CN102978166A - 使用连续传代的细胞系制备新城疫病毒与疫苗的方法及其制品 - Google Patents

Abstract

本发明使用细胞系生产新城疫病毒与疫苗，特别是使用常见易培养的细胞系如MDCK、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等细胞系生产新城疫病毒及疫苗。本发明的方法使用培养病毒的细胞系是成熟的商业化的细胞系，具有生产工艺简单稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量。利用本发明生产的新城疫疫苗安全性好、免疫力高，对新城疫强毒攻击具有完全的免疫保护作用。

Description

使用连续传代的细胞系制备新城疫病毒与疫苗的方法及其制品

技术领域

本发明涉及一种鸡新城疫病毒与疫苗的方法及其制品，特别是指一种用细胞系制备鸡新城疫病毒与疫苗的方法及其制品。

背景技术

新城疫病毒(NDV)属于副粘病毒科，是一种新城疫病毒单股负链RNA病毒。新城疫是NDV引起的一种急性败血性、高度传染性疾病，死亡率极高，对我国养禽业危害性极大。防治NDV的措施主要靠疫苗接种，特别是弱毒疫苗的应用。目前主要是用鸡胚生产NDV疫苗，而用鸡胚生产疫苗就有可能使疫苗中污染一些垂直传播疾病的病原，致使这些疾病随疫苗的应用而发生传播。使用异原传代细胞制备NDV疫苗，可以避免散播其他疾病的危险。但是新城疫病毒在上述传代细胞中的繁殖不理想，不能实现新城疫病毒在传代细胞中的有效增殖，因此，目前新城疫病毒与新城疫疫苗的制备依然需要在鸡胚中接种并繁殖，而如上所述的鸡胚生产病毒与疫苗的缺点则限制了其应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供用细胞系生产新城疫病毒与疫苗的方法，特别是使用常见易培养的细胞系如MDCK、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等细胞系生产新城疫病毒及疫苗的方法。该方法使用培养病毒的细胞系是成熟的商业化的细胞系，具有生产工艺简单稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量。利用本发明生产的新城疫疫苗安全性好、免疫力高，对新城疫强毒攻击具有完全的免疫保护作用。

技术方案

因此，本发明首先提供了一种用细胞系生产新城疫病毒的方法，包括以下步骤：

1.一种用细胞系生产新城疫病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)细胞的培养：将细胞系经消化传代，以细胞培养液进行培养，形成生长良好的细胞单层；

2)病毒接种与吸附：将新城疫病毒接种于上述生长良好的细胞单层，进行病毒吸附；

3)细胞的孵育：换用细胞维持液培养后，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量为维持液的0.1％v/v)孵育；

4)病毒的繁殖：将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系以繁殖新城疫病毒；

5)病毒的收获：收获含有新城疫病毒的培养液。

优选的，本发明所述的步骤2)中接种用的新城疫病毒是使用细胞系生产的新城疫病毒。

优选的，本发明所述的新城疫病毒是新城疫病毒Lasota株。

优选的，本发明所述的细胞系为：MDBK细胞系、VeroE6细胞系、BHK-21细胞系、PK-15细胞系、IBRS-2细胞系的任意一种或几种。

最优选的，本发明所述的细胞系为：BHK-21细胞系。

优选的，本发明所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖、干扰素或脂多糖；更优选地，孵育剂为D-氨基葡萄糖。

优选的，本发明所述的细胞孵育时间为20-40min，更优选地，孵育时间为30min

优选的，本发明所述的细胞生长液的血清含量为1％-7％v/v；更优选地，细胞生长液的血清含量为5％-6％v/v；最优选地，细胞生长液的血清含量为6％v/v。

优选的，本发明所述的细胞维持液为无血清的细胞培养液。

本发明的另一目的在于提供上述方法制备的新城疫病毒，所述新城疫病毒为使用细胞系生产新城疫病毒。

本发明的又一目的在于提供一种用细胞系生产新城疫疫苗的方法，即使用上述方法获得的新城疫病毒，加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为新城疫疫苗。

