CN103977400B - 一种用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，步骤为：A、选择细胞系作为制苗用细胞；B、制苗用细胞的传代与培养；C、细胞毒种的繁殖；D、制苗毒液的繁殖；E、配苗、分装、冻干或置液氮中冻存。本发明能够解决现有技术的不足，具有生产工艺稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量与质量。利用本发明生产的鸡马立克氏病活疫苗安全性好、免疫效力高，对鸡马立克氏病强毒株、超强毒株的攻击具有完全的免疫保护作用。

Description

一种用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其是一种用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法。

背景技术

我国目前生产鸡马立克氏病活疫苗所用的细胞为鸡胚成纤维原代细胞。虽然我国已规定制备禽用疫苗的鸡胚及细胞必须来源于无特定病原（SPF）鸡群，但在现实中，由于检测的滞后性及我国家禽饲养环境复杂，使得生产禽用疫苗的鸡胚细胞易造成细胞外源病毒污染，且疫苗效价不高，批间差异大，严重影响疫苗的产量与质量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法。该方法具有生产工艺稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量与质量。利用本发明生产的鸡马立克氏病活疫苗安全性好、免疫效力高，对鸡马立克氏病强毒株、超强毒株的攻击具有完全的免疫保护作用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，包括以下步骤：

A、选择细胞系作为制苗用细胞；

B、制苗用细胞的传代与培养

上述细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成单层时，用于继续传代或接种病毒；

C、细胞毒种的繁殖

用种毒稀释液，将鸡马立克氏病活疫苗毒种稀释成一定浓度，接种生长良好的制苗用细胞系或鸡胚成纤维细胞单层上，36.5-37.5℃吸附1小时，再加入维持液或二次细胞悬液，继续培养，当70%及以上单层细胞出现典型马立克氏病细胞病变时，以EDTA-胰酶细胞分散液消化并分散细胞，收获的细胞悬液用作制苗用毒种；

D、制苗毒液的繁殖

将鸡马立克氏病活疫苗制苗用毒种用维持液稀释，接种于已形成单层的细胞系单层上继续培养，当70%及以上单层细胞出现典型马立克氏病细胞病变时，收获感染细胞；

E、配苗、分装或冻干

将收获的感染细胞，加冻干保护剂和抗生素，定量分装后经冷冻真空干燥为成品；或加冻存保护液和抗生素，混匀后定量分装为成品，置液氮中冻存。

作为本发明的一种优选技术方案，所述细胞系为鸡胚胎DF-1细胞系。

为本发明的一种优选技术方案，鸡马立克氏病活疫苗为鸡马立克氏病血清I型CVI988/Rispens株疫苗，或814株疫苗，或血清II型SB-1株疫苗，或血清III型火鸡疱疹病毒 Fc-126株疫苗，或I+II型，或I+III型，或II+III型，或I+II+III型二价或三价疫苗。

为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，培养温度为36.5～37.5℃。

为本发明的一种优选技术方案，步骤C中，培养温度为36.5～37.5℃。

为本发明的一种优选技术方案，步骤D中，培养温度为36.5～37.5℃。

为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，细胞生长液的配方为：在体积比为5～10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，加入终浓度100～400单位/ml的抗生素，pH调整为7.0～7.2。

为本发明的一种优选技术方案，种毒稀释液或维持液的配方为：在体积比为1～5%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，或在含有体积比为1～5%新生牛血清的2倍199溶液和2倍水解乳蛋白溶液等量混合液中，加入终浓度100～400单位/ml的抗生素，pH调整为7.0～7.4。

为本发明的一种优选技术方案，步骤D中，鸡马立克氏病活疫苗毒种接毒量为500万～1500万PFU/1000ml维持液。

为本发明的一种优选技术方案，步骤E中，冻存保护液的配方为：体积百分比为15%的新生牛血清、体积百分比为10%的二甲基亚砜的199溶液；冻干保护剂为SPGA；加入抗生素的终浓度为100～400单位/ml。

    采用上述技术方案所带来的有益效果在于：

    用细胞系替代鸡胚成纤维原代细胞制造鸡马立克氏病活疫苗，可杜绝外源病毒潜在污染的问题，保证生产出来的疫苗纯粹，确保疫苗的安全性。

采用本发明制造的鸡马立克氏病活疫苗病毒含量高，免疫效力好，对鸡马立克氏病强毒株、超强毒株的攻击具有完全的免疫保护作用。

用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗各批间质量差异小，具有生产工艺简单稳定、易操作、产量大、成本低的特点，具备工业化大生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益和应用前景。

