CN108969760A - 一种用lmh细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法及疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法及疫苗。利用本发明所述方法培养的LMH细胞用于禽腺病毒4型的培养，可在极大地降低生产成本的同时保证病毒的效价，该工艺在较短的时间60h内，即可稳定获得滴度108.5TCID50/0.1ml以上的禽腺病毒4型病毒，与现有技术相比具有明显的技术优势。用高滴度的疫苗抗原制备的疫苗可显著提高疫苗的免疫力，经免疫攻毒试验结果证明，对禽腺病毒4型攻击可100％保护。

Description

一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法及疫苗
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法及疫苗。
背景技术
禽腺病毒4(FAV-4)型具备高致病性的特点，可直接引发心包积液-肝炎综合征，目前针对高致病性的FAV-4，疫苗是有效的防控措施。
常规的培养FAV-4病毒多采用鸡胚成纤维细胞、鸡肝肾细胞、雏鸡肾细胞、鸡胚肝细胞4种原代细胞，但原代肝肾细胞存在制备繁琐、易污染、不易转染，且在制备过程中易混入鸡胚成纤维细胞，不利于试验操作。
1981年，一位日本学者通过使用二乙基亚硝胺对雄性鸡进行诱导产生肝癌，从肝癌组织分离得到一株鸡肝癌细胞系(LMH细胞系)，且有相关报道可以将该细胞系用于病毒培养。如中国专利申请CN105420198A，发明人利用鸡肝癌细胞作为鸭瘟病毒的宿主，证明了鸡肝癌细胞用于培养病毒的可行性。除此之外，也有利用LMH细胞培养禽腺病毒4型的报道，但是均存在培养条件复杂，成本较高，且病毒滴度较现有技术无明显技术优势。
鸡传染性法氏囊病是呼肠弧病毒引起的一种雏鸡急性、接触性传染病。该病具有发病突然、病程短、死亡率高的特点，且可引起鸡体免疫抑制，是传统养鸡业的主要传染病之一。
H9亚型禽流感属于低致病性禽流感，发病率高，但死亡率低。主要表现为轻度的呼吸道症状，采食量减少，产蛋率降低，甚至绝产，对商品肉鸡可导致30％左右死亡，严重影响家禽的生产性能，给养禽业带来严重的经济损失，更重要的，H9亚型禽流感病毒还可以感染人，对人类健康存在严重的威胁。
鸡城新疫俗称鸡瘟，是由鸡城新疫病毒引起的一种高度接触性、急性、烈性传染病，具有高发病率和病死率的特点，在世界各地均有发生，一旦爆发将给养殖业带来毁灭性的打击。
目前市场上已有利用LMH细胞系生产的针对禽腺病毒4(FAV-4)和鸡传染性法氏囊病的二联疫苗，以及针对鸡城新疫、禽腺病毒4(FAV-4)和H9亚型禽流感病毒的三联疫苗，但较现有技术并无明显的优势，普遍存在生产成本高缺点，疫苗的攻毒保护力仍有待提高的空间。
由此，有必要提供一种满足以下特点的LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法：
-其LMH细胞和病毒培养条件简单，易于操作；
-其病毒培养时间短；
-其病毒滴度高；
-其生产成本低。
发明内容
本发明旨在提供一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法及疫苗，该生产工艺培养条件简单，成本低，病毒培养时间短，病毒滴度高。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法，包括LMH细胞系制备，病毒接种繁殖，病毒收集、浓缩、纯化和疫苗成品配制步骤，所述LMH细胞系制备包括以下步骤：
S1、使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及0.01～1.0％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对LMH细胞进行培养，至细胞生长至30～55％密度，使用胰酶-EDTA对细胞进行消化和分散；
S2、使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及0.5～2.0％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S1得到的LMH细胞进行培养，至细胞生长至60～75％密度，使用胰酶-EDTA对细胞进行消化和分散；
S3、使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及1.5～3.2％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S2得到的LMH细胞进行培养，直至形成生长良好的细胞单层。
优选地，所述步骤S1～S3中胰酶-EDTA为含有0.025％(m/v)的胰酶、0.02％(m/v)EDTA的Hank’s溶液。
优选地，所述步骤S1所述细胞培养液中新生牛血清含量为0.8％(v/v)，所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量为0.25％(v/v)。
