CN1170760A - 用于马立克氏病毒疫苗生产的可传代细胞系的改进 - Google Patents

用于马立克氏病毒疫苗生产的可传代细胞系的改进 Download PDF

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Abstract

描述了含有以溶源性或非溶源性感染存在于细胞系内的马立克氏病毒(MDV)的细胞系以及生产方法。也描述了由细胞系制备鸟类MDV的方法以及抗鸟类MDV的疫苗。

Description

用于马立克氏病毒疫苗生产的可传代细胞系的改进
该申请是发明人Amin Abujoub和Paul M.Coussens于1995年10月27日申请的题目为“Sustainable Cell Line Infected With Marek’sDisease Virus”的美国申请No.08/549,045的继续。
本发明涉及感染马立克氏病毒(MDV)的可传代鸡细胞系。具体地说，本发明涉及感染火鸡疱疹病毒(HVT)和血清型-2MDV疫苗菌株(可以用作活病毒疫苗以保护家禽抵抗马立克氏病)的细胞系，其中根据生长条件，MDV以溶源性或非溶源性感染保留在这些培养中。
马立克氏病(MD)是地球上任何动物(包括人)最常见的临床肿瘤疾病(H.G.Purchase，in“Marek’s Diseases：Scientific Basis and Methods ofControl：Clinical disease and its economic impact.”(L.N.Payne，Ed.)，Martinus Nijoff Publishing，Boston，MA，第17-42页(1985))。MDV是一种具有高度接触感染性的淋巴组织增生疱疹病毒。有三种MDV血清型：致癌血清型-1(MDV-1)、非致癌血清型-2(MDV-2)和非致癌血清型-3即火鸡疱疹病毒(HVT)(B.W.Calnek and R.L.Witter，in“Diseasesof Poultry：Marek’s Disease”(B.W.Calnek et al.，Eds.)，Iowa StateUniversity Press，Ames，IA第342-385页，(1991))。
MDV和HVT的复制是其它细胞相关的疱疹病毒复制的典型，并已广泛报道(L.J.N.Ross，in“Marek’s Diseases：Scientific Basis andMethods of Control：Molecular Biology of the Virus.”(L.N.Pyane，Ed.)，Marinus Nijoff Publishing，Boston，MA，第113-150页，(1985))。已认识的三种一般类型的细胞-病毒相互作用是：复制感染、潜伏和转化。MDV-1感染鸟类导致转化发生的过程包括：1)在B细胞中非溶源性感染，2)涉及感染的T细胞的潜伏期，3)第二轮非溶源性感染，同时发生永久性免疫抑制，4)致癌转化(B.W.Calnek and R.L.Witter，in“Diseases of Poultry：Marek’s Disease”(B.W.Calnek et al.，Eds.)，IowaState University Press，Ames，IA第342-385页，(1991))。在感染MDV-2和HVT的鸟类事件中的顺序似乎限制在原代溶裂期，随后在非T细胞的潜伏或没有致癌转化的的潜伏(B.W.Calnek and R.L.Witter，in“Diseases of Poultry：Marek’s Disease”(B.W.Calnek et al.，Eds.)，IowaState University Press，Ames，IA第342-385页，(1991))。
一直以来，家禽工业认为有必要研制出可传代鸟类细胞系由于制造马立氏克病疫苗及简化获得生产多价疫苗的重组DNA载体的步骤。尽管已研制出许多鸟类细胞系(K.Nazerian，Avian Pathol.16：517-544(1987))，但直至本发明，在疫苗生产中还没有鸟类细胞系能够取代鸡胚成纤维(CEF)细胞。先前的细胞系之所以不成功，是因为它们或者是由病毒转化的细胞衍生的，或者由化学转化的细胞衍生，而当用化学转化细胞接种鸡时，使鸡体产生肿瘤或者细胞系可恢复的病毒最大效价不足以用于工业生产。因此，家禽疫苗生产商继续将原代CEF细胞用于生产马立克氏病疫苗和其它活疫苗和灭活疫苗，这时一种昂贵和费力的方法，取决于制备CEF的无特殊病原体(SPF)蛋的连续来源。
马立克氏病疫苗是家禽工业中最广泛使用的疫苗。在二十世纪70年代后期，由于马立克氏病疫苗的研制，由马立克氏病引起的损失已显著减少(B.W.Calnek and R.L. Witter，in“Diseases of Poultry：Marek’sDisease”(B.W.Calnek et al.，Eds.)，Iowa State University Press，Ames，IA第342-385页，(1991))。最广泛使用的马立克氏病疫苗是活HVT或活HVT和病原血清型-2MDV的二价混合物。活HVT和血清型-2MDV的二价混合物能在HVT不完全有效的情况下协同作用，更有效的抵抗马立克氏病(R.L.Witter，Avian Pathol.11：49-62(1982)；R.L.Witter和L.F.Lee，Avian Pathol.13：75-92(1984)；R.L.Witter，“Marek’s Diseases：Scientific Basis and Methods of Control：Principles of Vaccination.”(L.N.Pyane，Ed.)，Martinus Nijoff Publishing，Boston，MA，第203-250页，(1985))。
尽管马立克氏病疫苗的生产需要每星期制备CEF细胞，但它们已被广泛地使用(M.Pattison，“Marek’s Diseases：Scientific Basis andMethods of Control：Control of Marek’s disease by the poultry industry：practical considerations.”(L.N.Pyane，Ed.)，Martinus Nijoff Publishing，Boston，MA，第341-350页，(1985))。因此，疫苗生产非常依赖于无特殊病原体(SPF)畜群生育的蛋的连续可靠的供应。SPF畜群在特殊条件下饲养，并定期检验证明没有鸟类病原体(D.H.Thomton，“Marek’sDiseases：Scientific Basis and Methods of Control：quality control andstandardization of vaccines.”(L.N.Pyane，Ed.)，Martinus Nijoff Publishing，Boston，MA，第267-292页，(1985))。能生育SPF蛋供应的任何中断都会中断MDV疫苗的生产。MDV疫苗生产的可传代细胞系对世界范围的家禽工业具有很大的经济利益。
当前马立克氏病疫苗或者是感染的CEF悬浮液或者是由感染马立克氏病毒疫苗菌株的CEF经超声处理的无细胞悬浮液。由于没有适用于繁殖MDV的可传代细胞系，因此MDV疫苗工业将原代CEF用于病毒疫苗的生产(A.E.Churchill，“Marek’s Diseases：Scientific Basisand Methods of Control：Production of vaccines.”(L.N.Pyane，Ed.)，Martinus Nijoff Publishing，Boston，MA，第251-266页，(1985))。原代CEF的寿命有限(大约2-3星期)，必须每1或2星期制备CEF，增加了生产MDV疫苗的成本。