附图说明

    图1是本发明实施例2的原理图。

具体实施方式

实施例1

    毒种制备：从液氮中取出保存的CVI988/Rispens毒种，于37℃温水中速融（1分钟内）后，立即以1：5稀释于DF-1细胞生长液中，1000r/min离心10分钟，弃去上清液，用细胞生长液稀释为含20万PFU/ml，接种DF-1单层的100ml方瓶，每瓶接种0.5ml，36.5－37.5℃吸附1小时，加入维持液，置5%CO2 36.5-37.5℃培养2-4天，当70%单层出现细胞病变，产生大量融合细胞及折光圆形细胞时，以0.25%胰酶-0.02%EDTA(1:4)的细胞分散液消化并分散细胞，收获的细胞悬浮经1000r/min离心10分钟后,弃去上清液，沉淀细胞用适量维持液悬浮接种DF-1单层继续传代，或加适量冻存液分装无菌细胞冻存管，在-70℃冰箱中预冻4小时后，保存于液氮中，注明收获日期、毒种代次和PFU含量。

    制苗用细胞的传代与培养：DF-1细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于36.5-37.5℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒。

    制苗毒的繁殖：将制备的毒种，以维持液稀释，接种前将制备用的细胞的生长液弃尽，每1000ml维持液含500万PFU种毒细胞；接毒后在同样条件下继续培养，待70%细胞出现典型病变时，即可收获。

收获：将维持液弃去，加入适量消化液与细胞面接触，当细胞单层出现疏松拉网，接近脱离瓶壁时，立即加入停消液终止消化，同时轻轻摇动，直至细胞全部脱落，将细胞悬液收集于无菌离心杯中，经离心收获沉淀细胞，用培养液重新悬浮细胞。

配苗：将上述半成品置冰浴上,缓慢加入冷冻保存液。

分装、封口：将已加入冷冻保存液的病毒细胞悬液立即分装于已贴好瓶签的2ml安瓶中，熔封。

保存：将分装的疫苗安瓶立即置液氮程序降温系统，达-70℃后，移入液氮中保存，1周后抽样作成品检验。

成品检验：按《中华人民共和国兽药典（三部）》（2010版）中“鸡马立克氏病活疫苗（CVI988/Respens株）”的质量标准进行检验，应符合要求。在其中“蚀斑计数”检验中，可采用鸡胚成纤维细胞检验或本发明所述的传代细胞检验。

上述所用细胞生长液配方为：含10%胎牛血清（体积比）的DMEM/F12培养基，含100单位/ml双抗，pH调整为7.2。

上述所用维持液配方为：含5胎牛血清（体积比）的DMEM/F12培养基，含200单位/ml双抗，pH调整为7.4。

上述所用冷冻保存液配方为：含体积比15%新生牛血清、体积比10%二甲基亚砜的199溶液，含150单位/ml双抗（青、链霉素）。

实施例2

毒种繁殖：将鸡马立克氏病III型火鸡疱疹病毒 Fc-126基础种子用种毒稀释液（5%新生牛血清的2倍199和2倍水解乳蛋白溶液的等量混合液，含100单位/ml双抗，pH调整为7.2）稀释为40万PFU/ml，按0.5ml/100ml方瓶接种于生长良好的DF-1细胞上，36.5-37.5℃吸附1小时，再加入适量维持液，继续培养，当70%及以上单层细胞出现典型马立克氏病细胞病变时，以EDTA-胰酶细胞分散液消化并分散细胞，收获的细胞悬液用作制苗用毒种；

制苗用细胞的传代与培养：DF-1细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于36.5-37.5℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒。

制苗毒液的制备：将制备的毒种，用维持液稀释，接种于已形成良好单层的细胞系单层上，36.5-37.5℃吸附1小时，再补充维持液与二次细胞悬液，使最终每1000ml维持液含500-1500万PFU种毒细胞，于36.5-37.5℃继续培养，当70%及以上单层细胞出现典型马立克氏病细胞病变时，收获感染细胞；

收获：弃去维持液，加入适量EDTA-胰酶收获消化液，使消化液与细胞表面均匀接触；当细胞层出现疏松拉网脱壁时加入停消液，将细胞收集于无菌容器中，经分散、离心，弃去上清液，加入适量的SPGA用超声波裂解器进行裂解，即为原苗。

配苗、分装与冻干：将原苗收集混合后，加入适量SPGA混匀，定量分装进行冷冻真空干燥。

成品检验：按《中华人民共和国兽药典（三部）》（2010版）中“鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗（Fc-126株）”的质量标准进行检验，应符合要求。在其中“蚀斑计数”检验中，可采用鸡胚成纤维细胞检验或本发明所述的传代细胞检验。

