CN1114100A

CN1114100A - 沙门氏菌活疫苗

Info

Publication number: CN1114100A
Application number: CN94190658A
Authority: CN
Inventors: K·林德; J·伯尔; B·兰德哈根
Original assignee: Tad Pharmaceutical Products Co ltd
Current assignee: Tad Pharmaceutical Products Co ltd
Priority date: 1993-09-04
Filing date: 1994-08-29
Publication date: 1995-12-27
Anticipated expiration: 2014-08-29
Also published as: DE4496626D2; ES2168265T3; CA2131231C; DK0642796T3; CN1097466C; DE10299020I2; AU687861B2; EP0642796A1; WO1995007101A3; EP0642796B1; JP2838098B2; BR9405578A; ATE209929T1; NL300092I2; DE10299020I1; WO1995007101A2; RU95112808A; DE59310244D1; CA2131231A1; PT642796E

Abstract

包含大环内酯抗生素敏感性标记(外膜标记)的至少一种减毒免疫原性沙门氏菌活疫苗株的用途，它用于制备对特异宿主的活疫苗，在由该特异宿主引起的另一宿主感染的情况下，该活疫苗有助于用大环内酯类抗生素对被感染动物进行有效的治疗。

Description

本发明涉及沙门氏菌活疫苗的特殊用途，以前未曾使用的新沙门氏菌活疫苗，制备这种疫苗的方法以及适当的沙门氏菌疫苗株。

大部分沙门氏菌决定的人的胃肠炎感染是由污染的动物产品引起的。最近，特别是被现今主要存在的血清型肠炎沙门氏菌污染的鸡和鸡蛋，都已造成越来越多的感染。然而源自大量培养的动物的所有食品都受影响。一般许多动物呆在一个有限的空间内，这就加速了动物群间传染的扩散。

按常规兽医措施切断传染链可以减小从感染动物到人的传染转移的危险。另外，在处理污染的动物产品过程中严格遵守厨房卫生规则可以防止向人的转移。但是在食品储存和处理过程中，特别是前述规则往往不能被遵守。因此，迫切需要从开始时就排除处理感染动物的可能性。这可以通过如给动物群接种抗沙门氏菌感染的疫苗而获得。

适当的沙门氏菌活疫苗必须符合各种不同的条件：

1.必须调节用于制备疫苗的菌株的毒性，一方面保证非显性感染，另一方面保证疫苗株在宿主组织中的足够持久性，这是高免疫原性的必要条件。

2.另外，相对其毒性和其保护特性，必须广泛保证所用疫苗株的稳定性，即必须保证它们不会突变返回致病性野生株。

3.为了使传染的可能性减小，应确保疫苗株的活体排泄不是持久性的，并且它们在环境中仅在短时间内存活。

下面详细讨论活疫苗应符合的上述三个条件。如1.中所述，适当的沙门氏菌活疫苗的产生是基于减小病原性沙门氏菌的毒性（减毒）和同时保留它们的抗原结构，从而在宿主中具有致免疫效果。一种可能性是如使用缺失突变体作为疫苗株，如pur或aro营养缺陷型克隆。这些疫苗株的减毒水平依赖于体内代谢物的缺乏，这可能防碍对免疫宿主的准确适应。关于这一点，参考EP 0 263 528，其中描述了具有不同减毒水平的鼠伤寒沙门氏菌的稳定asp突变体。通过选择适当的asp突变体可制备具有与每种不同的宿主种相适应的减毒水平的疫苗株。