CEF细胞培养的传代数限制了MDV。所有这三种MDV血清型在CEF中的连续培养导致血清型-1MDV的减弱，而对于血清型-2和3，则失去对抵抗对MDV的效力。培养中血清型-1MDV的减毒已广泛进行了研究，与病毒基因组het区的扩张有关。该扩张可以容易地用Southern分析或用PCR进行监视。高度传代的血清型-2和血清型-3抗MDV效力损失的原因还不知道。
H.Ogura和T.Fuijwawa(Acta Med. Okayama 41：141-143(1987))通过化学转化鸡胚细胞建立了一个细胞系(CHCC-OU2)。该细胞系外表是成纤维细胞，具接触抑制性，并且在琼脂中不形成克隆。作者表示，CHCC-OU2细胞系不恶性转化，不产生内源鸟类逆转录病毒，但能够支持新城病病毒和几个亚组鸟类逆转录病毒的复制。然而，作者没有将他们的研究延伸到其它鸟类病毒(诸如马立克氏病毒和传染性粘液囊病病毒之类)的复制。
因此，本发明的目的是提供生产MDV疫苗的可传代细胞系。另外，本发明的目的是提供生产可传代的MDV疫苗细胞系的方法。此外，本发明的目的是提供生产经济的MDV疫苗细胞系的方法以及使用有效的疫苗细胞系的方法。本发明的另一目的是提供用MDV感染鸟类以提供对马立克氏病免疫的方法。参考以下说明和附图，这些和其它目的会变得越来越明显。
图1A-1D是FC126-OCL和SB1-PCL的显微照片。FC126-OCL的单层培养显示，空斑由几个感染的大细胞和许多感染的较小细胞的混合物组成(图1A)，而在CEF上的FC126空斑由同样大小的感染细胞组成(图1B)。SB1-OCL的单层培养显示，空斑由大的感染细胞组成(图1C)，而在CEF上的SB1空斑由小的感染细胞组成(图1D)。
图2是132bp DR顺序的PCR扩增。从第14代(列1)、第48代(列2)和MDV-OU2.2第48代(列3)分离的DNA用于PCR扩增。右边标数字的箭头显示具有1-5个拷贝132bp DR顺序的DR片断的位置。左边的箭头表示从1kb DNA梯式标记(GIBCO BRL，Life Technologies，Gaithersburg，MD)的选定带的位置。
图3是显示CHCC-OU2 DNA ev1的PCR扩增分析的琼脂糖凝胶照片。来自CHCC-OU2、ev1杂合的鸟类细胞或缺乏ev1的鸟类细胞的DNA用于PCR扩增。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，用溴化乙锭染色，PCR产物在紫外光下进行目测检验。列1为CHCC-OU2 DNA的PCR产物，列2为来自含有ev1的DNA模板的PCR产物，列3为来自含有ev1和ev6的DNA模板的PCR产物，列4为来自含有ev15但不含ev1的DNA模板的PCR产物。列5为含有设定的ev1引物但没有DNA模板的对照。位于侧边的1kb梯式标记(GIBCOBRL，Life Technologies，Gaithersburg，MD)用于PCR产物大小的测量。
图4是显示CHCC-OU2 DNA ev15的PCR扩增分析的琼脂糖凝胶照片。来自CHCC-OU、ev15杂合的鸟类细胞或缺乏ev15的鸟类细胞的DNA用于进行PCR扩增。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，用溴化乙锭染色，PCR产物在紫外光下进行目测检验。列1为CHCC-OU2 DNA的PCR产物，列2为来自含有ev15的DNA模板的PCR产物，列3为来自含有ev1但不含ev15的DNA模板的PCR产物，列4为含有设定的ev15引物但没有DNA模板的对照。位于侧边的1kb梯式标记(GIBCO BRL，Life Technologies，Gaithersburg，MD)用于PCR产物大小的测量。
本发明涉及由鸡胚细胞(CEC)(为鸡辅助因子(CHf)阴性、不含病毒，用化学诱变剂处理，然后感染MDV)衍生的单层培养中可传代的感染马立克氏病毒的鸡细胞系，该细胞系能够体内感染鸟类，其中MDV可以以溶源性或非溶源性感染保留在细胞系内。
而且，本发明涉及在非融合单层培养中生产感染潜伏的马立克氏病毒的可传代鸡细胞系的方法，包括将鸡胚细胞(为鸡辅助因子(CHf)阴性、不含病毒并用化学诱变剂处理过)与MDV在培养基中混合，使得CEC感染MDV；从未感染的CEC中纯化感染MDV的CEC；繁殖感染MDV的CEC使成单层培养细胞系，其中MDV可以以溶源性或非溶源性感染保留在细胞系内。
本发明涉及用马立克氏病毒感染鸟类的方法，包括：提供由鸡胚细胞(为鸡辅助因子(CHf)阴性、不含病毒，用化学诱变剂处理，然后感染MDV)衍生的、作为单层培养保持的、感染马立克氏病毒的可传代鸡细胞系，其中MDV可以以溶源性或非溶源性感染保留在细胞系内，该细胞系能够体内感染鸟类；用疫苗接种鸟类。
本发明涉及剂量形式的鸟类疫苗，来自含有感染马立克氏病毒的、由鸡胚细胞(为鸡辅助因子(CHf)阴性、不含病毒，用化学诱变剂处理，然后感染MDV)衍生的、一直作为单层培养保持的可传代成纤维细胞系，其中MDV可以以溶源性或非溶源性感染保留在细胞系内。
MDV用来描述三种MDV血清型中的任何一种，即血清型1、血清型2或血清型3(也已知为HVT)，而MDV-OCL可以指含有任何一种或多种MDV混合的任何细胞系。MDV或MDV-OCL是本发明的工作对象，并在这里使用，作为实例提供的具体实施方案(含有具体MDV菌株的细胞系)除外。感染具体MDV菌株的细胞系如下识别：MDV-OU2或MDV-OU2.2或MDV-OU2.1是指含有血清型1MDV菌株MD11的任何细胞系。SB1-OCL特指含有血清型2MDV菌株SB1的任何细胞系。FC126-OCL特指含有血清型3MDV菌株FC126的任何细胞系。
题目为“Sustainable Cell Line Infected with Marek’s Disease Virus”的美国申请No.08/549,045(于1995年10月27日申请)中描述的试验证明，CHCC-OU2细胞系可以感染血清型-1MDV。MDV稳定地保留在细胞系和继续生长的感染细胞中，然而不能预期感染的方式。与CEF或其它鸟类细胞的MDV感染不同，直到单层融合并且细胞系变为接触抑制后，在感染的CHCC-OU2单层上的空斑生成才可以见到，才产生传染性病毒。接触抑制时，由MDV感染引起的细胞病作用(CPE)变得明显，并产生传染性病毒。在接触抑制前，MDV以潜伏或半潜伏状态保留在CHCC-OU2中。另一方面，感染MDV的CEF或其它鸟类细胞无论细胞单层是融合还是半融合都发展出空斑，并产生传染性病毒。因此，当培养皿中倒平板的CHCC-OU2细胞感染的密度与一般用于CEF的密度相同时，CHCC-OU2细胞在两个星期或更长时间内仍不能发展出空斑和产生传染性病毒，而感染的CEF在感染后的2-3天发展出空斑。这时因为与具有24小时的双倍时间相比，CHCC-OU2细胞系具有3-5天的双倍时间。
从亚融合感染MDV的CHCC-OU2细胞系(MDV-OU2细胞系)分离的蛋白质的Western印迹法检测到在潜伏期表达的MDV蛋白pp38和pp14的表达，而检测不到后期蛋白(诸如gB、gC、gE和gI)以及在复制感染期表达的所有蛋白(于1995年10月27日申请的题目为“Sustainable Cell Line Infected With Marek’s Disease Virus”的美国申请No.08/549,045)。亚融合MDV-OU2细胞系的免疫荧光分析也只能检测到pp38和pp14。诸如gB之类的后期蛋白只能在融合细胞系的免疫荧光分析中检测到。这些结果显示，MDV以潜伏感染存在于亚融合的MDV-OU2细胞系中。