最后，本发明还提供了一种根据上述方法制备的新城疫疫苗，由于新城疫病毒为使用细胞系生产的，因此，所述新城疫疫苗也是使用细胞系生产新城疫疫苗。

由上可以看出，发明人意外地发现在鸡新城疫病毒繁殖时对细胞系进行细胞孵育可以帮助鸡新城疫病毒适应细胞系，特别是通过在生产用毒种和制苗用病毒中均使用孵育剂进行孵育，使得用细胞系繁殖鸡新城疫病毒成为了可能，从而实现了用细胞系生产鸡新城疫疫苗。而在现有技术中，国内外范围内无论使用MDCK、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等何种细胞系，或者使用同步培养、带毒传代等方法，都没有实现鸡新城疫病毒在细胞系中获得有效的增殖，并达到利用细胞系生产鸡新城疫疫苗的目的。

其次，发明人还发现在细胞的培养中使用低血清的细胞培养液，而在细胞的孵育和病毒的增殖中换用无血清的细胞维持液，可以帮助鸡新城疫病毒适应细胞系，促进病毒在细胞系的增殖，而在细胞生长阶段又不影响良好细胞单层的形成，因此本发明可以在不对细胞系进行调整的情况下，进行鸡新城疫病毒的增殖。

最后，本发明使用细胞系培养鸡新城疫病毒与生产鸡新城疫疫苗的方法，具有生产工艺简单稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量。利用本发明生产的新城疫疫苗安全性好、免疫力高，对新城疫强毒攻击具有完全的免疫保护作用。

因此，本发明的鸡新城疫疫苗可以替代传统的鸡胚培养获得鸡新城疫疫苗，避免了鸡胚培养获得的鸡新城疫疫苗可能存在的垂直污染、病毒繁殖工艺受鸡胚数量难以放大等缺点，适合工业化大规模的生产鸡新城疫病毒与疫苗。

具体实施方式

本发明实施例中使用了常见的商业化的容易培养的细胞系，如MDCK、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2、SK6等细胞系，生产鸡新城疫病毒及疫苗。上述细胞系均可以在市场上购买，属于本领域常用的细胞系。

本发明实施例中接种用的鸡新城疫病毒，优选使用细胞系生产获得的鸡新城疫病毒；但是使用细胞系生产的接种用的鸡新城疫病毒的目的仅为了提高接种用的鸡新城疫病毒的效价和使得接种用的鸡新城疫病毒更适应在细胞中生长，获得疫苗的效力更佳。因此，本发明的接种用鸡新城疫病毒并不限于使用经细胞系培养的鸡新城疫病毒，其他来源的鸡新城疫病毒如组织来源的鸡新城疫病毒液也可以用于接种细胞系生产鸡新城疫病毒及疫苗。

本发明的细胞培养液中血清为胎牛血清，其他的动物性血清如兔血清、羊血清等均可以作为细胞生长液，只要其血清含量比常规使用情况下的血清含量低，使得鸡新城疫病毒更容易适应在细胞中的生长，而又不影响细胞本身形成良好单层细胞即可。

本发明的疫苗为新城疫灭活疫苗或活疫苗，其他方法获得的新城疫疫苗，如，使用弱化病毒制备活疫苗，或使用基因工程方法获得转基因病毒及疫苗，也可以使用本发明的细胞系培养方法制备获得。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例1 SK6细胞系生产鸡新城疫病毒与鸡新城疫疫苗

本实施例中，选择猪肾细胞系SK6(购自武汉大学中国典型微生物保藏中心)作为生产鸡新城疫病毒与鸡新城疫疫苗的细胞系，鸡新城疫病毒Lasota毒种购自中国兽医药品监察所，以下为生产鸡新城疫病毒与疫苗的具体步骤：

1)生产用鸡新城疫病毒种的制备：使用上述细胞生长液培养SK6细胞至形成良好的细胞单层，接种鸡新城疫病毒并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量为维持液的0.1％v/v)孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得生产用鸡新城疫病毒种子，具体步骤为：

将鸡新城疫病毒Lasota毒种，接种生长良好的SK6单层细胞培养中，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液(100％v/vMEM(Invitrogen公司生产)液，不添加血清，pH值调整为7.3)在37℃中培养。6个小时后加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量为维持液的0.1％v/v)孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-15℃保存，作为生产用毒种。

2)制苗用鸡新城疫病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用鸡新城疫病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用鸡新城疫病毒，具体步骤为：

将猪肾SK6细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液(90％v/vMEM(Invitrogen公司生产)液，9％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.3)于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒。

将上述细胞生长液培养获得的生长良好的SK6细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在SK6细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量为维持液的0.1％v/v)半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有鸡新城疫病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到鸡新城疫病毒液。