减毒的另一种可能性是使用这样的疫苗株，其减毒作用可追溯到代谢漂移突变（以下称为stwd突变或标记）。“代谢漂移”指所有关键酶和功能上重要的细胞区已分别通过突变产生功能改变，例如核糖体蛋白、促旋酶、RNA聚合酶、透性酶，这些突变的结果使翻译、DNA复制、DNA转录或穿透受到或多或少的明显扰乱。另外，这种stwd突变体对特异抗生素和其它物质（有毒物质）有抗性。stwd突变体很容易在实验室作为染色体抗生素抗生突变体得到。关于这一点，从EP 0 263 528已知例如对萘啶酮酸（Nal）、链霉素（Sm）或利福霉素（Rif）有抗性的stwd突变体。特别是如果将几个stwd标记整合在一个疫苗株中（双标记或三标记疫苗株），事实上得到了无限的可能性以制备适应于每个特异性宿主种类的理想的减毒水平。

关于“通过stwd突变减毒”的现有技术，参考下列出版物：

DD-WP 155 294；DD-WP 218 834；DD-WP 235 828；DD-WP 253 182；DD-WP 253 184；DD-WP 281 118；DD-WP 294 420；EP 0 263 528.

另一个条件（以上2.中提及的）是通过突变得到的减毒疫苗株不会突变返回毒性野生株。该稳定性要求一方面可通过仅使用在体外检测不到回复突变或其回复突变率＜10^-7的疫苗株来达到。另一种可能性是使用含12个独立减毒的突变的疫苗株。这样，几乎可以排除复原突变的可能性。

在上述3.中提及的最后一个条件与“切断传染链”有关，特别涉及关于可能的排泄和疫苗株在接种宿主体外长期存活的危险。关于这一点，最好减少排泄和疫苗株在环境中生存的能力。另一方面，为了保证充分的免疫应答，经例如口服或非胃肠道施用后，疫苗株在宿主组织中的临时生存能力应不受损害或仅略受损害。从DD-WP 218 836、DD-WP 231 491、DD-WP 253 182、DD-WP 253 183、DD-WP 253 184和EP 0263 528中已知符合这种要求的疫苗株突变体。现有技术中建议使用减小排泄和在环境中的生存能力的所谓抗流行标记，来优化适当的疫苗株。抗流行标记在广义上表征外膜突变，引起外膜中通透屏障的功能性变异。

可根据应用目的得到具有不同抗流行标记的疫苗株。目前已知的抗流行标记，根据它们在外膜中产生的变化，可分为三类。第一类包括所谓的hst标记。hst标记的掺入使疫苗株变得对胆汁、阴离子洗涤剂、大环内酯抗生素和其它有毒物质高度敏感。由于对胆汁的高敏性，导致肠腔中已存在的疫苗株失活，从而减小随粪便的排泄。由于外膜中缺乏对表面活性剂和大环内酯及其它毒性物质的通透屏障，如果疫苗株细菌被排泄，它们在环境中的存活时间缩短。因此，当使用包括hst标记的疫苗株时，几乎可以排除传染。但当使用常规剂量的疫苗时，含hst标记的疫苗株只能经非胃肠道施用。由于对胆汁的高敏性，如果口服施用，其毒性受到一定程度的影响，致使只有使用特别高剂量的疫苗才能取得足够的免疫应答。因此，口服施用的溶液将提供包括其它两类之一的抗流行标记的疫苗株。一类包括所谓的rbt标记（对胆汁耐受性的回复突变）。可从hst标记突变得到rbt标记。它提供具有与hst标记等同的抗流行能力的疫苗株。但与hst标记相反，含rbt标记的疫苗株对胆汁有耐受性，从而可以口服施用而不减低毒性损害接种效果。另一类所谓的rtt标记（对表面活性剂耐受性的回复突变）的情况与此相同。rtt标记可从rbt标记突变得到。含rtt标记的疫苗株对表面活性剂有耐受性，同时由于保留了对大环内脂和其它有毒物质的高敏性，它具有足够的抗流行能力。另外，rtt标记株可毫无问题地口服施用。

以这些信息和这些出版物为基础，可制备符合所有要求条件的活疫苗。对每种宿主的适应可在如动物试验系列中进行。

还有另一问题需要解决。尽管采取了所有的预防措施，但还不能排除进行动物接种或疫苗生产的人与事实上已减毒但仍为病原性的沙门氏菌疫苗株接触。对于健康人来说，几乎没有任何感染的危险。但如果人的免疫系统减弱（如由HIV感染所致），与这种疫苗株的接触可导致沙门氏菌的感染。