优选地，所述步骤S2所述细胞培养液中新生牛血清含量为0.8％(v/v)，所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量为1.25％(v/v)。
优选地，所述步骤S3所述细胞培养液中新生牛血清含量为0.8％(v/v)，所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量为2.5％(v/v)。
优选地，所述病毒接种繁殖步骤具体为：将禽腺病毒4型接种到制备得到的LMH细胞单层中并进行病毒吸附，使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清和100IU/ml青霉素的细胞维持液于37℃、5％CO2培养60h，直至细胞病变CPE达到80％以上，收获细胞毒液。
优选地，所述病毒收集、浓缩、纯化步骤具体为：将收获的细胞毒液于-20℃反复冻融2～3次，离心，超滤浓缩，即得制苗病毒液。
优选地，所述疫苗成品配制步骤具体为：往制苗毒液中加入灭活剂进行灭活，得疫苗抗原，往疫苗抗原中加入常规乳化剂乳化制得灭活疫苗。
本发明另一目的是提供一种禽腺病毒4型疫苗，通过将上述制备得到的禽腺病毒4型病毒液进行病毒含量测定，测得每0.1ml病毒液含量为108.5TCID50以上，灭活，浓缩，加入常规的疫苗抗原乳化剂制得。
本发明另一目的是提供一种鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗，通过将上述制备得到的禽腺病毒4型病毒液和鸡传染性法氏囊病毒液等体积混合，使得每0.1ml水相中禽腺病毒4型病毒含量≥108.5TCID50，鸡传染性法氏囊病毒含量≥108.0TCID50，灭活，浓缩，加入常规的疫苗抗原乳化剂制得。
本发明另一目的是提供一种鸡新城疫、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型三联灭活疫苗，通过将上述制备得到的禽腺病毒4型病毒液与鸡新城疫病毒液和禽流感病毒液等体积混合，使得每0.1ml水相中禽腺病毒4型病毒含量≥108.5TCID50，鸡新城疫病毒含量＞108.3TCID50，禽流感H9亚型病毒≥107.5TCID50，灭活，浓缩，加入常规的疫苗抗原乳化剂制得。
本发明其中一个关键点在于，LMH细胞系的培养中采用了一种创新的细胞培养液，其优选含有新生牛血清、100IU/ml青霉素以及N-乙酰-D-氨基葡萄糖。另外一个关键点在于，通过设置DMEM培养基中的N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量梯度呈低到高的趋势对LMH进行培养，能够实现低成本，短时间培养高滴度禽腺病毒4型病毒的目的。
经过试验发现，加入N-乙酰-D-氨基葡萄糖培养LMH细胞系能够显著提高经LMH细胞培养的禽腺病毒4型的病毒滴度；而通过逐步增加DMEM培养基中的N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量来培养LMH细胞，能够明显减缓病毒培养过程中LMH细胞出现病变的时间。
本发明具有以下优点：
利用本发明所述方法培养的LMH细胞用于禽腺病毒4型的培养，可在极大地降低生产成本的同时保证病毒的效价，该工艺在较短的时间60h内，即可稳定获得滴度108.5TCID50/0.1ml以上的禽腺病毒4型病毒，与现有技术相比具有明显的技术优势。用高滴度的疫苗抗原制备的疫苗可显著提高疫苗的免疫力，经免疫攻毒试验结果证明，对禽腺病毒4型攻击可100％保护。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
实施例1、LMH细胞的制备
S1、使用含有0.8％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及0.25％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对LMH细胞进行培养，37℃，5％CO2培养至细胞生长至30～55％密度，使用质量体积比为0.025％胰酶-EDTA(0.02％)对细胞进行消化和分散；
S2、使用含有0.8％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及1.25％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S1得到的LMH细胞进行培养，37℃，5％CO2培养至细胞生长至60～75％密度，使用质量体积比为0.025％胰酶-EDTA(0.02％)对细胞进行消化和分散；
S3、使用含有0.8％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及2.5％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S2得到的LMH细胞进行培养，37℃，5％CO2培养直至细胞形成生长良好的细胞单层。
实施例2、禽腺病毒4型病毒液制备
A)按实施例1所述方法制备得到LMH细胞；
B)将禽腺病毒4型按病毒接种量MOT为0.1接种到步骤A制备得到的LMH细胞中，于37℃吸附60min后吸弃病毒液，加入含有0.5％(v/v)新生牛血清和100IU/ml青霉素的细胞维持液，于37℃、5％CO2培养60h，此时细胞病变CPE达到80％以上，收获细胞毒液。