MDV-OU2细胞系将MDV的感染转移至原代CEF，并在接种MDV-OU2细胞系的易感鸡中诱导马立克氏病的临床症状(于1995年10月27日申请的美国申请No.08/549,045)。在接种后的不同时间从感染的鸟收集的外周血淋巴细胞在CEf单层上培养时产生MDV空斑。从感染的鸟肾分离的DNA通过PCR也证明了MDV的感染。最后，组织学评价揭示出淋巴细胞浸润以及从接种鸟分离的不同组织中的早期活性淋巴瘤。这些结果清楚地证明了MDV-OU2细胞系可以将MDV转移至原代细胞和鸡中。
本发明表明：1)MDV细胞系含有类潜伏状态的MDV，2)让细胞生长至融合，使传染性MDV得到恢复，3)MDV细胞系可以无限维持，4)MDV稳定地保留在MDV细胞系中。
我们料想不到MDV以潜伏或类潜伏状态保留在亚融合CHCC-OU2细胞系中，并且MDV诱导的CPE直到细胞达到融合水平后才变得明显。保留类潜伏状态MDV的CHCC-OU2细胞系能够分裂，并将MDV转移给子细胞。只要感染MDV的CHCC-OU2细胞系在培养中在亚融合水平传代，那么纯的MDV-OCL细胞系就可以建立。CPE和传染性病毒通过使MDV-OCL细胞系达到融合而产生。然而，亚融合的MDV-OCL细胞系仍可以将病毒转移至CEF，并在疫苗中时诱导免疫。
感染血清型3MDV(HVT菌株FC126-OCL)的CHCC-OU2细胞系于1996年2月22日按照布达佩斯条约以ATCC 12052进行了保藏，需要时通过菌名和数字可以得到。同样地，感染血清型2MDV(菌株SB1-OCL)的CHCC-OU2细胞系于1996年2月22日按照布达佩斯条约以ATCC 12053进行了保藏，需要时通过菌名和数字可以得到。血清型1于1995年9月28日按照布达佩斯条约以ATCC CRL 11985(MDV OU2.2)进行了保藏。这些细胞的保藏权力仅授予了保藏中心。
CHCC-OU2细胞系、SB1-OCL细胞系、MDV-O细胞系CL和
            FC126-OCL细胞系的辨别特征
CHCC-OU2细胞系能够在细胞培养中连续生长，是用甲基硝基亚硝基胍(MNNNG)处理转化的鸡胚细胞衍生的。CHCC-OU2细胞为成纤维细胞外观，并表现锚基依赖性生长。
经过本发明的CHCC-OU2细胞系可以通过以下标准区别于其它鸟类细胞系。本发明的CHCC-OU2细胞系具有依赖于原始细胞密度的3-5天的双倍时间。在培养中以低细胞密度(不多于3.3×104细胞/cm2)倒平板的细胞以原始速率(低于以3.3×104-5.6×104细胞/cm2的细胞密度倒平板的细胞)复制。而且，CHCC-OU2细胞的复制是接触抑制的，并且CHCC-OU2细胞在软琼脂中不形成克隆。该特征是本发明CHCC-OU2细胞独特的，而其它鸟类细胞不显示接触抑制的表型，并且许多由MNNNG处理衍生的细胞系在软琼脂中形成克隆。一旦CHCC-OU2单层达到1.7×105细胞/cm2的平均细胞密度时，细胞进入G0期，并停止复制。不象其它鸟类细胞，CHCC-OU2细胞不是恶性的，给鸟注射时不形成肿瘤。
本发明CHCC-OU2细胞系还包括以下其它区别特征。
1)CHCC-OU2细胞系表达第1类主要组织相容性复合物(第1类NHC)分子。CHCC-OU2细胞系表现第I类MHC B13单倍型，并对抗第I类MHC B5单倍型的抗血清具有交叉反应性。鸡胚成纤维细胞表达很少可检测的第I类MHC分子。其它鸟类细胞或可移植的肿瘤似乎都不具有第I类MHC B13/B5基因型(Nazerian Avian Path.16：527-544(1987))。
2)通过BamHI、HindIII或SacI降解的CHCC-OU2 DNA与鸟类逆转录病毒探针RAV-2杂交的Southern转移，证明CHCC-OU2细胞系含有来自内源鸟类逆转录病毒ev1、ev6、ev15的顺序。存在20个以上的内源鸟类逆转录病毒亚型。由于这些亚型是通过孟德尔遗传学遗传的，因此在细胞系内或鸟中ev的具体组合可以作为细胞系或鸟的标记。CHCC-OU2细胞系的内源逆转录病毒表型是组特异性抗原阴性(ga-)和鸡辅助因子阴性(chf-)。当CHCC-OU2细胞含有整合到基因组的ev顺序时，细胞不能产生传染性逆转录病毒，证据是缺乏逆转录酶活性，用电子显微镜检查缺乏病毒颗粒。
鸟可以是任何具体ev亚型纯合的、杂合的或是完全不含ev亚型。已研制出PCR扩增分析来测定鸟是ev1或ev15纯合的还是杂合的。CHCC-OU2细胞DNA的PCR扩增揭示出细胞对ev1(图3)和ev15(图4)都是纯合的。还没有得到ev6的PCR分析。
3)CHCC-OU2细胞易于感染某些鸟类逆转录病毒亚型。不同的鸟类细胞系对不同亚型的鸟类逆转录病毒敏感。亚型A(菌株SRA)在CHCC-OU2细胞中可很好地复制，而亚型B(菌株SRB)和D(菌株SRD)几乎检测不到复制，而亚型C(菌株BH-RSV(RAV-7))和E(菌株QV2f)在CHCC-OU2细胞内不能复制。
MDV-OCL细胞系、FC126-OCL细胞系和SB1-OCL细胞系表现与原代CHCC-OU2细胞系相同的的生长特征。当这些细胞保留MDV病毒时，他们不转化，给鸟注射时也不诱导肿瘤。这些细胞系亚融合时，所有形态学特征与原代CHCC-OU2细胞系相同。当单层细胞的每个细胞与其相邻细胞接触时，即细胞密度大约4×104-6×104细胞/cm2时，传染性病毒开始在FC126-OCL细胞系中产生。CPE的发展和传染性病毒的产生非常快，在细胞接触的两天内完成。另一方面，SB1-OCL细胞系和MDV-OU2细胞系直到单层细胞的细胞密度达到大约6×104-1×105细胞/cm2时，才产生PCE和传染性病毒。细胞系培养到一定的细胞密度并且发生50％融合时，FC126病毒和SB1病毒的表达才能检测到。
感染MDV的细胞系可以用来生产疫苗。感染MDV的细胞系也可以用来试验抑制或增强细胞反应(诸如刺激第1类主要组织相容性复合物分子的产生，并藉此刺激细胞介导的对MDV的反应)的不同试剂和条件。
推荐的MDV病毒选自血清型1、2和3。血清型3称为火鸡疱疹病毒(HVT)。MDV可以是含有外源基因或缺失突变体、用作疫苗或其它用途的重组病毒。MDV也可以是包含复制原点和外源DNA顺序的缺陷病毒。
本发明特别涉及稳定感染HVT菌株FC126的可传代鸡细胞系(FC126-OCL)和稳定感染血清型2MDV菌株BS1的可传代鸡细胞系(SB1-OCL)。FC126-OCL细胞系和SB1-OCL细胞系在培养中连续生长，一旦融合，显示MDV感染的空斑特征。FC126-OCL和SB1-OCL可以分别或一起用作疫苗，以提供鸟类对MDV病原菌株的免疫。FC126-OCL和SB1-OCL细胞保持着生命力，在低温储藏和连续培养后继续产生MDV。
如实施例所示，细胞系感染MDV。在融合单层中清楚的空斑的存在与溶细胞的限制性复制感染一致，与在原代CEF中观察的相似。当在每个细胞培养世代后融合增加时，由细胞系产生的传染性病毒的效价如由保留MDV的细胞系的复制所预期的。细胞系能够将MDV感染转移至原代CEF、未感染的CHCC-OU2细胞和鸟类。最后，细胞系能够使鸟类抵抗MDV病原菌株(诸如血清型1MDV菌株GA第8代和Md11p15)。
从感染可传代MDV疫苗细胞系的培养物或MDV感染的CEF的CHCC-OU2多次大容量培养中建立可传代MDV疫苗细胞系的原代细胞株。当病毒空斑变得清楚时，通过胰蛋白酶作用或从培养容器刮下来收集这些培养物，并将感染MDV的细胞接种到新培养器中。重复这些传代培养，直至培养物中大多数CHCC-OU2细胞是被MDV疫苗感染的，这样，制造出可以用作MDV疫苗生产的原代细胞株(masterseed stock)。这些原代细胞株通过美国农业部对MDV疫苗的使用进行了验证。当感染MDV疫苗的CEF用作原材料时，必须增加传代数，使得细胞培养了3星期以确保所有的CEF(寿命大约为2星期)已死亡。