制苗用鸡新城疫病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验HA效价及EID₅₀的测定，HA效价凝集价为9log2，同时每0.1ml病毒液的病毒含量为10^9.0EID₅₀将得到的鸡新城疫病毒液置于-20℃进行保存。

3)疫苗的制备：在上述收获的含有鸡新城疫病毒的培养液加入加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合甲醛溶液的终浓度为0.1％。加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后37℃灭活16h(以瓶内温度达到37℃开始计时)期间振摇3～4次。灭活后置2～8℃保存，保藏时间不超过1个月，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品鸡新城疫疫苗，具体步骤如下：

水相制备：分装后2～8℃保存即可完成鸡新城疫灭活疫苗的制备。4％加体积吐温-80，充分摇匀，使吐温-80完全溶解，即为水相。

油相制备白油94份、司本-806份，混合后加硬脂酸铝1.5份，将3种成分混合加热完全溶解后，121℃高压灭菌40min，冷却后备用，即为油相。

乳化按水相∶油相＝1∶2的比例乳化。将乳化机的转子在75体积％酒精中浸泡过夜后备用。先加油相2份于灭菌容器中，开动电机慢慢搅拌，然后徐徐加入水相1份，加完后再以2800rpm乳化4分钟。在终止乳化前加入1体积％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01体积％。制备三批，批号为SK601、SK602、SK603

4)SK6细胞新城疫疫苗的安全性与效力检验

4.1安全性试验

取3～6周龄SPF鸡10只，每只肌肉分点注射二联苗1.0ml，连续观察14天，应不发生因注射疫苗而出现的任何局部及全身反应，结过见表1。

表1疫苗安全检验

″-″标示没有局部反应

4.2免疫效力检验

30～60龄SPF鸡，每组10只，皮下或肌肉注射苗7ul，设对照组10只不免疫。接种后21日后采血，分离血清，用鸡新城疫抗原测定HI抗体效价。免疫组NDV的HI抗体效价的几何平均值≥4log2，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值≤2log2。结果见表2。

表2疫苗的效力检验

备注：合格、符合规定均是指符合中华人民共和国国兽药典2005年版3部“新城疫灭活疫苗”项下的规定

实施例2 MDCK细胞系生产鸡新城疫病毒与鸡新城疫疫苗

MDCK细胞生产鸡新城疫病毒与鸡新城疫疫苗的方法

本实施例中，选择MDCK细胞(购自中国典型培养物保藏中心)作为生产鸡新城疫病毒与鸡新城疫疫苗的细胞系，鸡新城疫病毒Lasota毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：95％v/v D-MEM(Invitrogen公司生产)液，5％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：100％v/vD-MEM(Invitrogen公司生产)液，不添加血清，pH值调整为7.2。

以下为使用MDCK细胞生产鸡新城疫病毒与疫苗的具体步骤：

1)生产用鸡新城疫病毒种的制备：

使用上述细胞生长液培养MDCK细胞至形成良好的细胞单层，接种鸡新城疫病毒并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量为维持液的0.1％v/v)孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得生产用鸡新城疫病毒种子，具体步骤为：

将鸡新城疫病毒Lasota毒种，接种生长良好的MDCK细胞单层细胞培养中，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液(100％v/vMEM(Invitrogen公司生产)液，不添加血清，pH值调整为7.3)在37℃中培养。6个小时后加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量为维持液的0.1％v/v)孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-15℃保存，作为生产用毒种。

2)制苗用鸡新城疫病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用鸡新城疫病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量为维持液的0.1％v/v)孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用鸡新城疫病毒，具体步骤为：

将上述细胞生长液培养获得的生长良好的MDCK细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在MDCK细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量为维持液的0.1％v/v)半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有鸡新城疫病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到鸡新城疫病毒液。

制苗用鸡新城疫病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验HA效价及EID₅₀的测定，HA效价凝集价为9log2，同时每0.1ml病毒液的病毒含量为10^9.0EID₅₀将得到的鸡新城疫病毒液置于-20℃进行保存

3)疫苗的制备：在上述收获的含有鸡新城疫病毒的培养液加入加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合甲醛溶液的终浓度为0.1％。加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后37℃灭活16h(以瓶内温度达到37℃开始计时)期间振摇3～4次。灭活后置2～8℃保存，保藏时间不超过1个月，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品鸡新城疫疫苗，具体步骤如下：

