CN103127496B - Iii型火鸡疱疹病毒冻干疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，公开了一种利用细胞工厂制备鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒Fc126株活疫苗的方法及其利用这种方法制备的火鸡疱疹病毒疫苗(Fc126株)。本发明通过细胞工厂生产的火鸡疱疹病毒活疫苗(Fc126株)质量优良，免疫效力高，免疫效果稳定；除此之外，其还有代次低、PFU含量高、成本低、操作工艺简单易控制等优点。

Description

III型火鸡疱疹病毒冻干疫苗

技术领域

本发明涉及一种III型火鸡疱疹病毒疫苗，特别是指一种III型火鸡疱疹病毒冻干疫苗。

背景技术

III型的火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗是由美国学者WritterRL博士从火鸡群中分离出来的1株无毒力品系，对鸡和火鸡均不致病，在鸡群内部传播，接种这种疫苗的鸡体，细胞中的HVT能使机体产生抗体，但不能中和MDV。该疫苗具有干扰作用。该疫苗的广泛应用，可有效抵抗强毒。既可以以细胞结合性方式存在，又有少量可游离于细胞外。其优点是可制成易于储存、便于运输的冻干苗，20世纪70年代开始，HVT疫苗发挥了巨大作用。

考虑到HVT疫苗保存、运输和使用方便，成本低廉，在卫生状况良好，未收到超强毒攻击的地区，仍使用HVT疫苗预防MDV的爆发，因此火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗在较长的时期内是不可能被完全取代的。然而，市场上的主要HVT疫苗基本是使用转瓶或摇瓶培养获得，上述方法的劳动强度大，占地空间大，操作过程易污染；单位体积提供的细胞生长面积有限，细胞密度低；培养的环境条件难以检测和控制，批间差异大，疫苗产量及质量受到极大限制。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种III型火鸡疱疹病毒疫苗及其制备方法，以实现使用细胞工厂生产一种质量优良，免疫效力高，免疫效果稳定的III型火鸡疱疹病毒疫苗或冻干疫苗。

技术方案

本发明提供了一种III型火鸡疱疹病毒疫苗，每支成品所含病毒蚀斑数不低于4×10⁶PFU的火鸡疱疹病毒，可稀释成2000羽份，每羽份蚀斑含量不低于2000PFU。

其中，所述火鸡疱疹病毒为使用细胞工厂培养获得。

优选地，本发明所述的火鸡疱疹病毒为火鸡疱疹病毒HVTFc126株病毒。

优选地，本发明所述的III型火鸡疱疹病毒疫苗为冻干疫苗。

本发明还提供了一种制备上述疫苗的方法，包括以下步骤：

1)制备鸡胚成纤维细胞悬液：选择鸡胚，采用连续消化法制备鸡胚成纤维细胞悬液，制成80～120万/ml的细胞密度，混匀后置于细胞工厂，置37℃培养箱静置培养24～36h；

2)接种工作毒种并培养病毒：

将步骤1)中培养24～36h生长状态良好的鸡胚成纤维细胞单层弃去培养液，以每平方厘米接种1000PFU～3000PFU含量的工作毒种，接种工作毒种，置37℃培养箱吸附1h后，补加2％w/v血清浓度的M199维持液至每层200ml，37℃继续培养；

3)收获：

培养至CPE达到70％以上时收获，弃去维持液，加入EDTA-胰酶混合消化液100～120ml/层，使消化液与细胞充分接触后，弃去胰酶液，加入2％w/v血清浓度的M199维持液150～250ml/层，停止消化；收集消化的细胞分装至离心瓶中，于1500r/min离心10～20分钟，弃上清，收集沉淀细胞；

4)裂解：收集沉淀细胞，加入稳定剂SPGA摇匀，取样做收获前无菌检验，进行活细胞计数后补加稳定剂SPGA，使活病毒含量达到4×10⁶PFU/ml以上，无菌进行超声波裂解，裂解时间为1min；

5)分装：

取裂解完后过滤，分装小瓶每支1ml，冻干后即得III型火鸡疱疹病毒疫苗成品。

优选地，本发明的方法中，所述火鸡疱疹病毒为火鸡疱疹病毒HVTFc126株病毒。

优选地，本发明的方法中，所述步骤1)的鸡胚成纤维细胞悬液培养时间为培养24h。

优选地，本发明的方法中，所述步骤2)和步骤4)的血清为血清I型、血清II或血清III。

优选地，本发明的方法中，在步骤5中还包括冻干步骤，即冻干保存或加入冷冻保护液，定量分装，液氮保存。

优选地，本发明的方法中，所述冻干步骤为：使用III型火鸡疱疹病毒疫苗成品，在-40℃入箱预冻，3～5h后进入干燥阶段，逐渐升高制品直至达到设定值后，保温2～4h，压塞出箱，-15℃以下保存，即获得III型火鸡疱疹病毒疫苗冻干苗。