C)将收获得到的细胞毒液于-20℃反复冻融3次，3000rpm离心10min后收集上清液，得病毒原液，经超滤浓缩10倍即为制苗病毒液；
D)将上述得到的制苗病毒液用DMEM培养液做10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7、10-8、10-95个稀释度接种48孔铺满单层LMH细胞培养板，每个稀释度重复3孔，设置阴性对照细胞孔。每孔0.1ml，37℃吸附60min后，补加细胞维持液0.3ml，于37℃，5％CO2培养120h，观察细胞病变，计算TCID50，每0.1ml禽腺病毒4型含量≥108.5TCID50方可用于制备疫苗；
E)将符合制苗标准的病毒液加入终浓度为0.1％(v/v)甲醛溶液，混合，灭活，经灭活检验合格后保存，用于疫苗成品配制。
对比例1、禽腺病毒4型病毒液制备
对比例1与实施例2的区别在于，LMH细胞制备中，步骤S1～S3所述细胞培养液中不加入N-乙酰-D-氨基葡萄糖，其余参数与操作如实施例2一致。
对比例2、禽腺病毒4型病毒液制备
对比例2与实施例2的区别在于，所述LMH细胞的制备步骤为：将LMH细胞用质量体积比为0.025％胰酶-EDTA(0.02％)消化分散传代，加入含有0.8％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及2.5％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液进行培养，37℃，5％CO2培养直至细胞形成生长良好的细胞单层，其余参数与操作如实施例2一致。
对比例3、禽腺病毒4型病毒液制备
对比例3与实施例2的区别在于，所述LMH细胞制备中，步骤S1和S2中细胞培养至80～90％密度，其余参数与操作如实施例2一致。
实施例3、最佳病毒收获时间
观察按实施例2以及对比例1～3所述的方法制备得到禽腺病毒4型制苗病毒液在不同时间收获的病毒液的TCID50，筛选出最佳的病毒收获时间，结果如下表1所示。
表1不同时间收获的病毒液的TCID50
由上表1可知，与实施例2相比，对比例1在LMH细胞培养中不加入N-乙酰-D-氨基葡萄糖，制备的毒液获得的LMH细胞用于制备制苗病毒液在60h达到最大值107.0TCID50/0.1ml，病毒效价显著低于实施例2；对比例2未设置N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量为呈逐渐升高梯度获得的LMH细胞用于制备制苗病毒液，LMH细胞出现病变时间明显缩短，在36h，病变比例达到80％，病毒滴度在48h达到最高峰，1×107.0，病毒效价显著低于实施例2；对比例3在步骤S1和步骤S2中改变了细胞培养的密度对后期经LMH细胞培养的病毒滴度和出现病变的时间也存在一定的影响。
实施例4、疫苗成品的配制
取实施例2、对比例1～3制备得到的灭活制苗毒液，分别接入灭菌冷却后的吐温-80，边加边搅拌，使吐温-80彻底溶解后即为水相；取注射用白油94份，加入6份司本，混匀后搅拌至透明，121℃高压灭菌30min，冷却后制得油相；将3份油相导入乳化罐中，搅拌，缓慢加入1份水相，4000rpm剪切乳化，乳化后取10ml疫苗加入离心管中，以300rpm离心15min，管底析出的水相应不超过0.5ml，即为实施例2以及对比例1～3灭活疫苗。
实施例5、鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗配制
取实施例2制备得到的禽腺病毒4型病毒液，与鸡传染性法氏囊病毒液等体积混合，参考实施例4制备方法制备，使得每0.1ml水相中禽腺病毒4型病毒含量≥108.5TCID50，鸡传染性法氏囊病毒含量≥108.0TCID50，制得。
实施例6、鸡新城疫、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型三联灭活疫苗配制
取实施例2制备得到的禽腺病毒4型病毒液，与鸡新城疫病毒液、禽流感H9亚型病毒液等体积混合，参考实施例4制备方法制备，使得每0.1ml水相中禽腺病毒4型病毒含量≥108.5TCID50，鸡新城疫病毒含量＞108.3TCID50，禽流感H9亚型病毒≥107.5TCID50，制得。
实施例7、灭活疫苗免疫保护效果评价
取实施例4制备得到的实施例2以及对比例1～3灭活疫苗采用皮下注射接种方式免疫21日龄SPF鸡只，0.3ml/只，10只/组，并设立空白对照组；在免疫后21天后采血分离血清，测定中和抗体水平。中和抗体水平测定步骤如下：将血清作2倍系列倍比稀释后，取2-3～2-910个梯度与200TCID50/0.1ml的病毒液进行等量混匀，37℃作用1h，期间摇匀两次，接种鸡肝癌细胞，0.1ml/孔，每个稀释度做6个重复，37℃作用1h，每孔补加维持液0.1ml/孔，同时设阳性对照孔和正常细胞对照孔，6孔/组，置37℃、含5％CO2培养箱中培养，连续观察5日，记录病变孔数，根据Reed-Muench法计算禽腺病毒中和抗体效价，在免疫后21天，通过胸部肌肉接种方式对免疫鸡进行100个LD50病毒量进行攻毒试验。攻毒后连续观察14日，统计免疫保护率，试验结果如下表2所示。