水相制备：分装后2～8℃保存即可完成鸡新城疫灭活疫苗的制备。4％加体积吐温-80，充分摇匀，使吐温-80完全溶解，即为水相。

油相制备白油94份、司本-806份，混合后加硬脂酸铝1.5份，将3种成分混合加热完全溶解后，121℃高压灭菌40min，冷却后备用，即为油相。

乳化按水相∶油相＝1∶2的比例乳化。将乳化机的转子在75体积％酒精中浸泡过夜后备用。先加油相2份于灭菌容器中，开动电机慢慢搅拌，然后徐徐加入水相1份，加完后再以2800rpm乳化4分钟。在终止乳化前加入1体积％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01体积％。制备三批，批号为MDCK01、MDCK02、MDCK603

4)鸡新城疫疫苗的安全性与效力检验

取3～6周龄SPF鸡10只，每只肌肉分点注射二联苗1.0ml，连续观察14天，应不发生因注射疫苗而出现的任何局部及全身反应，结过见表3。

表3安全检验

″-″标示没有局部反应

免疫效力检验

30～60日龄SPF鸡，每组10只，皮下或肌肉注射苗7ul，设对照组10只不免疫。接种后21日后采血，分离血清，用鸡新城疫抗原测定HI抗体效价。免疫组NDV的HI抗体效价的几何平均值应≥4log2，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应≤2log2。结果见表4。

表4效力检验

备注：合格、符合规定是指符合中华人民共和国国兽药典2005年版3部“新城疫灭活疫苗”的规定

实施例3 VeroE6细胞系生产鸡新城疫病毒与鸡新城疫疫苗

1.VeroE6细胞生产鸡新城疫病毒与鸡新城疫疫苗的方法

本实施例中，选择VeroE6细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)作为生产鸡新城疫病毒与鸡新城疫疫苗的细胞系，鸡新城疫病毒Lasota毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：94％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，6％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：100％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，不添加血清，pH值调整为7.2。

以下为使用VeroE6细胞生产鸡新城疫病毒与疫苗的具体步骤：

1)生产用鸡新城疫病毒种的制备：使用上述细胞生长液培养VeroE6细胞至形成良好的细胞单层，接种鸡新城疫病毒并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，收获病毒液，即获得生产用鸡新城疫病毒种子，具体步骤为：

将鸡新城疫病毒Lasota毒种，接种生长良好的VeroE6细胞单层细胞培养中，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液(100％v/vMEM(Invitrogen公司生产)液，不添加血清，pH值调整为7.3)在37℃中培养。6个小时后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-15℃保存，作为生产用毒种。

2)制苗用鸡新城疫病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用鸡新城疫病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用鸡新城疫病毒，具体步骤为：

将细胞生长液培养获得的生长良好的VeroE6细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在VeroE6细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有鸡新城疫病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到鸡新城疫病毒液。

制苗用鸡新城疫病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验HA效价及EID₅₀的测定，HA效价凝集价为9log2，同时每0.1ml病毒液的病毒含量为10^9.0EID₅₀将得到的鸡新城疫病毒液置于-20℃进行保存。

3)疫苗的制备：在上述收获的含有鸡新城疫病毒的培养液加入加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合甲醛溶液的终浓度为0.1％。加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后37℃灭活16h(以瓶内温度达到37℃开始计时)期间振摇3～4次。灭活后置2～8℃保存，保藏时间不超过1个月，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品鸡新城疫疫苗，具体步骤如下：

水相制备：分装后2～8℃保存即可完成鸡新城疫灭活疫苗的制备。4％加体积吐温-80，充分摇匀，使吐温-80完全溶解，即为水相。

油相制备白油94份、司本-806份，混合后加硬脂酸铝1.5份，将3种成分混合加热完全溶解后，121℃高压灭菌40min，冷却后备用，即为油相。

乳化按水相∶油相＝1∶2的比例乳化。将乳化机的转子在75体积％酒精中浸泡过夜后备用。先加油相2份于灭菌容器中，开动电机慢慢搅拌，然后徐徐加入水相1份，加完后再以2800rpm乳化4分钟。在终止乳化前加入1体积％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01体积％。制备三批，批号为VeroE601、VeroE602、VeroE603.

