浓度为0.1％，37℃灭活16小时(以罐内温度达到37℃开始计时)后取出，置2～8℃保存，应不超过1个月。
禽腺病毒4型病毒灭活检验：取灭活检验的样品，用DMEM营养液以10-1、10-2、10-3三个比例稀释待检样品，同时设立同样稀释比例的灭活前病毒样品用于阳性对照，分别接种于48孔LMH细胞单层细胞，每组重复接种5孔，每孔0.4mL 37℃、5％CO2培养96小时。灭活样品各组稀释度孔中均没有出现细胞病变，阳性对照组各稀释度孔中细胞病变均明显，达80％以上，判定为灭活检验合格。
(2)鸡新城疫病毒和禽流感H9亚型病毒灭活参考上述禽腺病毒4型病毒灭活方法。
鸡新城疫/禽流感H9亚型灭活检验为：将灭活的病毒液接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置于36～37℃继续孵育，不必翻胚。每天照胚两次，弃去24小时之内的死亡鸡胚，孵育至4天，收获尿囊液测定其血凝价(HA)，HA＜1:4即为灭活合格。
实施例5 鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备
本发明可用于配制三联灭活疫苗的条件为：每0.1mL新城疫病毒含量不低于108.5EID50方可用于制苗；每0.1mL禽流感H9亚型病毒含量不低于107.8EID50方可用于制苗可用于制苗；每0.1mL禽腺病毒4型病毒含量≥108.5TCID50即可用于制苗，所述三联灭活疫苗的制备具体为：
(1)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司盘-80 4份，先将白油缓慢加温，然后加入司盘-80和硬脂酸铝，边搅拌边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌，制成油相；
(2)水相制备：取灭活后的鸡新城疫制苗病毒液、禽流感病毒H9亚型制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液各32份，混合，加入灭菌后的吐温-80 4份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；
(3)乳化：将水相加入到油相中，利用IKA乳化机进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即得乳剂型灭活疫苗；
(4)分装：将制备的乳剂型灭活疫苗按照每瓶250mL进行分装。
制得的0.1ml水相三联灭活疫苗中鸡新城疫病毒含量不低于108.3EID50，禽流感H9亚型病毒含量不低于107.5EID50，禽腺病毒4型TCID50≥108.0/mL。
实施例6 三联灭活疫苗成品检验
(1)性状
①外观：为乳白色乳剂。
②剂型：油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均不扩散。
③稳定性：吸取疫苗10毫升加入离心管中，以3000rpm离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5mL。
④粘度：用出口内径为1.2mm的1.0mL吸管，吸取25℃左右1.0mL，令其垂直自然流出，记录流出0.4mL所需的时间，应不超过8秒。
(2)无菌检验：取成品接种硫乙醇酸盐培养基小管和酪胨琼脂各两支，每支0.2mL，一支置37℃培养，一支置25℃培养，观察3～5日，应纯粹，无菌生长。
(3)安全检验：用7日龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1mL，观察14日，结果试验鸡均健活，无任何局部和全身不良反应。
(4)甲醛含量测定：
①对照品溶液的制备：取已标定的甲醛溶液适量，配成每1.0mL含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5.0mL置50mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。
②被测样本的制备：用5.0mL刻度吸管量取被检品5.0mL，置50mL量瓶中，用20％吐温-80乙醇溶液10mL，分次洗涤吸管，洗液并入50mL量瓶中，摇匀，加水稀释至刻度，强烈振摇，静止分层，下层液如果不澄清，滤过，弃去初滤液，取澄清续滤液，即得。
③测定法：精密吸取对照品溶液和被检品溶液各0.5mL，分别加醋酸-醋酸铵缓冲液10mL，乙酰丙酮试液10mL，置60℃恒温水浴15分钟，冷水冷却5分钟，放置20分钟后，按紫外-可见分光光度计法，在410nm的波长处测定吸收度，计算即得。甲醛含量符合国家标准，即检验合格。
(5)装量检查：取供试品3个，使之恢复至室温，开启时注意避免损失。参照装量检查使用量取参考表，用经标化的吸管、注射器或量筒进行装量检查。
实施例7 三联灭活疫苗效力试验：
取21日龄SPF鸡70只，将四批鸡新城疫、禽流感H9亚型和禽腺病毒4型三联灭活疫苗分别以0.3mL/只胸肌注射，每批灭活疫苗15只SPF鸡，剩余10只作为对照组只注射生理盐水。免疫后7、14、21、28、35、42、49天，连同对照组分别采血，测定其鸡新城疫和禽流感病毒H9亚型HI抗体效价和21天、35天和49天禽腺病毒4型血清中和抗体效价，结果见下表2-4。
表2 免疫后不同时间鸡新城疫抗体水平
表3 免疫后不同时间禽流感病毒H9亚型抗体水平
表4 免疫后不同时间禽腺病毒4型抗体水平
结果表明，采用本发明的LMH细胞载体能培养出高病毒滴度的禽腺病毒4型；从SPF鸡的免疫效力试验可知，采用本发明生产的鸡新城疫、禽流感H9亚型和禽腺病毒4型三联灭活疫苗免疫SPF鸡不仅能产生高水平的抗鸡新城疫和禽流感病毒H9亚型的HI抗体而且还能产生高水平的禽腺病毒4型中和抗体，本发明提供的三联灭活疫苗效力较佳。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将禽腺病毒4型病毒接种于LMH细胞，于37℃、5％CO2培养，直至细胞出现明显病变时终止培养，将病变细胞冻融，离心后收集上清液得到病毒原液，然后进行超滤浓缩即为禽腺病毒4型制苗病毒液；