因此，本发明的目的是提供抗沙门氏菌感染的活疫苗，从已知现有技术开始，对待免疫宿主最优化减毒，当口服或非胃肠道施用时提供减低野生株排泄的免疫，对免疫系统弱的人仅构成很小的危险或根本不构成危险。本发明的另一目的是提供制备沙门氏菌活疫苗的方法，它通过使用比常规方法明显少的动物实验得到对具体宿主适合的最佳活疫苗。最后，本发明是提供适合于鸡的沙门氏菌活疫苗株。

此目的通过下述第1和2项的特异性活疫苗、第10项制备沙门氏菌活疫苗的特异方法、以及第20项的活疫苗株来达到的。

1.包含大环内酯抗生素敏感性标记（外膜标记）的至少一种减毒免疫原性沙门氏菌活疫苗株的用途，它用于制备对特异宿主的活疫苗，在由该特异宿主引起的另一宿主感染的情况下，该活疫苗有助于用大环内酯类抗生素对被感染动物进行有效的治疗。

2.从至少一种减毒的免疫原性活疫苗株制得的沙门氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗株具有一种外膜标记，该标记除任选对大环内酯类抗生素具有敏感性外，导致疫苗株对除大环内酯类抗生素外的特异的治疗有效抗生素的敏感性提高。

3.根据1或2的活疫苗，其特征在于该疫苗株包括用于减毒的至少一种染色体抗生素抗生突变，但不排斥对治疗有效的抗生素的敏感性提高。

4.根据2或3的活疫苗，其特征在于所述外膜标记使疫苗株对喹诺酮类、氯霉素类或四环素类抗生素的敏感性提高。

5.根据4的活疫苗，其特征在于所述外膜标记使疫苗株对抗生素ciprofloxacin的敏感性提高。

6.根据1-5的活疫苗，其特征在于疫苗株含有用于减毒的代谢漂移突变，包括链霉素抗性和/或利福霉素抗性。

7.根据1-6的活疫苗，其特征在于它包括至少一种血清型O-类B（如鼠伤寒沙门氏菌）、D（如肠炎沙门氏菌）、C（如婴儿沙门氏菌）和E（如鸭沙门氏菌）的疫苗株作为单、双、三或四疫苗。

8.根据6的活疫苗，其特征在于

-单疫苗由疫苗株S.tm Ssq/Sm 60/Rif 42（No.4242；保藏号DSM 8433）或S.tm Nal 2/Rif 9/Rtt（No.4223；保藏号DSM 8432）或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12（No. 4266；保藏号DSM 8435）或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k（No.4298；保藏号DSM 9362）或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g（No.4297；保藏号DSM 9361）或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 3（No.4296；保藏号9360）组成，-双疫苗由上述一种S.tm疫苗株和S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 3组成，

-三或四疫苗由上述S.tm疫苗株之一，S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 3，S.inf Ssq/Sm 153/Rif（No.4289；保藏号DSM 8434）和/或S. ana Ssq/Sm 81/Rif 21（No.4279；保藏号DSM 8441）组成。

9.用于口服免疫小鸡以及口服或经非胃肠道免疫/加强免疫鸡以抗沙门氏菌感染的活疫苗，该活疫苗是从至少一种减毒的免疫原性疫苗株制得的，特别是根据1-8之一的活疫苗，其特征在于选择增代时间为约28-34分钟的疫苗株用于制备活疫苗。

10.沙门氏菌活疫苗的生产方法，该活疫苗的减毒水平被优化适合于宿主，并且从至少一种减毒的免疫原性沙门氏菌活疫苗株制得，其特征在于具有适于宿主的延长的增代时间的疫苗株用作减毒当量，其中适合于宿主（血清型）的疫苗株的具体延长的增代时间是在一次实验中确定的。