4)鸡新城疫疫苗的安全性与效力检验

取3～6周龄SPF鸡10只，每只肌肉分点注射二联苗1.0ml，连续观察14天，应不发生因注射疫苗而出现的任何局部及全身反应，结过见表5。

表5疫苗安全检验

″-″标示没有局部反应

免疫效力检验

30～60日龄SPF鸡，每组10只，皮下或肌肉注射苗7ul，设对照组10只不免疫。接种后21日后采血，分离血清，用鸡新城疫抗原测定HI抗体效价。免疫组NDV的HI抗体效价的几何平均值应≥4log2，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应≤2log2。结果见表6。

表6疫苗的效力检验

备注：合格、符合规定是指符合中华人民共和国国兽药典2005年版3部“新城疫灭活疫苗”项下的规定

实施例4 BHK-21细胞生产鸡新城疫病毒与鸡新城疫疫苗的方法

本实施例中，选择BHK-21细胞(购自中国兽医药品监察所)作为生产鸡新城疫病毒与鸡新城疫疫苗的细胞系，鸡新城疫病毒Lasota毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：95％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，5％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：100％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，不添加血清，pH值调整为7.2。

以下为使用BHK-21细胞生产鸡新城疫病毒与疫苗的具体步骤：

1)生产用鸡新城疫病毒种的制备：使用上述细胞生长液培养BHK-21细胞至形成良好的细胞单层，接种鸡新城疫病毒并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量为维持液的0.1％v/v)孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得生产用鸡新城疫病毒种子，具体步骤为：

将BHK-21细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液，pH值调整为7.2)于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；其次，将鸡新城疫病毒LASOTA毒种(购自中国兽医药品监察所)用pH7.2磷酸盐缓冲液10倍稀释，接种生长良好的BHK-21单层细胞培养中，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-15℃保存，作为生产用毒种。

2)制苗用鸡新城疫病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用鸡新城疫病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量为维持液的0.1％v/v)孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用鸡新城疫病毒，具体步骤为：

将上述细胞生长液培养获得的生长良好的BHK-21细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在BHK-21细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有鸡新城疫病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到鸡新城疫病毒液。

制苗用鸡新城疫病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验HA效价及EID₅₀的测定，HA效价凝集价为9log2，同时每0.1ml病毒液的病毒含量为10^9.0EID₅₀将得到的鸡新城疫病毒液置于-20℃进行保存。

3)疫苗的制备：在上述收获的含有鸡新城疫病毒的培养液加入加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合甲醛溶液的终浓度为0.1％。加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后37℃灭活16h(以瓶内温度达到37℃开始计时)期间振摇3～4次。灭活后置2～8℃保存，保藏时间不超过1个月，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品鸡新城疫疫苗，具体步骤如下：

水相制备：分装后2～8℃保存即可完成鸡新城疫灭活疫苗的制备。4％加体积吐温-80，充分摇匀，使吐温-80完全溶解，即为水相。

油相制备白油94份、司本-806份，混合后加硬脂酸铝1.5份，将3种成分混合加热完全溶解后，121℃高压灭菌40min，冷却后备用，即为油相。

乳化按水相∶油相＝1∶2的比例乳化。将乳化机的转子在75体积％酒精中浸泡过夜后备用。先加油相2份于灭菌容器中，开动电机慢慢搅拌，然后徐徐加入水相1份，加完后再以2800rpm乳化4分钟。在终止乳化前加入1体积％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01体积％。制备三批，批号为BHK-2101、BHK-2102、BHK-2103.

4)鸡新城疫疫苗的安全性与效力检验

取3～6周龄SPF鸡10只，每只肌肉分点注射二联苗1.0ml，连续观察14天，应不发生因注射疫苗而出现的任何局部及全身反应，结过见表7。

表7疫苗安全检验

″-″标示没有局部反应

免疫效力检验

30～60日龄SPF鸡，每组10只，皮下或肌肉注射苗7ul，设对照组10只不免疫。接种后21日后采血，分离血清，用鸡新城疫抗原测定HI抗体效价。免疫组NDV的HI抗体效价的几何平均值应≥4log2，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应≤2log2。结果见表8。