制造可传代MDV疫苗原代细胞株的另一方法是，用包含疫苗病毒基因组的DNA转染CHCC-OU2细胞。转染的方法包括J.Sambrook，等人在“molecular cloning：alaboratory manual”，2nd Ed.，Cold SpimgHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)第16.30-16.55页中描述的用来用DNA转染细胞的任何技术，诸如磷酸钙沉淀、聚凝胺、DEAE-葡聚糖、LIPOFECTIN、电击或原生质体融合等。DNA转染在基因工程的病毒载体或缺陷病毒载体的原代细胞株的制备中特别有用。
制造可传代MDV疫苗的原代细胞株还有一个方法是通过感染的细胞群体的细胞培养扩张。培养CHCC-OU2细胞的用本文描述的方法以低剂量重复感染来感染MDV。当空斑变得清楚时，从感染的CHCC-OU2培养物上取出1个空斑，并转移至不含任何细胞的组织培养皿中。培养细胞直至细胞接近融合，通过胰蛋白酶作用收集培养物，通过低速离心浓缩感染MDV的细胞，并接种到较大的组织培养皿中。再培养细胞直至细胞接近融合。通过这种方式，大多数细胞被感染，而且所有感染的细胞都来自一个MDV空斑。通过使感染MDV的细胞系的细胞达到融合，在细胞扩大规模培养的任何阶段内均可完成传染性MDV的生产。
使用MDV-OCL细胞系来生产MDV疫苗的方法如下。以亚融合密度培养MDV-OCL细胞系的原代细胞株。MDV以潜伏状态保留在分裂的细胞中，直至培养细胞达到融合水平，此时病毒感染进入复制期。当感染发展为可见时，通常是融合后2天，用MDV疫苗生产领域技术人员常用的技术收集这些细胞(A.E.Churchill，“Marek’sDiseases：Scientific Basis and Methods of Control：Production ofVaccines.”(L.N.Pyane，Ed.)，Martinus Nijoff Publishing，Boston，MA，第251-266页，(1985))。用于MDV疫苗的感染细胞的制备一般涉及以下步骤，1)细胞用胰蛋白酶处理，或从培养载体上刮下，2)复制感染的细胞通过低速离心浓缩，3)将已浓缩的感染细胞再悬浮于适当体积的稀释液中，以生产疫苗，浓度定义为每毫升MDV空斑生成单位(PFU/ml)。连续MDV疫苗生产最好通过安排MDV-OCL细胞系由原代细胞株进行系列多次培养来获得，在系列培养中每一连续培养为低于先前培养的亚融合水平。例如，将培养物建立在90％、80％、70％、60％和50％的亚融合水平。当90％的培养物达到融合时，MDV感染在复制期，然后收集培养物用于MDV疫苗，由原代细胞株建立新的50％融合的培养细胞。这样，可以得到MDV疫苗的连续生产。
另一方法，也是生产MDV疫苗的有效方法是保持未感染CHCC-OCL细胞的培养物。这些培养物被MDV-OCL细胞系的原代细胞株。该方法类似于当前用来由CEF生产疫苗的方法(A.E.Churchill，“Marek’s Diseases：Scientific Basis and Methods of Control：Production ofVaccines.”(L.N.Pyane，Ed.)，Martinus Nijoff Publishing，Boston，MA，第251-266页，(1985))。
                       实施例1
细胞和病毒
CEF细胞的制备、繁殖以及HVT的感染按先前描述的方法进行(C.Glaubiger et al.，J.Virol.45：1228-1234(1983)；P.M.Coussens and L.F.Velicer，J.Vriol.62：2373-2379(1988))。用于该研究的HVT疫苗菌株FC126的细胞传代到第10代(FC126p10)。用于该研究的血清型2疫苗菌株SB1的细胞传代到第29代(SB1p29)。CHCC-OU2细胞(H.Oguraand T.Fuiiwara，Acta Med.Okayama 41：141-143(1987))从美国农业部(USDA)鸟类疾病与癌实验室(ADOL)的Dr.Doald Salter(East Lansing，Michigan)处获得，在37℃含有5％CO2培养箱中，培养在添加10％小牛血清和2％磷酸胰蛋白胨肉汤(TPB)的Leibovitz L15-McCoy 5A(LM)(Gibco，Grand Island，NY)培养基中。
                  实施例2
MDV-OU2血清型1细胞系
用Md11p15感染CHCC-OU2细胞：
如在申请No.08/549,045中所示，将5.0×107CHCC-OU2细胞与2.0×107感染MD11p15的CEF混合，使CHCC-OU2被MDV菌株MD11的第15代培养细胞(MD11p15)感染，然后，培养在添加4％小牛血清(CS)的LM培养基中。CHCC-OU2细胞与感染的CEF细胞继续共培养四代。每一代的细胞保藏在-135℃冷冻的培养基中(添加20％CS和10％二甲亚砜的LM培养基(Life Technologies，Gaithersburg，MD))。在感染后的四代，观察到大量的空斑(每个150mm培养皿大约100个空斑)-CEF细胞感染MDV的特征。其中两个空斑用无菌克隆柱形分离器(cloning cylinder)分离。将克隆柱形分离器置于单个空斑之上，细胞用胰蛋白酶处理，并从克隆柱形分离器抽吸。抽吸出的细胞转移至含有添加4％CS的LM培养基的35mm培养皿中扩大培养。在扩大培养期间，不让细胞融合，每48小时或72小时更换培养基。扩大培养的克隆命名为MDV OU2.1和MDV OU2.2。
在MDV OU2.1和MDV OU2.2纯化过程中，慢慢地形成CPE。完全发展的空斑含合胞体呈圆形扩张区域、松散粘附，直至感染后四星期时才可见细胞。我们料想不到感染后14天出现可见的空斑而空斑的形成依赖于达到细胞培养融合和接触抑制的层度。通过比较，感染MDV菌株Md11p15的典型CEF单层细胞在感染后5-7天内将迅速形成可见的空斑，单层细胞在10-14天内完全破坏。CEF中空斑的形成与细胞单层的融合无关。在共培养4星期后，将细胞在-135℃下低温保藏两星期。冷冻的细胞通过将感染的(Md11p15/OU2)与未感染的CHC-OU2细胞混合，再建立细胞培养物。与MDV感染一致的空斑直到细胞达到融合-大约倒平板后14天才能观察到。
                     实施例3
FC126-OCL细胞系
对于FC126-OCL.1，第0代来自培养在100mm组织培养皿中融合CHCC-OU2被2.5×106 PFU第0代FC126(FC126p10)感染的CEF所感染。当CPE变得清楚时，收集感染的细胞，保存在含有10％DMSO、20％小牛血清的5％LM的储藏缓冲液(FSB)(第0代)中冷冻于-135℃。感染的冷冻细胞的10-2稀释液用来感染在24孔组织培养皿中培养的1孔融合的CHCC-OU2。CPE接近100％后，将细胞于-135℃冷冻在FSB中(第1代)。在-135℃储藏后，将细胞复苏，用来感染在24孔组织培养皿中培养的3孔稀释度分别是为10-1、10-2和10-3的融合CHCC-OU2(第2代)。合并三个稀释度，再倒入12孔组织培养平板的1个孔中(第3代)。当细胞融合、CPE变得清楚时，收集感染的细胞，并分别在12孔组织培养皿中的2个孔培养(第4代)。当CPE变得清楚时，从两个孔中收集细胞并合。取出0.1ml，在12孔组织培养皿中的1孔培养(第5代)。当CPE清楚时，收集细胞并冷冻在-135℃的FSB中。然后冷冻的细胞用来感染100mm组织培养皿中融合的CHCC-OU2(第6代)。当CPE清楚时，收集细胞，取出1/10样品以测定第6代的PFU/ml，其余的感染细胞再在100mm组织培养皿中倒平板(第7代)。当CPE清楚时，收集细胞，取出1/10样品以测定第7代的PFU/ml，其余的感染细胞再在100mm组织培养皿中倒平板(第8代)。当CPE清楚时，收集细胞，取出1/10样品以测定第8代的PFU/ml，其余的感染细胞作为FC126-OCL.1在-135℃冷冻在FSB中。