11.根据10的方法，其特征在于在初步试验中适于宿主的延长的增代时间是如此测定的：从一系列分级延长增代时间开始，根据最大可能减毒水平/延长的增代时间和野生株排泄的优化减低之间的关系选择适当的疫苗株，任选地将其延长的增代时间作为减毒当量转用到同属其它血清型。

12.根据10或11的优化适于小鸡或鸡的疫苗的制备方法，其特征在于选择疫苗株，其传代时间与野生株相比从约22分钟延长到了约28-34分钟。

13.根据12的方法，其特征在于所用疫苗株得自野生株，首先提供给野生株链霉素（Sm）或萘啶酮酸标记，使增代时间从22分钟延长到25-29分钟，然后再提供利福霉素（Rif）标记，进一步延长增代时间，分离作为增代时间为28-34分钟的适当疫苗株的克隆，再以已知方式制备疫苗如从形成的疫苗株中选择疫苗株来制备。

14.根据10-13的方法，其特征在于如鼠伤寒沙门氏菌（S.tm）、肠炎沙门氏菌（S.ent）、婴儿沙门氏菌（S.inf）和鸭沙门氏菌（S.ana）用作沙门氏菌血清型。

15.根据14的方法，其特征在于Sm-Rif代谢漂变与：

-增代时间为约31分钟的S.tm疫苗株（i，p，LD₅₀小鼠为约10⁵（野生株约10¹）cfu），

-增代时间为约28分钟的S.ent疫苗株（i，p，LD₅₀小鼠为约10⁷（野生株约10⁵）cfu），

-增代时间为约31分钟的S.inf疫苗株，

-增代时间为约32分钟的S.ana疫苗株，

结合，用作小鸡/鸡优化减毒疫苗。

16.根据13-15的方法，其特征在于向Sm/Rif疫苗中掺入外膜标记，其对ciprofloxacin（氯霉素、强力霉素等）的敏感性增至4倍，同时排泄和在环境中的生存能力明显减小。

17.根据15或16的方法，其特征在于增加对ciprofloxacin的敏感性的标记通过诱变方法，或掺入野生株中或掺入Sm/Rif双标记疫苗株中，然后在0.5μg氯霉素/ml存在下进行常规青霉素筛选。

18.根据13-17的方法，其特征在于标记掺入的顺序是随意的。

19.根据10-18的方法，其特征在于无外膜标记的疫苗株用作疫苗。

20.增代时间为28-32分钟的沙门氏菌疫苗株。

21.根据20的沙门氏菌疫苗株，其为保藏号为8432、8433、8434、8435、9360、9361、9362和/或8441的疫苗株，以及增代时间为28-34分钟的它们的较高或较低减毒变异体。

22.根据20或21的疫苗株作为权利要求1或2的活疫苗用于口服免疫小鸡以及口服和经非胃肠免疫/加强免疫鸡抗沙门氏菌感染的用途。

第1项说明已知的沙门氏菌活疫苗株（见如EP 0263 528）用于制备特异的活疫苗的用途。已知的沙门氏菌活疫苗株包含外膜标记以及减毒标记（如营养缺陷型标记或stwd标记），使它们具有抗流行能力（减少宿主排泄及减小在环境中的存活率）。另外还使用了外膜标记，使疫苗株对大环内酯类抗生素敏化。该抗生素敏化迄今只用于选择适当的外膜突变体，即在疫苗株的制备中。根据本发明，第一次认识到构成外膜标记的疫苗株的大环内酯敏感性还可在使用该方法产生的疫苗株时作为安全机制起作用。如此设计该疫苗，使得在该疫苗引起另一宿主感染的情形下，可用大环内酯抗生素对感染宿主进行有效的治疗。仅通过选择其繁殖可经施用合理剂量大环内酯抗生素得以控制的疫苗株（带有外膜标记）制备疫苗，就可相当容易地达到此目的。