(2)将鸡新城疫病毒La Sota株和禽流感H9亚型分别接种于鸡胚尿囊腔，分别收获鸡新城疫和禽流感H9亚型的鸡胚病毒尿囊液，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液，然后分别进行超滤浓缩即为鸡新城疫制苗病毒液和禽流感H9亚型制苗病毒液；
(3)将上述三种病毒的制苗病毒液进行灭活后，等体积混合，乳化制成乳剂型灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)禽腺病毒4型制苗病毒液的制备具体为：
(1)细胞的制备：将LMH细胞用胰酶-EDTA消化液进行消化分散传代，加入DMEM培养液，在37℃、5％CO2培养至细胞单层后，再用无血清DMEM培养液清洗细胞3次，用于禽腺病毒4型病毒接种；
(2)禽腺病毒4型的接种和培养：将禽腺病毒4型毒种按终体积1:200接种到步骤(1)制备的细胞，并在37℃吸附30～60分钟后吸弃病毒液，加入细胞维持液，于37℃、5％CO2培养58±2小时，直至细胞病变CPE达到80％以上时，收集细胞毒液；
(3)制苗病毒液的制备：将收集的细胞毒液于-20℃反复冻融两次后，于4℃、5000rpm离心10min，取离心后上清液用50K中空纤维柱将其进行浓缩后，即得禽腺病毒4型制苗病毒液。
3.根据权利要求2所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中胰酶-EDTA消化液为含有0.025％(m/v)的胰酶，0.02％(m/v)EDTA的Hank’s溶液。
4.根据权利要求2所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)DMEM培养液中含5～10％(v/v)新生牛血清、1.0～1.2％(v/v)双抗和0.5～2.5％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸，所述的双抗为含100IU/mL的青霉素和10mg/mL的链霉素溶液。
5.根据权利要求2所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的细胞维持液为包含有0.5～1.5％(v/v)新生牛血清、0.2～0.5％(m/v)谷氨酰胺、1.0～1.2％(v/v)双抗、1～3％(v/v)脂质体复合物和1～2％(m/v)羟乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培养液。
6.根据权利要求5所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的脂质体复合物为内部包含过氧化氢酶的复合物，所述的脂质体复合物的制备包括以下步骤：
(1)称取0.2g磷脂酰胆碱、0.08g胆固醇、0.04g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，混合，溶于50mL乙醇，超声处理5min；
(2)然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去乙醇，静置30min，加入100mL pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，在35℃水浴中振荡水化反应约1h，得脂质体悬浮液；
(3)使用注射器式滤器调整脂质体悬浮液的粒径至150～200nm，得到内部包含有过氧化氢酶的脂质体。
7.根据权利要求6所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中含0.2～0.6％(m/v)过氧化氢酶。
8.根据权利要求5所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的细胞维持液还包含有0.05～0.2％(m/v)硫辛酸。
9.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中三种病毒的制苗病毒液等体积混合后，使0.1ml水相中鸡新城疫病毒含量不低于108.3EID50，禽流感H9亚型病毒含量不低于107.5EID50，禽腺病毒4型TCID50≥108.0/mL。
10.根据权利要求1所述的鸡新城疫病毒、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型病毒三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的乳化制成乳剂型灭活疫苗包括以下步骤：
(1)油相制备：取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，司盘-80 4份，先将白油缓慢加温，然后加入司盘-80和硬脂酸铝，边搅拌边加温，直到硬脂酸铝充分溶解至透明为止，高压灭菌，制成油相；
(2)水相制备：取灭活后的鸡新城疫制苗病毒液、禽流感病毒H9亚型制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液各32份，混合，加入灭菌后的吐温-80 4份，开始搅拌，使吐温-80完全溶解为止，制成水相；
(3)乳化：将水相加入到油相中，利用IKA乳化机进行乳化，16000rpm，乳化5分钟即得乳剂型灭活疫苗；
(4)分装：将制备的乳剂型灭活疫苗按照每瓶250mL进行分装。
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