对于FC126-OCL.2，第0代来自在24孔组织培养皿的1孔中培养的与2.5×106感染FC126p10的CEF融合的CHCC-OU2。当CPE变为100％后，将细胞冻存在-135℃的FSB中。在-135℃储藏后，将细胞复苏，用来感染在24孔组织培养皿中培养的3孔稀释度分别为10-1、10-2和10-3的融合CHCC-OU2(第1代)。合并三个稀释度，在12孔组织培养平板的1孔中培养(第2代)。当细胞融合时，CPE变得清楚，计数为55个空斑。收集感染的细胞，并分别在12孔组织培养皿中的2个孔中培养(第3代)。当CPE变得清楚时，从两个孔中收集细胞合并。效价大约为5.5×103PFU/ml。取出0.1ml，在12孔组织培养皿中的1孔中培养(第4代)。当CPE清楚时，收集细胞并冷冻在-135℃的FSB中。然后冷冻的细胞用来感染100mm组织培养皿中的融合CHCC-OU2(第5代)。当CPE清楚时，收集细胞，取出1/10样品以测定第5代的PFU/ml，其余的感染细胞再在100mm组织培养皿中倒平板(第6代)。当CPE清楚时，收集细胞，取出1/10样品以测定第6代的PFU/ml，其余的感染细胞再在100mm组织培养皿中倒平板(第7代)。当CPE清楚时，收集细胞，取出1/10样品以测定第7代的PFU/ml，其余的感染细胞作为FC126-OCL.2于-135℃冷冻在FSB中。
产生感染HVT的CHCC-OU2细胞(FC126-OCL.3)的方法。在150mm组织培养皿中含有2.5×106CHCC-OU2细胞的单层融合细胞用2.0×106PFU的FC126p10感染的CEF进行感染。培养3天后，观察到大量空斑-病毒感染的特征。感染的细胞用胰蛋白酶处理，并转移到无菌150mm培养皿中。保存1/10样品以测定PFU数值。命名为第1代的感染细胞再培养两天，然后用胰蛋白酶处理，并转移到无菌150mm组织培养皿中，同时保存1/10样品以测定PFU数值。第2代的感染细胞再培养1天，然后用胰蛋白酶处理，并等份转移到无菌150mm培养皿中的两个孔中。保留1/10样品以测定PFU数值，1/10样品保存在-135℃的FSB中。以先前描述的方式进行感染细胞的系列传代增加感染细胞的比例(或PFU)。
尽管已描述了三种产生FC126-OCL的不同方法，并且由三种方法中分别产生的细胞分别命名为FC126-OCL.1、FC126-OCL.2和FC126-OCL.3，但由于所有三种都是用感染FC126p10的CEF的相同的原代细胞株建立的，因此三种细胞系基本上是相同的。只是传代水平和培养计数稍微不同。三种细胞系之间培养中的微小变化不能赋予三个细胞系以差异。细胞系的命名只是为了便于追踪实验，并不反映三个细胞系中FC126病毒生物学性质的差异。三种方法说明，无论使用哪种方法，都可以构建MDV细胞系。所有三种细胞都可以用一般名称FC126-OCL来表示。
                   实施例4
SB1-OCL细胞系
产生感染SB1的CHCC-OU2(SB1-OCL.1)的方法与产生FC126-OCL.3描述的方法相同。在150mm培养皿中含有20×106CHCC-OU2细胞的单层融合细胞用3×105PFU的第29代SB1(SB1p29)感染的CEF进行感染。培养3天后，观察到大量空斑-病毒感染的特征。感染的细胞用胰蛋白酶处理，并转移到无菌150mm培养皿中。保存1/10样品以测定PFU数值。命名为第1代的感染细胞再培养两天，然后用胰蛋白酶处理，并转移到无菌150mm培养皿中，同时保存1/10样品以测定PFU数值。第2代的感染细胞再培养1天，然后用胰蛋白酶处理，并等份转移到2个无菌150mm培养皿中。保留1/10样品以测定PFU数值。以先前描述的方式进行系列传代增加感染细胞的比例(或PFU)。以先前描述的方式制成传代水平为3、4以及多至20的SB1-OC1原代细胞株。
                    实施例5
HVT-OCL细胞系和SB1-OCL细胞系病毒效价的测定
FC126-OCL细胞系.1、.2和.3以及SB1-OCL.1的PFU的测定是通过培养保存的1/10样品(来自CEF的每次传代3)的系列稀释液来进行。在含有4％小牛血清的LM中制成系列稀释液，稀释度以10倍递增，范围为10-1-10-7。
表1表明，细胞系FC126-OCL.1和FC126-OCL.3组织培养第5、6、7和8代细胞以及细胞系FC126-OCL.2和SB1-OCL.1头三代的效价增加。由于这些代的细胞是由感染细胞在空组织培养皿中再倒平板制成的，并不是简单地感染组织培养皿中的未感染细胞，因此在每一培养传代后效价的增加表示含有病毒的细胞系的富集。在用原始感染FC126的CEF的高效价原代细胞株感染后，由于几个原因使得在细胞系纯化的随后传代中没有CEF能存活。1)CEF的寿命有限，在组织培养中存活不超过两三个星期，因此在CHCC-OU2初始感染两个星期以后，CEF就已死亡。2)CHCC-OU2是被接近100％CPE的感染CEF进行初始感染的。在100％CPE时，每个细胞都被感染，并且感染的细胞开始与组织培养皿分离，在感染的此时将CEF例平板不能形成单层细胞3)CEF对冷冻-复苏非常敏感，经过几轮冷冻-复苏后通常不能存活。FC126-OCL.3细胞系的PFU/ml比在CEF上繁殖的FC126的PFU/ml高两个数量级。SB1-OCL.1细胞系的PFU/ml比在CEF上繁殖的SB1的PFU/ml高两个数量级。两个细胞系的最大效价尚未测定。
                      表1
传代水平 FC126-OCL.1(PFU/ml) FC126-OCL.2(PFU/ml) 传代水平 FC126-OCL.3(PFU/ml) SB1-OCL.1(PFU/ml)
  5 ND  3.5×103   0  1.6×106  3.6×105
  6 1×104  3.0×105   1  4.2×105  3.2×105
  7 8.5×105  1×106   2  3.0×106  8.7×105
  8 0.9×106    ND   3  4.5×108  1×106
                     实施例6
FC126-OC1.1与常规FC126疫苗的比较
市售HVT疫苗菌株FC126(FC126-OCL)的可传代细胞系保护鸡抵抗MDV的能力与在CEF上繁殖的HVT疫苗菌株FC126(FC126-CEF)-当前生产MDV疫苗的方法-的抗MDV能力进行比较。该实验将FC126-OCL以当前FC126疫苗推荐的相同剂量免疫1天大的鸡，比较两者的功效。
四组1天大的鸡(无特殊病原体，来自SPAFAS，Chicago，IL对MDV敏感的鸡)接种以下疫苗：1)2,000 PFU第17代细胞培养的FC126-OCL(16只鸡)，2)2,000 PFU第10代细胞培养的FC126-CEF(16只鸡)，3)与FC126-OCL相同细胞浓度的未感染OCL(10只鸡)。第四组10只鸡作为对照。接种疫苗后第7天，第1组和第2组的13只鸡和第3组的8只鸡以及对照组注射(challenge)2,000 PFU的毒性MDV菌株GA。注射后第32天，这些鸡作尸体解剖，以检查MDV感染的病理学迹象。MDV病理学表达证实为外周神经系统的肉眼损害、在多种器官(诸如生殖腺、肝、肾、心脏和脾之类)内存在淋巴样肿瘤以及腔上囊萎缩。