根据第1项以特异方式使用的已知沙门氏苗活疫苗株，由于它们的外膜标记而显示对大环内酯的敏感性。除对疏水性抗生素（大环内酯类如红霉素）的敏感性提高的外膜突变体外，还描述了其它外膜突变体（如Hancock，R.E.W.：Ann.Rev.Microbiol，1984，38，237-264），关于对亲水性、疏水性和多阳离子抗生素的敏感性，它们有时具有不同的通透性。迄今为止，这种外膜标记在细菌活疫苗的制备中不重要。

第2项第一次提出包括具有一种外膜标记的至少一种减毒活疫苗株而制备的沙门氏菌活疫苗，该外膜标记使疫苗株对除大环内酯类以外的特异的治疗有效抗生素的敏感性提高。因此，用于制备本发明的沙门氏菌活疫苗的疫苗株包括一种一般为其提供抗流行能力（切断传染链）及任选地对大环内酯类的敏感性，但无论如何提供对另一特异的治疗有效抗生素的高敏感性的外膜标记。使用选定的特异治疗有效抗生素可相当容易地检测到该疫苗株，所以具有适当外膜标记的疫苗株的制备并不会构成大问题。应认识到对于可能的要求治疗由该疫苗引起的意外传染的可能性，优选选择对所使用沙门氏菌血清型构成良好结果的这种抗生素。

另外，应认识到所选活疫苗株衍生自流行的血清型。

在3-9项中提出了第1和2项的本发明活疫苗的优选实施方案。

如上所述，活疫苗的减毒有各种可能性。一种可能性是将营养缺陷型标记（如asp）包括在疫苗株中。根据第3项，优选给疫苗株提供至少一种染色体抗生素抗性突变。染色体抗生素抗性基本由上述stwd标记构成。已证明使用选择的stwd标记及几种这样的标记的特异组合都可使疫苗株的减毒水平最优化适应水平。当为了疫苗株减毒而选择这种染色体抗生素抗性突变时，必须保证它们不排斥由外膜标记产生的对治疗有效抗生素的高敏性。因此，在开发疫苗株的过程中，首先确定哪一种治疗有效的抗生素将用于疫苗的可能处理。根据这一点，为疫苗减毒选择疫苗株和其染色体抗生素抗性突变。

根据本发明的另一优选实施方案，选择外膜标记使其为疫苗株提供（除抗流行能力和任选的大环内酯敏感性以外）对包括喹诺酮类、氯霉素类或四环素类抗生素的高敏性。特别优选为疫苗株提供对抗生素ciprofloxacin（现今对沙门氏菌最有效的抗生素）的高敏性的外膜标记。在制备后一种疫苗株时，为了减毒而提供代谢漂移突变，产生链霉素和/或利福霉素抗性特别有利。这些抗生素抗性不干扰疫苗株对抗生素ciprofloxacin的可能敏感性。

根据所期望的作用谱，本发明的沙门氏菌活疫苗可从O-类B（如鼠伤寒沙门氏菌）、D（如肠炎沙门氏菌）、C（如婴儿沙门氏菌）和E（如鸭沙门氏菌）中一种或几种不同血清型的疫苗株作为单、双、三或四疫苗。关于这一点，优选特别适合的如第8项所定义的疫苗。

上边已经提到的另一个问题是，由于不同的敏感性，必须为每种宿主提供具体适应的活疫苗。关于这一点，可参考已上市的鼠伤寒沙门氏菌疫苗“Zoosaloral Dessau”，在单次口服施用后可充分免疫小牛，但三次口服免疫后才能保护鸡抗腹膜内毒性感染（Linde，K.：Vaccine 1990，8，278-282）。关于对鼠伤寒沙门氏菌的敏感性，根据宿主种类，构成hierarchy小鼠＞小牛＞鸡。根据这一点，为了补偿低敏感性，小鸡和鸡的如鼠伤寒沙门氏菌疫苗株必须具有较小的减毒水平（与小鼠相比）。可假设其它沙门氏菌血清型相应地具有同样顺序。