优选地，本发明的方法在使用细胞工厂后，为了连续生产的需要，还包括细胞工厂清洗过程：即用灭菌超纯水反复清洗用过的细胞工厂3～5次，包装好，进行钴源照射消毒后以备重复使用。

由上可以看出，本发明使用细胞工厂生产火鸡疱疹病毒疫苗的方法，与现有技术中使用转瓶或摇瓶培养的方法相比，至少有以下优点：

(1)在细胞工厂中，细胞生长更接近自然状态，可形成均一的细胞单层；优于传统的转瓶材料对细胞的影响非常小，细胞的活力更强，病毒在细胞内生长更快，感染细胞率明显提高，细胞与外界接触的机会大大减少，人为污染的几率就更低；此外本发明的方法还有生产设备体积小，节省空间，更容易操作等优点。

(2)本发明生产的火鸡疱疹病毒疫苗或冻干疫苗质量优良，免疫效力高，免疫效果稳定，与国外进口同类疫苗相比具有相同的预防效果，除此之外还有代次低，PFU含量高、免疫原性好、成本低、在较短的时间内产生免疫保护等优点。

具体实施方式

本发明III型火鸡疱疹病毒为购自中国兽医药品监察所国家兽医微生物保藏中心的HVTFc126株，保藏号为CVCCAV19。其他血清型的鸡马立克氏病毒单价或多价活疫苗也可以使用本发明的方法制备。

本发明的疫苗为活疫苗或冻干活疫苗，其他类型的冻干疫苗如单价、二价或多价液氮疫苗可以使用本发明的方法获得。

本发明的疫苗使用的维持液为M199生长液，生产厂家是SIGMALifeScience。生长液是添加4％的牛血清的M199培养液，维持液是添加2％的牛血清的M199培养液。牛血清的生产厂家是PAALaboratoriesGmbH。其中，所述血清为血清I型，其他的血清型如血清II或血清III也可以用于本发明的方法。

本发明使用的细胞工厂为选用NUNC公司出品的Cellfactory40层(632cm²/层)，其他常用的细胞工厂也可以用于本发明的III型火鸡疱疹病毒疫苗的生产。

本发明使用的稳定剂SPGA的配方和配制方法为：蔗糖76.62g；磷酸二氢钾0.52g；磷酸氢二钾·3H₂O1.64g或磷酸氢二钾1.25g；L-谷氨酸单钠0.83g；牛血清白蛋白10g，补蒸馏水至1000ml，滤过除菌，冷冻保存备用。

下面通过具体的实施例对本发明进行详述，而并不应理解为限制本发明的保护范围：

实施例1火鸡疱疹病毒疫苗的制备工艺

制备火鸡疱疹病毒冻干活疫苗的制备工艺主要步骤如下：

(1)鸡胚成纤维细胞(CEF)单层的制备：

选择10日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酊棉球消毒气室部位，再用75％的酒精棉球脱碘，无菌挑出胚体置于无菌平皿中，用0.1M的PBS洗涤胚体并去除眼睛、爪及内脏，然后采用连续消化法制备CEF悬液，制成80-120万/ml的细胞密度，混匀后接种细胞工厂，每层150～250ml，4％血清浓度的M199生长液，盖好进液口盖，置37℃培养箱静置培养24～36h，长成细胞单层后备用；

(2)工作毒种的制备：

取冻干保存的种毒，HVTFc126株(保藏号为CVCCAV19购自中国兽医药品监察所国家兽医微生物保藏中心)，用SPG稀释液作适当稀释，取0.5ml接种于CEF单层上，37℃吸附30分钟后，加入含4％牛血清的M199生长液，37～38℃继续培养。当70％以上细胞出现折光圆形细胞及产生大量融合细胞时，以0.25％胰酶和EDTA(1∶4)混合液消化并分散细胞，收获的细胞经1000～1500r/min离心10分钟，弃上清液，沉淀细胞用适量营养液稀释，按上述方法连传1～2代后，收集离心沉淀细胞，加入适量SPGA稳定剂，裂解细胞，分装，冻干保存在-15℃以下。也可将收集的沉淀细胞加入适量的冷冻保护液，分装在小安瓿中，封口，注明收获日期、毒种代数等，保存在-196℃液氮中备用，即为工作毒种。

M199生长液：9.5g/l，配制完毕，调节PH值至7.2～7.4，然后过滤除菌备用。M199生长液是添加4％的牛血清的M199培养液，M199维持液是添加2％的牛血清的M199培养液。

(3)接种病毒：

将培养24～36h生长状态良好的细胞单层弃去培养液，接种含有工作毒种的2％血清浓度的M199维持液每层100ml，置37℃培养箱吸附1h后，补加维持液至每层200ml，继续培养，每天观察病变情况；

(4)收获：

当70％以上的细胞出现典型病变时，即可收获。弃去维持液，加入0.25％胰酶和EDTA(1∶4)混合液100ml/层，使消化液与细胞充分接触后，弃去胰酶液，加入2％血清浓度的M199维持液200ml/层，停止消化。收集分装至离心瓶中，于1500r/min离心15min，弃上清，收集沉淀细胞；