上述所用细胞生长液配方为：5%新生牛血清的2倍199溶液和2倍水解乳蛋白溶液的等量混合液，含100单位/ml双抗，pH调整为7.2。

上述所用维持液配方为：含5胎牛血清（体积比）的DMEM/F12培养基，含200单位/ml双抗（青、链霉素），pH调整为7.4。

其中，鸡马立克氏病活疫苗（CVI988/Rispens株）的原始毒种为鸡马立克氏病病毒I型CVI988/Rispens株，毒种保藏编号为HVRIMDV0003（中华人民共和国兽药典，2010年版，三部，鸡马立克氏病活疫苗（CVI988/Rispens株），P52），中国兽医微生物菌种保藏管理中心、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室均保存，可通过购买方式获得。     鸡马立克氏病活疫苗（814株）的原始毒种为马立克氏病病毒I型814株，毒种保藏编号为CVCC AV26（中华人民共和国兽药典，2010年版，三部，鸡马立克氏病活疫苗（814株），P52），中国兽医微生物菌种保藏管理中心保存，可通过购买方式获得。     鸡马立克氏病活疫苗（SB-1株）的原始毒种为马立克氏病病毒II型SB-1株，毒种保藏编号为HVRIMDV0007，中国兽医微生物菌种保藏管理中心保存，可通过购买方式获得。     鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗（FC-126株）的原始毒种为马立克氏病病毒III型火鸡疱疹病毒FC-126株，毒种保藏编号为CVCC AV19（（中华人民共和国兽药典，2010年版，三部，鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗（FC-126株），P53），中国兽医微生物菌种保藏管理中心保存，可通过购买方式获得。

鸡胚胎DF-1细胞采购自上海科敏生物科技有限公司的UMNSAH/DF-1鸡胚成纤维细胞，货号XB0043。

本发明实施例1制备得到的CV1988/Rispens活疫苗与现有的同类制品的比较试验

材料

疫苗：用DF-1细胞制备的鸡马立克氏病活疫苗（CVI988/Respens株）产品，批号为DF001、DF002、DF003；对照疫苗为市售鸡胚成纤维细胞（CEF）制备的鸡马立克氏病活疫苗（CVI988/Respens株）。

性状检验

肉眼观察疫苗物理性状。3批本发明制备得到的CV1988/Rispens活疫苗与市售疫苗均为淡粉色混悬液。

无菌检验

按《中华人民共和国兽药典（三部）》（2010版）附录42页进行检验，疫苗均无菌生长。

支原体检验按

中华人民共和国兽药典（三部）》（2010版）附录49页进行检验，每批疫苗与对照疫苗均无支原体生长。

鸡贫血病毒（CAV）检验

每批疫苗与对照疫苗各取1日龄SPF鸡10只，每只颈背部皮下注射疫苗0.2ml（含10羽份），隔离饲养28日，采血，按间接ELISA进行CAV抗体检测，均为阴性。

其他外源病毒检验

按《中华人民共和国兽药典（三部）》（2010版）附录40页进行检验，每批疫苗与对照疫苗均无外源病毒污染。

安全检验

每批疫苗与对照疫苗各取1日龄SPF鸡各25只，每只颈背部皮下注射疫苗0.2ml（含10羽份），观察21日，结果见表1。

表1 安全检验比较结果

蚀斑计数

每批疫苗抽样3瓶，经37℃温水融化后，用专用配套稀释液（适宜温度为23-27℃）稀释。取适当稀释度，每个稀释度接种5个已长成良好单层鸡胚成纤维细胞的平皿，每个平皿接种0.2ml。37℃吸附1小时后，每皿加入维持液6.0ml。同时设空白对照2个平皿和标准病毒样品对照5个平皿。置37-38℃、5%CO2培养箱培养6日，不得移动，第7日进行蚀斑计数。先计算同一稀释度5个平皿的平均蚀斑数，再计算出每瓶疫苗所含蚀斑数。结果标准病毒样品5个平皿间的PFU误差不超过±10%。以3瓶中最低PFU数核定每批疫苗的PFU，结果见表2。

表2 蚀斑计数比较结果

参照《中华人民共和国兽药典（三部）》（2010版）中“鸡马立克氏病活疫苗（CVI988/Respens株）”的质量标准进行检验，结果显示：用DF-1细胞生产的3批鸡马立克氏病活疫苗（CVI988/Respens株）全部合格。从蚀斑计数看，该疫苗的蚀斑数明显高于用CEF细胞生产的普通市售疫苗。

本发明制备得到的CV1988/Rispens活疫苗与现有市售同类制品的免疫效力比较试验

材料和方法

用DF-1细胞制备的鸡马立克氏病活疫苗（CVI988/Respens株）产品，批号为DF001；对照疫苗为市售鸡胚成纤维细胞（CEF）制备的鸡马立克氏病活疫苗（CVI988/Respens株）。