现发现沙门氏菌活疫苗的增代时间与它们的减毒水平相关。特别是当疫苗株为了减毒而被提供了染色体抗性突变时，发生增代时间和减毒水平之间的这种相关。

增代时间和增毒水平之间的关系使得可以不经事先的动物试验就相对可靠地选择适于特异宿主的疫苗株。关于这一点，第9项提出了免疫小鸡和鸡的适当活疫苗，其由至少一种增代时间为约28-34分钟的减毒疫苗株制得。具有这种增代时间的疫苗株减毒水平较小（与小牛和小鼠的疫苗株相比），补偿了小鸡/鸡对如鼠伤寒沙门氏菌和其它血清型沙门氏菌的低敏感性。

如上所述，对宿主种小鸡/鸡的有效沙门氏菌疫苗特别感兴趣。迄今已保藏/出版的鼠伤寒沙门氏菌stwd突变体与该宿主种无直接关系。根据第8和9项，现提出了可为小鸡/鸡优化减毒，或已经优化减毒的疫苗。关于这一点，强调了疫苗株S.tm Nal 2/Rif 9/Rtt，它已为小鸡/鸡进行了最优化减毒。疫苗株S.tm Nal 2/Rif 9也是这样，它还没有进行用于该申请的保藏，但仍然对它做出评述。所引用的疫苗株，其增代时间为约32分钟。从这一事实已衍生出选择相同或其它血清型的其它最优化减毒株的“减毒当量增代时间”。然而在选择小鸡/鸡的适当疫苗株时，增代时间在28-34分钟之间。这种差异表明这样的事实：小鸡/鸡对不同的株和每种血清型毒性的株依赖性差异有不同的敏感性。通过少数实验系列，可从预选的增代时间为28-34分钟的疫苗株中选择对小鸡/鸡最优化减毒的那些疫苗株。有利的是，这至少使预选中所要求的动物实验减少。

另外，关于可能宿主小鸡/鸡，如本发明所提出的，使用含有对特异治疗有效抗生素高敏性的疫菌株的沙门氏菌活疫苗是特别令人感兴趣的。鸡与其它宿主种如人、小牛或小猪相比寿命较短，一般它们在比较短的培养时间以后，就被屠杀并做为冷冻或新鲜肉出卖。因为接种是在过去不很长的时间内进行的，可认为在屠杀时鸡体内仍然存在活的沙门氏菌疫苗株细菌。然后它们可能进入环境。少量这种细菌的正常菌群是不明显的。在这点上几乎可以排除传染的危险。然而，个别免疫系统减弱的危险病人（如带有HIV病毒的病人）可被感染并出现临床症状。特别是关于这些人，要求由疫苗株引起的感染可被迅速控制而不产生任何问题。关于这一点，排除任何理论预测，掺入作为安全和治疗标记的对治疗有效抗生素的敏感性是合理的解决方法。

这种安全和治疗标记的原形是所谓的ssq标记。带有ssq标记的疫苗株具有对喹诺酮类，特别是对ciprofloxacin（目前对沙门氏菌最有效的抗生素）的高敏性。ssq标记也象上述的hst、rbt和rtt突变一样，是一种外膜突变，因此，也具有或多或少的有特色的抗流行能力-取决于其胆汁和阴离子洗涤剂的耐受性和敏感性。

本发明不仅涉及特别安全的活疫苗的制备，另一个目的是提供制备活疫苗的方法，几乎不用任何动物实验制得对特异宿主优化减毒的活疫苗。

该目的通过包括第10项中所示特征的方法来达到。该方法的原则是基于疫苗株的减毒（特别是掺入stwd标记）导致其增代时间延长（与野生株相比）。上述已经提到从延长的增代时间可得出关于疫苗株减毒水平的结论。因此，根据本发明的方法，在一次试验（如动物试验）中就足以确定适合宿主的疫苗株的增代时间。如此确定的延长的增代时间可作为进一步选择疫苗株（相同血清型）的大致数据，或作为减毒当量转化到同属的其它血清型。