接种未感染细胞系的鸡和对照组鸡都有大量MDV感染的病理特征。非常明显，接种FC126-OCL细胞系并注射MDV的鸡都没有MDV感染的任何病理学证据。功效实验的结果示于表2中。实验证明，在使用FC126-CEF市推荐剂是相同的剂量水平下，FC126-OCL与FC126-CEF具有相同的免疫效果。
                表2
                 保护功效
疫苗1     保护3   保护指数4
FC126-OCL     13/0      100
FC126-CEF     13/0      100
OCL细胞2     2/8      -
对照     1/8      -
1鸡在第1天接种2000 PFU疫苗。2鸡接种等于2000 PFU FC126-OCL1p17中细胞数的OCL细胞。3所有鸡在接种后第7天注射2000 PFU MDV菌株GA。实验在注射后第32天结束。保护标志为尸体解剖缺乏MDV的迹象。4保护指数：对照中MD％-接种的MD％/对照MD％×100。
                     实施例7
MVD在细胞系中的稳定性
MDV-OU2细胞系传代第31代后，通过PCR分析病毒DNA het区域的扩张。意想不到的是，没有观察到het区域的扩张。因此，与MDV在CEf中的繁殖不同，MDV在本发明中稳定化，因此使得MDV细胞系可以无限地繁殖，而没有疫苗功效降低的风险。
用在细胞培养中系列传代后PCR分析以评估MDV OU2.2和OU2.1中的132bpDR顺序的数目。
总细胞DNA用标准方法从第14代MD11细胞感染的CEF、第48代MD11细胞感染的CEF和第48代MDV-OU2.2细胞中提取(J.Sambrook，et al.，in“Molecular cloning：a laboratory manual”，2nd ed.，Cold Spimg Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)第9.16-9.19页)，并用作PCR扩增132bp DR顺序的模板。上游寡聚核苷酸引物为5’-TGCGATGAAAGTGCTATGGAGG-3’(SEQ ID NO：1)。下游寡聚核苷酸引物为5’-GAGAATCCCTATGAGAAAGCGC-3’(SEQID NO：2)。上游引物位于距DR顺序的5’端3bp处。下游引物位于DR顺序3’端下游6bp处。两个引物在两个拷贝DR顺序的情况下扩增317bp片断(R.F.Silva，Avian Dis.36：521-528(1992))。PCR的条件由原来的条件稍微作些修改(R.F.Silva，Avian Dis.36：521-528(1992))。简单地说，将500ng总细胞DNA与每种dNTP 20mM、每对寡聚核苷酸引物20μM、10μl 10×PCR反应缓冲液(GIBCO BRL，Life Technologies，Gathersburg，MD)、1.5mM MgCl2和1.0 U Taq聚合酶(GIBCO BRL，Life Technologies，Gathersburg，MD)混合。使用GeneAmp 9600扩增仪(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)进行PCR反应。按照最初在95℃变性5分钟的步骤，在95℃ 45秒、67℃ 45秒和72℃ 45秒进行25个周期的扩增。通过在72℃ 10分钟的最后伸长步骤完成PCR反应。PCR产物在用溴化乙锭染色的6％聚丙烯酰胺凝胶上进行分析，在紫外光下拍照。通过比较1kb DNA梯式标记(GIBCO BRL，Lfie Technologies，Gathersburg，MD)测定扩增片断的大小。
在所有反应中，都可以见到185kb的扩增片断-相当于1个拷贝的132bp DR(图2)。然而，病原MD11的特征-相当于2个拷贝的132bp DR的317kb片断在第14代MD11中占优势(图2，第1列)。该317bp片断到第48代时在MD11中减弱，不再存在(图2，第2列)。很明显，第48代的MDV OU2.2仍保留病原MD11特征的317bp片断(图2，第3列)。
PCR分析结果显示出，在MDV OU2.2和OU2.1(未显示)细胞系中的MDV在体内系列传代48代后不减弱。相反，正如所预期的，MD11在CEF上体内系列传代48代后减弱。这些结果显示出，MDV在体内繁殖期间稳定地保留在CHCC-OU2细胞中。这一未预期的结果对MDV疫苗生产商非常重要，因为本发明使得疫苗病毒能在体内无限繁殖或至少繁殖48个细胞世代。这与在CEF上MDV疫苗菌株的繁殖相反，后者的体内传代导致保护功效的丧失。通常的MDV疫苗菌株只可以在CEF上从原代细胞株繁殖5代。5代后的每一代在得到美国农业部的许可证之前，必须证明功效与第5代相同。一旦向美国农业部证明，本发明则能够使疫苗菌株从原代细胞株后无限繁殖，在第5代后不用每代再取得资格。
以下实施例表明CHCC-OU2细胞的特征。感染MDV细胞的这些特征是相同的。
                      实施例8
B.F.Benkel等人的技术(Poultry Science 71：1520-1526(1992))用来证明CHCC-OU2细胞是ev1纯合的。总细胞DNA用标准方法(J.Sambrook，et al.，in“Molecular cloning：a laboratory manual”，2nd ed.，Cold Spirng Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)第9.16-9.19页)从CHCC-OU2细胞和含有ev1、ev1和ev6、或ev15的鸟类细胞中提取。总细胞DNA用作PCR扩增的模板，使用的引物组含有引物PR-A(5’-GCACCAAACAATCTAGTCTGTGC)(SEQ IDNO：3)、PR-B(5’-AAGTACTCACTTCTCTGAAC)(SEQ ID NO：4)和PR-C(5’-GCCAAGCTTCAATGAAGCAGAAGGCTTC) (SEQ  DNO：5)。引物PR-A对ev1插入的上游基因组区域是特异性的。引物PR-B对ev1插入的下游基因组区域是特异性的，而引物PR-A对ev1的长末端重复是特异性的。用这些引物，来自ev1纯合的鸟类DNA的PCR将产生长度为300bp的DNA片断。用这些引物，来自ev1杂合的鸟类DNA的PCR将产生300bp和510bp的DNA片断，而来自缺乏ev1的鸟类DNA的PCR将产生510bp的DNA片断。使用GeneAmp9600扩增仪(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)按B.F.Benkel等人描述的进行PCR反应(Poultry Science 71：1520-1526(1992))。PCR产物在用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶来进行分析，并在紫外光下拍照(J.Sambrook，et al.，in“Molecular cloning：a laboratory manual”，2nd ed.，Cold Spirng Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)第6.2-6.19页)。通过比较1kb DNA梯式标记(GIBCO BRL，Life Technologies，Gathersburg，MD)测定扩增片断的大小。图3中，CHCC-OU2细胞产生300bp的单一产物，显示CHCC-OU2细胞是ev1纯合的。杂合ev1以及ev1和ev6、阳性对照DNA产生300 bp和510bp两个产物。阴性对照ev15 DNA只产生510bp产物，预计该DNA不含ev1。