攻击强毒 超强毒Md5、超强毒RB1B。

试验鸡：1日龄SPF鸡、伊莎蛋鸡（父母代）、AA肉鸡（父母代）、狼山鸡、乌骨鸡。

试验分组：根据试验要求，首先从出壳的1日龄雏鸡中剔除弱雏，然后进行随机分组，免疫后各处理组隔离饲养。

试验鸡观察：从1日龄免疫到7日龄攻毒期间死亡的鸡以及攻毒后1周内死亡的鸡为非特异性死亡，从每个处理组试验鸡总数中扣除，攻毒1周以后死亡的鸡，逐个剖检，记录大体肿瘤变化及法氏囊、胸腺和脾脏等免疫器官的变化，可疑时采病料做组织学检查，70日龄时将存活的鸡全部扑杀，剖检，记录大体肿瘤变化及法氏囊、胸腺和脾脏等免疫器官变化，可疑时采病料做组织学检查。

MD+鸡=大体MD肿瘤鸡+大体MD肿瘤可疑而组织学证实为MD的鸡+超强毒攻击1周后至3周内死亡虽无明显肿瘤但胸腺、法氏囊和脾脏高度萎缩的鸡

保护指数的计算及统计分析

保护指数PI=（攻毒对照组MD+%-免疫组MD+%）×100%/（攻毒对照组MD+%）

PI的差异显著性检验用卡方分析。

结果

用DF-1细胞制备的鸡马立克氏病活疫苗（CVI988/Respens株）在SPF鸡和4种不同品种商品鸡的免疫效力试验及与市售鸡胚成纤维细胞（CEF）制备的鸡马立克氏病活疫苗（CVI988/Respens株）的比较见表3~4。

表3   疫苗在SPF鸡的免疫效力试验

MD*/T= MD阳性鸡累计数/试验攻毒鸡数

表4 疫苗在非SPF鸡的免疫效力试验*

*试验鸡具有高母源抗体，1日龄血清AGP价在1:4以上

试验结果表明，用DF-1细胞制备的鸡马立克氏病活疫苗（CVI988/Respens株）免疫1日龄鸡后均能保持良好的免疫原性，其免疫效力优于目前市售的用鸡胚成纤维细胞（CEF）制备的鸡马立克氏病活疫苗（CVI988/Respens株）。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

Claims (8)

1.一种用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于步骤如下：

A、选择细胞系作为制苗用细胞；细胞系为鸡胚胎DF-1细胞系；

B、制苗用细胞的传代与培养

上述细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成单层时，用于继续传代或接种病毒；培养温度为36.5～37.5℃；

C、细胞毒种的繁殖

用种毒稀释液，将鸡马立克氏病活疫苗毒种稀释成一定浓度，接种生长良好的制苗用细胞系或鸡胚成纤维细胞单层上，36.5-37.5℃吸附1小时，再加入维持液或二次细胞悬液，继续培养，当70%及以上单层细胞出现典型马立克氏病细胞病变时，以EDTA-胰酶细胞分散液消化并分散细胞，收获的细胞悬液用作制苗用毒种；

D、制苗毒液的繁殖

将鸡马立克氏病活疫苗制苗用毒种用维持液稀释，接种于已形成单层的细胞系单层上继续培养，当70%及以上单层细胞出现典型马立克氏病细胞病变时，收获感染细胞；

E、配苗、分装、冻干或置液氮中冻存

将收获的感染细胞，加冻干保护剂和抗生素，定量分装后经冷冻真空干燥为成品；或加冻存保护液和抗生素，混匀后定量分装为成品，置液氮中冻存。

2.根据权利要求1所述的用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于：鸡马立克氏病活疫苗为鸡马立克氏病血清I型CVI988/Rispens株疫苗，或814株疫苗，或血清II型SB-1株疫苗，或血清III型火鸡疱疹病毒 Fc-126株疫苗，或I+II型，或I+III型，或II+III型，或I+II+III型二价或三价疫苗。

3.根据权利要求1所述的用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于：步骤C中，培养温度为36.5～37.5℃。

4.根据权利要求1所述的用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于：步骤D中，培养温度为36.5～37.5℃。

5.根据权利要求1所述的用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于：步骤B中，细胞生长液的配方为：在体积比为5～10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，加入终浓度100～400单位/ml的抗生素，pH调整为7.0～7.2。

6.根据权利要求1所述的用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于：种毒稀释液或维持液的配方为：在体积比为1～5%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，或在含有体积比为1～5%新生牛血清的2倍199溶液和2倍水解乳蛋白溶液等量混合液中，加入终浓度100～400单位/ml的抗生素，pH调整为7.0～7.4。

7.根据权利要求1所述的用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于：步骤D中，鸡马立克氏病活疫苗毒种接毒量为500万～1500万PFU/1000ml维持液。

8.根据权利要求1所述的用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于：步骤E中，冻存保护液的配方为：体积百分比为15%的新生牛血清、体积百分比为10%的二甲基亚砜的199溶液；冻干保护剂为SPGA；加入抗生素的终浓度为100～400单位/ml。