为了制备最适于小鸡/鸡的疫苗，例如选择这样的疫苗株，其增代时间与野生株（22分钟）相比延长到了约28-34分钟。所使用的疫苗株例如可从已具有链霉素（Sm）或萘啶酮酸（Nal）标记的野生株得到。这样，使增代时间从22分钟延长到25-29分钟。然后，作为延长增代时间的另一标记，加入了利福霉素（Rif）标记。

本发明方法的其它有利实施方案在第14-19项中提出。这些项主要概括了关于选择血清型，用于减毒的stwd标记、和掺入标记的顺序的不同可能性。

根据本方法的主要特征，这样制备疫苗：

-第一步，为了制备低或中等减毒的菌株，分离具有特异抗生素抗性且显示增代时间与沙门氏菌野生株相比延长了约3-6分钟的表型的stwd突变体，

-第二步，从这些低或中等减毒的第一标记株中再分离对抗生素抗性的另一表型的stwd突变体，增代时间再一次延长了3-6分钟，从而得到一系列候选疫苗株，其延长了的增代时间等级为约28到34分钟（野生株约22分钟）-在小鼠模型中对于S.tm（因为LD₅₀的log值与（延长的）增代时间线性相关），它相当于LD₅₀值等级为约10⁵-10⁷（野生株约10¹）cfu-再用该系列的单一疫苗10⁹cfu一次口服免疫≤36小时龄小鸡，2周后用10⁶cfu的野生株口服感染免疫动物，最后根据“增代时间的最大可能延长/减毒水平和野生株排泄的最优化减低”这一关系得到优选的增代时间为约32分钟的S.tm Nal2/Rif 9菌株作为最佳原型疫苗株，以确定同一血清型和对小鼠仅有中等或缺少毒性的血清型的“减毒当量（延长的）增代时间”，

-第三步，为了优化疫苗株，向通过stwd突变减毒的双标记疫苗株中掺入“ssq安全和治疗”标记，该安全和治疗标记大约使其对ciprofloxacin（氯霉素、强力霉素等）的敏感性增至4倍，同时非显著性地减低排泄和在环境中的生存能力。

所述顺序是主观随意的，还可用毒性物质抗性表型（DD-WP235 828）。

另外，本发明还涉及第20项的增代时间为28-32分钟的特异沙门氏菌疫苗株，以及这些疫苗株的具有或较高或较低的减毒水平且增代时间为28-34分钟的变异体。最后，第22项涉及这种疫苗株口服免疫小鸡以及口服及非胃肠道免疫鸡抗沙门氏菌感染的用途。

在以上各项和下述实施例中提及的疫苗株（有或无ssq标记）以及已保藏的疫苗株是可制得的具有分级减毒水平的所有候选疫苗株的实例。它们适于按已知繁殖方法制备免疫原性活疫苗，特别是用于小鸡/鸡的活疫苗。关于特别说明的带有ssq标记的疫苗（保藏号为8433、8435、9362、8434、8441、8432），指明其增代时间为约32分钟。另一些带有ssq标记的具体菌标的增代时间为约28分钟（保藏号9361）和约30分钟（保藏号9360）。对增代时间的这种说明不应理解为一种限制。考虑到毒性的株-依赖性差异（侵袭能力/菌落形成活性），增代时间28-34分钟也可能作为减毒当量。