表8疫苗的效力检验

备注：合格、符合规定是指符合中华人民共和国国兽药典2005年版3部“新城疫灭活疫苗”项下的规定

实施例5 PK-15细胞系生产鸡新城疫病毒与鸡新城疫疫苗

1.PK-15细胞生产鸡新城疫病毒与鸡新城疫疫苗的方法

本实施例中，选择PK-15细胞(购自中国兽医药品监察所)作为生产鸡新城疫病毒与鸡新城疫疫苗的细胞系，鸡新城疫病毒Lasota株毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：94％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，6％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：100％DMEM(Invitrogen公司生产)液，不添加血清，pH值调整为7.2。

以下为使用PK-15细胞生产鸡新城疫病毒与疫苗的具体步骤：

1)生产用鸡新城疫病毒种的制备：使用上述细胞生长液培养PK-15细胞至形成良好的细胞单层，接种鸡新城疫病毒并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量为维持液的0.1％v/v)孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得生产用鸡新城疫病毒种子，具体步骤为：

将猪肾PK-15细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；其次，将鸡新城疫病毒LASOTA株毒种(购自中国兽医药品监察所)用pH7.2磷酸盐缓冲液10倍稀释，接种生长良好的PK-15单层细胞培养中，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-15℃保存，作为生产用毒种。

2)制苗用鸡新城疫病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用鸡新城疫病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量为维持液的0.1％v/v)孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用鸡新城疫病毒，具体步骤为：

将上述细胞生长液培养获得的生长良好的PK-15细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在PK-15细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有鸡新城疫病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到鸡新城疫病毒液。

制苗用鸡新城疫病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验HA效价及EID₅₀的测定，HA效价凝集价为9log2，同时每0.1ml病毒液的病毒含量为10^9.0EID₅₀将得到的鸡新城疫病毒液置于-20℃进行保存。

3)疫苗的制备：在上述收获的含有鸡新城疫病毒的培养液加入加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合甲醛溶液的终浓度为0.1％。加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后37℃灭活16h(以瓶内温度达到37℃开始计时)期间振摇3～4次。灭活后置2～8℃保存，保藏时间不超过1个月，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品鸡新城疫疫苗，具体步骤如下：

水相制备：分装后2～8℃保存即可完成鸡新城疫灭活疫苗的制备。4％加体积吐温-80，充分摇匀，使吐温-80完全溶解，即为水相。

油相制备白油94份、司本-806份，混合后加硬脂酸铝1.5份，将3种成分混合加热完全溶解后，121℃高压灭菌40min，冷却后备用，即为油相。

乳化按水相∶油相＝1∶2的比例乳化。将乳化机的转子在75体积％酒精中浸泡过夜后备用。先加油相2份于灭菌容器中，开动电机慢慢搅拌，然后徐徐加入水相1份，加完后再以2800rpm乳化4分钟。在终止乳化前加入1体积％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01体积％。制备三批，批号为PK-1501、PK-1502、PK-1503.

4)鸡新城疫疫苗的安全性与效力检验

取3～6周龄SPF鸡10只，每只肌肉分点注射二联苗1.0ml，连续观察14天，应不发生因注射疫苗而出现的任何局部及全身反应，结过见表9。

表9疫苗安全检验

”-”标示没有局部反应

免疫效力检验

30～60日龄SPF鸡，每组10只，皮下或肌肉注射苗7ul，设对照组10只不免疫。接种后21日后采血，分离血清，用鸡新城疫抗原测定HI抗体效价。免疫组NDV的HI抗体效价的几何平均值应≥4log2，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应≤2log2。结果见表10。

表10疫苗的效力检验

备注：合格、符合规定是指符合中华人民共和国国兽药典2005年版3部“新城疫灭活疫苗”项下的规定

实施例6 IBRS-2细胞系生产鸡新城疫病毒与鸡新城疫疫苗

1.IBRS-2细胞生产鸡新城疫病毒与鸡新城疫疫苗的方法

本实施例中，选择IBRS-2细胞(购自中国兽医药品监察所)作为生产鸡新城疫病毒与鸡新城疫疫苗的细胞系，鸡新城疫病毒Lasota株毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：95％v/v MEM41500(Invitrogen公司生产)液，5％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：100％MEM41500(Invitrogen公司生产)液，不添加血清，pH值调整为7.2。

以下为使用IBRS-2细胞生产鸡新城疫病毒与疫苗的具体步骤：

1)生产用鸡新城疫病毒种的制备：使用上述细胞生长液培养IBRS-2细胞至形成良好的细胞单层，接种鸡新城疫病毒并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量为维持液的0.1％v/v)孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得生产用鸡新城疫病毒种子，具体步骤为：