表2中和抗体测定及攻毒结果
组别 免疫剂量(ml) 21天中和抗体效价均值 保护率
实施例2 0.3 1:131.5 100％
对比例1 0.3 1:92.5 80％
对比例2 0.3 1:90.6 80％
对比例3 0.3 1:82.3 80％
对照组 0.3(PBS) ≤1:4 0％
由上表2可知，攻毒保护结果显示，免疫后21天攻毒，实施例2组鸡100％保护，观察期内未见任何异常现象，剖检未见腺病毒相关组织病变。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法，包括LMH细胞系制备，病毒接种繁殖，病毒收集、浓缩、纯化和疫苗成品配制步骤，其特征在于，所述LMH细胞系制备包括以下步骤：
S1、使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及0.01～1.0％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对LMH细胞进行培养，至细胞生长至30～55％密度，使用胰酶-EDTA对细胞进行消化和分散；
S2、使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及0.5～2.0％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S1得到的LMH细胞进行培养，至细胞生长至60～75％密度，使用胰酶-EDTA对细胞进行消化和分散；
S3、使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及1.5～3.2％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S2得到的LMH细胞进行培养，直至形成生长良好的细胞单层。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1所述细胞培养液中新生牛血清含量为0.8％(v/v)，所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量为0.25％(v/v)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2所述细胞培养液中新生牛血清含量为0.8％(v/v)，所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量为1.25％(v/v)。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3所述细胞培养液中新生牛血清含量为0.8％(v/v)，所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量为2.5％(v/v)。
5.如权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述病毒接种繁殖步骤具体为：
将禽腺病毒4型接种到制备得到的LMH细胞单层中并进行病毒吸附，使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清和100IU/ml青霉素的细胞维持液于37℃、5％CO2培养60h，直至细胞病变CPE达到80％以上，收获细胞毒液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述病毒收集、浓缩、纯化步骤具体为：将收获的细胞毒液于-20℃反复冻融2～3次，离心，超滤浓缩，即得制苗病毒液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述疫苗成品配制步骤具体为：往制苗毒液中加入灭活剂进行灭活，得疫苗抗原，往疫苗抗原中加入常规乳化剂乳化制得灭活疫苗。
8.一种禽腺病毒4型疫苗，其特征在于，通过将权利要求6所述的制备方法制备得到的禽腺病毒4型病毒液进行病毒含量测定，测得每0.1ml病毒液含量为108.5TCID50以上，灭活，浓缩，加入常规的疫苗抗原乳化剂制得。
9.一种鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗，其特征在于，通过将权利要求6所述的制备方法制备得到的禽腺病毒4型病毒液和鸡传染性法氏囊病毒液等体积混合，使得每0.1ml水相中禽腺病毒4型病毒含量≥108.5TCID50，鸡传染性法氏囊病毒含量≥108.0TCID50，灭活，浓缩，加入常规的疫苗抗原乳化剂制得。
10.一种鸡新城疫、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型三联灭活疫苗，其特征在于，通过将权利要求6所述的制备方法制备得到的禽腺病毒4型病毒液与鸡新城疫病毒液和禽流感病毒液等体积混合，使得每0.1ml水相中禽腺病毒4型病毒含量≥108.5TCID50，鸡新城疫病毒含量＞108.3TCID50，禽流感H9亚型病毒≥107.5TCID50，灭活，浓缩，加入常规的疫苗抗原乳化剂制得。
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