B.F.Benkel和E.J.Smith的技术(Poultry Science 72：1601-1605(1993))用来证明CHCC-OU2细胞是ev15纯合的。来自CHCC-OU2细胞和含ev1或ev15的鸟类细胞的总细胞DNA用作PCR扩增的模板，使用的引物组含有引物15-1(5’-CAAATGAGGGTAATAAGGGAG)(SEQ ID NO：6)和15-2(5’-CACTACCAAATATAATTCTGTAG)(SEQID NO：7)。引物15-1对ev15插入的上游基因组区域是特异性的，而引物PR-B对ev15插入的下游基因组区域是特异性的。用这些引物，来自ev15纯合的鸟类DNA的PCR将产生长度为434bp的DNA片断。用这些引物，来自ev15杂合的鸟类DNA的PCR将产生434bp和181bp的DNA片断，而来自缺乏ev15的鸟类DNA的PCR将产生181bp的DNA片断。使用GeneAmp 9600扩增仪(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)按B.F.Benkel等人描述的进行PCR反应(Poultry Science 71：1520-1526(1992))。PCR产物在用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶来进行分析，并在紫外光下拍照(J.Sambrook，et al.，in“Molecular cloning：alaboratory manual”，2nd ed.，Cold Spirng Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)第6.2-6.19页)。通过比较1kb DNA梯式标记(GIBCO BRL，Life Technologies，Gathersburg，MD)测定扩增片断的大小。图4中，CHCC-OU2细胞产生434bp的单一产物，显示CHCC-OU2细胞是ev15纯合的。杂合ev15以及阳性对照DNA产生434bp和181bp两个产物。阴性对照ev1 DNA只产生181bp产物，预计该DNA不含ev15。
可以支持MDV复制并用来生产MDV疫苗的连续细胞系对家禽工业具有极大的经济意义。这一细胞系的优点是：1)由于消除了必须连续供应能生育的SPF畜群的蛋这一环节，降低了由于SPF蛋供应中断引起的疫苗生产损失的风险，并消除了能生育的SPF蛋价格的影响，该细胞系实际上降低了与生产MDV疫苗有关的成本；2)原代细胞株可能合法化，藉此避免了与制备每批CEF细胞有关的风险；3)感染MDV疫苗菌株的CHCC-OU2细胞可以无限繁殖，病毒的生产可以让感染的细胞达到融合来诱导；4)CHCC-OU2细胞可以使用由CEF细胞生产MDV疫苗所用的同样生产技术；5)MDV被稳定在细胞系中。降低的成本将使家禽生产商和消费者受益。在本发明中，生产MDV并用作疫苗以保护鸟类抵抗马立克氏病的可传代细胞系进行了权利要求。
以上描述只是为了说明本发明，本发明仅受下文所附的权利要求所限制。
                           附录1(1)一般资料(i)申请者：Paul M.Coussens，Amin
         Abuioub，J.David Reilly(ii)发明的题目：用于马立克氏病毒疫苗生产的可传代细胞
              系的改进(iii)顺序数目：7(iv)通讯地址
(A)地址：Ian C.Mcleod
(B)街道：2190Commond Parkway
(C)城市：Okemos
(E)国家：美国
(F)邮政编码：48864(v)计算机可读形式
(A)媒体类型：软盘
(B)计算机：IBM兼容
(C)操作系统：MS-DOS(版本3.3)
(D)软件：Wordperfect 5.1(vi)当前的申请资料
(A)申请号：
(B)存档日期：
(C)分类：(vii)先前的申请数据
(A)申请号码：08/549,045
(B)存档日期：1995年10月27日(viii)委托人/代理人资料
(A)姓名：Ian C.McLeiod
(B)登记号码：20.931(ix)电讯资料
(A)电话：(517)347-4100
(B)传真：(517)347-4103(2)SEQ ID NO：1的资料(i)顺序特征
(A)长度：22个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线形(ii)分子类型：
(A)说明：合成DNA(iii)假说：否(iv) 反向：否(vi)来源：
(A)有机体：马立克氏病毒(vii)IMMEDIATE SOURCE：
(A)图书馆：(xi)顺序说明：SEQ ID NO：1TGCGATGAAA GTGCTATGGA GG                22(3)SEQ ID NO：2的资料
(i)顺序特征
  (A)长度：22个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：
  (A)说明：合成DNA
(iii)假说：否
(iv)反向：否
(vi)来源：
  (A)有机体：马立克氏病毒
(vii)IMMEDIATE SOURCE：
  (A)图书馆：
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：2GAGAATCCCT ATGAGAAAGC GC               22(4)SEQ ID NO：3的资料
(i)顺序特征
  (A)长度：23个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：
  (A)说明：合成DNA
(iii)假说：否
(iv)反向：否
(vi)来源：
  (A)有机体：马立克氏病毒
(vii)IMMEDIATE SOURCE：
  (A)图书馆：
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：3：GCACCAAACA ATCTAGTCTG TGC               23 (5)SEQ ID NO：4的资料
(i)顺序特征
  (A)长度：20个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：
  (A)说明：合成DNA
(iii)假说：否
(iv)反向：否
(vi)来源：
  (A)有机体：鸟类逆转录病毒
(vii)IMMEDIATE SOURCE：
  (A)图书馆：N/A
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：4：AAGTACTCAC TTCTCTGAAC               20(6)SEQ ID NO：5的资料(i)顺序特征
  (A)长度：28个碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线形(ii)分子类型：
  (A)说明：合成DNA(iii)假说：否(iv)反向：否(vi)来源：
 (A)有机体：鸟类逆转录病毒(vii)IMMEDIATE SOURCE：
 (A)图书馆：N/A(xi)顺序说明：SEQ ID NO：5：GCCAAGCTTC AATGAAGCAG AAGGCTTC           28(7)SEQ ID NO：6的资料(i)顺序特征
 (A)长度：21个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑学：线形(ii)分子类型：
 (A)说明：合成DNA(iii)假说：否(iv)反向：否(vi)来源：
 (A)有机体：鸟类逆转录病毒(vii)IMMEDIATE SOURCE：