将IBRS-2细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；其次，将鸡新城疫病毒Lasota株(购自中国兽医药品监察所)用pH7.2磷酸盐缓冲液10倍稀释，接种生长良好的IBRS-2单层细胞培养中，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-15℃保存，作为生产用毒种。

2)制苗用鸡新城疫病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用鸡新城疫病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖(加入量为维持液的0.1％v/v)孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用鸡新城疫病毒，具体步骤为：

将上述细胞生长液培养获得的生长良好的IBRS-2细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在IBRS-2细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有鸡新城疫病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到鸡新城疫病毒液。

制苗用鸡新城疫病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验HA效价及EID₅₀的测定，HA效价凝集价为9log2，同时每0.1ml病毒液的病毒含量为10^9.0EID₅₀将得到的鸡新城疫病毒液置于-20℃进行保存。

3)疫苗的制备：在上述收获的含有鸡新城疫病毒的培养液加入加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合甲醛溶液的终浓度为0.1％。加甲醛溶液后最好倾倒另一瓶中，以避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后37℃灭活16h(以瓶内温度达到37℃开始计时)期间振摇3～4次。灭活后置2～8℃保存，保藏时间不超过1个月，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品鸡新城疫疫苗，具体步骤如下：

水相制备：分装后2～8℃保存即可完成鸡新城疫灭活疫苗的制备。4％加体积吐温-80，充分摇匀，使吐温-80完全溶解，即为水相。

油相制备白油94份、司本-806份，混合后加硬脂酸铝1.5份，将3种成分混合加热完全溶解后，121℃高压灭菌40min，冷却后备用，即为油相。

乳化按水相∶油相＝1∶2的比例乳化。将乳化机的转子在75体积％酒精中浸泡过夜后备用。先加油相2份于灭菌容器中，开动电机慢慢搅拌，然后徐徐加入水相1份，加完后再以2800rpm乳化4分钟。在终止乳化前加入1体积％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01体积％。制备三批，批号为IBRS-201、IBRS-202、IBRS-203.

4)鸡新城疫疫苗的安全性与效力检验

取3～6周龄SPF鸡10只，每只肌肉分点注射二联苗1.0ml，连续观察14天，应不发生因注射疫苗而出现的任何局部及全身反应，结过见表11。

表11疫苗安全检验

″-″标示没有局部反应

免疫效力检验

30～60日龄SPF鸡，每组10只，皮下或肌肉注射苗7ul，设对照组10只不免疫。接种后21日后采血，分离血清，用鸡新城疫抗原测定HI抗体效价。免疫组NDV的HI抗体效价的几何平均值应≥4log2，未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应≤2log2。结果见表12。

表12疫苗的效力检验

备注：合格、符合规定是指符合中华人民共和国国兽药典2005年版3部“新城疫灭活疫苗”项下的规定。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种用细胞系生产新城疫病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)细胞的培养：将细胞系经消化传代，以细胞培养液进行培养，形成生长良好的细胞单层；

2)病毒接种与吸附：将新城疫病毒接种于上述生长良好的细胞单层，进行病毒吸附；

3)细胞的孵育：换用细胞维持液培养后，加入300mmol/L的D-氨基葡萄糖孵育；

4)病毒的繁殖：将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系以繁殖新城疫病毒；

5)病毒的收获：收获含有新城疫病毒的培养液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中接种用的新城疫病毒是使用细胞系生产的新城疫病毒。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的新城疫病毒是新城疫病毒Lasota株。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述的细胞系为：MDBK细胞系、VeroE6细胞系、BHK-21细胞系、PK-15细胞系、IBRS-2细胞系的任意一种或几种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的细胞系为：BHK-21细胞系。

6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖、干扰素或脂多糖。

7.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述的细胞孵育时间为20-40min。

8.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述的细胞生长液的血清含量为1％-7％v/v。

9.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述的细胞维持液为无血清的细胞培养液。

10.一种根据权利要求1-8任意一项所述的方法制备的新城疫病毒，其特征在于，使用细胞系生产新城疫病毒。

11.一种用细胞系生产新城疫疫苗的方法，其特征在于，使用权利要求10所述的新城疫病毒，加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为新城疫疫苗。

12.一种根据权利要求11所述的方法制备的新城疫疫苗，其特征在于，使用细胞系生产新城疫疫苗。