(5)裂解：

加入稳定剂SPGA将收集的沉淀细胞悬浮，摇匀，取样做收获前无菌检验，进行病毒计数后补加适量的SPGA，使每毫升所含的病毒蚀斑数不低于4×10⁶PFU/ml。无菌进行超声波裂解，裂解时间为1min；

(6)分装与冻干：

取裂解完样品经3～5层无菌纱布过滤，分装，冻干，-15℃以下保存；

(7)细胞工厂清洗：

用灭菌超纯水反复清洗用过的细胞工厂3-5次，包装好，进行钴源照射消毒后以备重复使用。

实施例2火鸡疱疹病毒免疫效果比较

设计实验，比较利用实施例1制备的经检验合格的低代次火鸡疱疹病毒活疫苗与参照2000年版《中华人民共和国兽用生物制品规程》提供的鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗制造及检验规程生产的火鸡疱疹病毒活疫苗的免疫效果。

(1)按生物制品规程的方法制苗

按实施例1的方法制备工作毒种，然后接种转瓶，收获细胞，裂解后冻干，经检验合格后即可备用。

(2)免疫

将100只由北京梅里亚维通实验技术有限公司提供的1日龄SPF鸡，随机分成4组，每组20只。免疫组共2组，分别接种实施例1生产的低代次火鸡疱疹病毒疫苗和采用《2000年生物制品规程》规程方法制备的火鸡疱疹病毒活疫苗，每只颈背部皮下注射0.2ml(含1000PFU)。另外2组为非免疫组，其中一组为不免疫也不攻毒对照组(空白对照)，另一组为攻毒对照组(阳性对照组)。4组鸡分别在隔离器中饲养，喂给消毒的饲料和饮水。

(3)攻毒

免疫后21天，将免疫组和阳性对照组分别接种马立克氏病标准强毒株京-1株(购自：由北京市农林科学院畜牧兽医研究所，经农业部批准发放，批号：980713)，1ml/支。攻毒时，用M199培养液作10倍稀释，每只鸡腹腔注射0.5ml。继续在隔离其中饲养，每天观察、记录发病和死亡情况，对死亡鸡及时剖检，观察病变。攻毒后63天，对存活鸡剖检观察肉眼病变，计算保护指数。

保护指数％＝(阳性对照组MD阳性率-免疫组MD阳性率/阳性对照组MD阳性率)×100％

(4)实验结果

疫苗免疫组的攻毒保护结果：

结果表明，两组火鸡疱疹疫苗均能有效抵抗MD标准强毒的攻击，保护指数分别为93.75％、87.50％。具体数据见表1。

注：括号中为实际统计结果。

实验结果显示经过工艺优化后，用细胞工厂生产的低代次火鸡疱疹病毒质量优良，免疫效力高，效果稳定，免疫效果明显高于使用2000年版《中华人民共和国兽用生物制品规程》提供的鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗制造及检验规程生产的火鸡疱疹病毒活疫苗。除此之外本发明生产的疫苗还有代次低、PFU含量高、成本低、操作工艺简单易控制等优点。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种制备III型火鸡疱疹病毒疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备鸡胚成纤维细胞悬液：选择鸡胚，采用连续消化法制备鸡胚成纤维细胞悬液，制成80～120万/ml的细胞密度，混匀后置于细胞工厂，置37℃培养箱静置培养24～36h，获得的鸡胚成纤维细胞单层；

2)接种工作毒种并培养病毒：

将获得的鸡胚成纤维细胞单层，弃去培养液，以每平方厘米接种2000PFU含量的火鸡疱疹病毒HVTFc126株的工作毒种，接种至鸡胚成纤维细胞单层中，置37℃培养箱吸附1h后，补加2％w/v血清浓度的M199维持液至每层200ml，37℃继续培养；

3)收获：

培养至CPE达到70％以上时收获，弃去维持液，加入EDTA-胰酶混合消化液100～120ml/层，使消化液与细胞充分接触后，弃去胰酶液，加入2％w/v血清浓度的M199维持液150～250ml/层，停止消化；收集消化的细胞分装至离心瓶中，于1500r/min离心10～20分钟，弃上清，收集沉淀细胞；

4)裂解：收集沉淀细胞，加入稳定剂SPGA摇匀，取样做收获前无菌检验，进行病毒计数后补加适量的SPGA，使所含的病毒蚀斑数不低于6×10⁶PFU/ml，无菌进行超声波裂解，裂解时间为1min；

5)分装：

取裂解完后过滤，分装小瓶每支1ml，即得III型火鸡疱疹病毒疫苗成品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)的鸡胚成纤维细胞悬液培养时间为培养24h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)和步骤3)的血清为血清Ⅰ型、血清Ⅱ型或血清Ⅲ型。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤5)中在所述过滤，分装之后，还包括冻干步骤，即冻干保存。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤5)结束后还包括细胞工厂清洗过程：即用灭菌超纯水反复清洗用过的细胞工厂3～5次，包装好，进行钴源照射消毒后以备重复使用。