 (A)图书馆：N/A(xi)顺序说明：SEQ ID NO：6：CAAATGAGGG TAATAAGGGA G                  21(8)SEQ ID NO：7的资料(i)顺序特征
 (A)长度：23个碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：单链
 (D)拓扑学：线形(ii)分子类型：
 (A)说明：合成DNA(iii)假说：否(iv)反向：否(vi)来源：
 (A)有机体：鸟类逆转录病毒(vii)IMMEDIATE SOURCE：
 (A)图书馆：N/A(xi)顺序说明：SEQ ID NO：7：CACTACCAAA TATAATTCTG TAG                23

Claims (43)

1.在由鸡胚细胞(CEC)(为鸡辅助因子(CHf)阴性并不含病毒，用化学诱变剂处理，然后感染MDV)衍生的单层培养中可传代的感染马立克氏病毒的鸡细胞系，该细胞系能够体内感染鸟类，其中MDV可以以溶源性或非溶源性感染保留在细胞系内。
2.权利要求1的细胞系，其中MDV用来制备病毒疫苗，以在鸟类中产生免疫。
3.权利要求1或2中任何一项权利要求的细胞系，其中MDV是选自血清型1、血清型2或血清型3MDV的病毒，其中血清型3是火鸡疱疹病毒(HVT)。
4.权利要求1或2中任何一项权利要求的细胞系，其中MDV是包含插入MDV中的一个或多个位点的一个或多个外源基因的基因工程MDV。
5.权利要求1或2中任何一项权利要求的细胞系，其中MDV是包含一个或多个缺失MDV的区域的基因工程MDV。
6.权利要求1的细胞系，其中MDV选自火鸡疱疹病毒(HVT)菌株FC126-OCL(以细胞系ATCC CRL 12052保藏)和马立克氏病毒(MDV)菌株SB1-OCL(以细胞系ATCC CRL12053保藏)。
7.权利要求1、2或6中任何一项权利要求的细胞系，其中CEC为CHCC-OU2。
8.权利要求1、2或6中任何一项权利要求的细胞系，其中MDV可以通过细胞应激反应或sescenence再活化为非溶源性感染。
9.在非融合单层培养中生产被潜伏的马立克氏病毒(MDV)感染的可传代鸡细胞系的方法，包括：
(a)将鸡胚细胞(为鸡辅助因子(CHf)阴性、不含病毒并用化学诱变剂处理过)与MDV在培养基中混合，使得CEC感染MDV；
(b)从未感染的CEC中纯化感染MDV的CEC；
(c)繁殖感染MDV的CEC以在单层培养中生产细胞系，其中MDV可以以溶源性或非溶源性感染保留在细胞系内。
10.权利要求9的方法，其中MDV病毒选自由原代胚胎成纤维细胞衍生的与细胞相关的MDV病毒、无细胞MDV和转染到CEC的MDV DNA。
11.权利要求9或10中任何一项权利要求的方法，其中MDV是用来制备病毒疫苗以在鸟类中产生免疫的病毒。
12.权利要求9或10中任何一项权利要求的方法，其中MDV选自血清型1、血清型2或血清型3MDV的病毒，其中血清型3是火鸡疱疹病毒(HVT)。
13.权利要求9或10中任何一项权利要求的方法，其中MDV是包含插入MDV中的一个或多个位点的一个或多个外源基因的基因工程MDV。
14.权利要求9或10中任何一项权利要求的方法，其中MDV是包含一个或多个缺失的MDV基因的基因工程MDV。
15.权利要求9或10中任何一项权利要求的方法，其中MDV选自火鸡疱疹病毒(HVT)菌株FC126-OCL(以细胞系ATCC CRL 12052保藏)和马立克氏病毒(MDV)菌株SB1-OCL(以细胞系ATCC CRL 12053保藏)。
16.权利要求9或10中任何一项权利要求的方法，其中CEC为CHCC-OU2。
17.用马立克氏病毒(MDV)感染鸟类的方法，包括：
(a)提供由鸡胚细胞(为鸡辅助因子(CHf)阴性并不含病毒，用化学诱变剂处理，然后感染MDV)衍生的、作为单层培养保持的、感染马立克氏病毒的可传代鸡细胞系，其中MDV可以以溶源性或非溶源性感染保留在细胞系内，该细胞系能够体内感染鸟类；
(b)用疫苗接种鸟类。
18.权利要求17的方法，其中接种是通过注射或口服。
19.权利要求17或18中任何一项权利要求的方法，其中MDV是用来制备病毒疫苗以在鸟类中产生免疫的病毒。
20.权利要求17或18中任何一项权利要求的方法，其中MDV选自血清型1、血清型2或血清型3MDV的病毒，其中血清型3是火鸡疱疹病毒(HVT)。
21.权利要求17或18中任何一项权利要求的方法，其中MDV是包含插入MDV中的一个或多个位点的一个或多个外源基因的基因工程MDV。
22.权利要求17或18中任何一项权利要求的方法，其中MDV是包含一个或多个缺失的MDV基因的基因工程MDV。
23.权利要求17的方法，其中MDV选自火鸡疱疹病毒(HVT)菌株FC126-OCL(以细胞系ATCC CRL 12052保藏)和马立克氏病毒(MDV)菌株SB1-OCL(以细胞系ATCC CRL 12053保藏)。
24.权利要求17、18或23的方法，其中细胞系含有为CEC成纤维细胞的CHCC-OU2。
25.权利要求17的方法，其中疫苗含有细胞系。
26.鸟类疫苗的剂量形式，含有由鸡胚细胞(为鸡辅助因子(CHf)阴性并不含病毒，用化学诱变剂处理，然后感染MDV)衍生的、作为单层培养保持的、感染马立克氏病毒的可传代鸡细胞系，其中MDV可以以溶源性或非溶源性感染保留在细胞系内。
27.权利要求26的疫苗，其中MDV是用来制备病毒疫苗以在鸟类中产生免疫的病毒。
28.权利要求26或27中任何一项权利要求的疫苗，其中MDV选自血清型1、血清型2或血清型3 MDV的病毒，其中血清型3是火鸡疱疹病毒(HVT)。
29.权利要求26或27中任何一项权利要求的疫苗，其中MDV是包含插入MDV中的一个或多个位点的一个或多个外源基因的基因工程MDV。
30.权利要求26或27中任何一项权利要求的疫苗，其中MDV是包含一个或多个缺失的MDV基因的基因工程MDV。
31.权利要求26的疫苗，其中MDV选自火鸡疱疹病毒(HVT)菌株FC126-OCL(以细胞系ATCC CRL 12052保藏)和马立克氏病毒(MDV)菌株SB1-OCL(以细胞系ATCC CRL 12053保藏)。
32.权利要求26、27或31中任何一项权利要求的疫苗，其中细胞系含有为CEC成纤维细胞的CHCC-OU2。
33.以ATCC CRL 12052保藏的、含有马立克氏火鸡疱疹病毒(HVT)菌株FC126-OCL的可无限繁殖的马立克氏疱疹病毒细胞系。
34.以ATCC CRL 12053保藏的、含有马立克氏血清型2病毒(MDV)菌株SB1-OCL的可无限繁殖的马立克氏疱疹病毒细胞系。
35.权利要求17的方法，其中疫苗含有由细胞系获得的病毒。
36.在由鸡胚细胞(CEC)(为鸡辅助因子(CHf)阴性以及非恶性的，含有来自鸟类逆转录病毒的DNA顺序，并在细胞培养中连续生长)衍生的单层培养中可传代的感染马立克氏病毒的鸡细胞系。
37.权利要求36的细胞系，其中MDV用来制备病毒疫苗，以在鸟类中产生免疫。
38.权利要求36或37中任何一项权利要求的细胞系，其中MDV是包含插入MDV中的一个或多个位点的一个或多个外源基因的基因工程MDV。
39.权利要求36或37中任何一项权利要求的细胞系，其中MDV是包含一个或多个缺失MDV的区域的基因工程MDV。
40.权利要求36或37中任何一项权利要求的细胞系，其中CEC为CHCC-OU2。
41.权利要求36或37中任何一项权利要求的细胞系，其中MDV可以通过细胞应激反应或sescenence再活化为非溶源性感染。
42.权利要求26的疫苗，其中MDV是火鸡疱疹病毒(HVT)。
43.权利要求26的疫苗，其中MDV是血清型2MDV。
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