下表中列出了不同血清型的优选沙门氏菌疫苗株。

*）这些微生物保芷在

DSM-Deutsche Sammlung von Mikro-

organismen und Zellkulturen GmbH

Mascheroder Weg 1B

D-38124 Braunschweig

以下通过几个实施例详细描述本发明。

实施例

材料和方法

所用菌株

-野生株

·鼠伤寒沙门氏菌（S.tm）415（Metschnikov-Institute，Moscow）

i.p.LD₅₀小鼠≤10¹cfu，增代时间≈22分钟。

·肠炎沙门氏菌（S.ent）318（Prof.Selbitz，Leipzig大学）

i.p.LD₅₀小鼠≈10⁵cfu，增代时间≈22分钟。

·婴儿沙门氏菌（S.inf）（Dr.Beer，Veterinarunter-Suchungsamt Chemnitz）增代时间≈22分钟。

·鸭沙门氏菌（S.ana）（Dr.Beer，Veterinarunter-Suchungamt Chemnitz）增代时间≈22分钟。

-用于检测免疫小鸡/鸡的排泄减低的，具有中性萘啶酮酸和链霉素抗生的野生株

·S.tm Nal/Sm，增代时间≈22.5分钟

·S.ent Nal/Sm，增代时间≈22.5分钟

·S.inf Nal/Sm，增代时间≈22.5分钟

·S.ana Nal/Sm，增代时间≈22.5分钟

-例如具有较低（或较高）减毒水平/相应地或少或多的延长了增代时间的其它双或三标记突变体的野生株

·S.tm Ssq/Sm 60/Rif 42，增代时间≈31分钟。

试验室号 4242；保藏号DSM 8433

·S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12，增代时间≈32分钟。

试验室号 4266；保藏号DSM 8435

·S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k，增代时间≈32分钟。

试验室号 4298；保藏号DSM 9362

·S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g，增代时间≈28分钟。

试验室号 4297；保藏号DSM 9361

·S.ent Ssq/Sm 24/Rif 3，增代时间≈30分钟

试验室号 4296；保藏号DSM 9360

·S.inf Ssq/Sm 153/Rif 7，增代时间≈31分钟

试验室号 4289；保藏号DSM 8434

·S.ana Ssq/Sm 81/Rif 21，增代时间≈32分钟

试验室号 4279；保藏号DSM 8441

·S.tm Nal 2/Rif 9/Rtt，增代时间≈32分钟

试验室号 4223；保藏号DSM 8432

作为为确定“减毒当量（延长的）增代时间”的原型株（对小鸡/鸡优化减毒）。

培养基

-营养琼酯（SIFIN，Berlin-Weiβensee）

-胰蛋白磷酸盐培养液（Difco，U.S.A）

抗生素

-萘啶酮酸（CHINOIN，Budapest）

野生株MHK 6.2μg/ml

-链霉素（Jenapharm）

野生株MHK 6.2μg/ml

-利福霉素（UBM，Bacarest）

野生株MHK 12.5μg/ml

-Ciprofloxacin（Bayer）

野生株MHK 0.5μg/ml

-氯霉素（Berlin-Chiemie）

野生株MHK 2.0μg/ml

-强力霉素（Jenapharm）

野生株MHK 4.0μg/ml

-红霉素（Abbott）

野生株MHK 60.0μg/ml。

动物实验和保存条件

将来自不同养殖厂的产棕色蛋的母鸡的小鸡保持在笼中5-10分钟，用火鸡饲料以及加锂水喂养动物。

口服免疫

在孵育后36小时或（为了比较及确定最佳免疫年龄）在它们出生的第4天，每组10只小鸡，以单剂量10⁹cfu，部分10⁸cfu的具体免疫株从口施加到它们食管中。实际条件下的免疫还可能通过饮水进行（禁水4小时，然后在3小时内给以2ml/小鸡的饮水）。

口服感染

口服免疫后2-4周，用吸液管从口给小鸡以10⁶cfu（或10⁷cfu）的具体中性标记的同源野生株。

检测下列菌株的排泄

-疫苗株S.tm Ssq/sm 60/Rif 42，S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12，S.inf Ssq/Sm 153/Rif 7和S.ana Ssq/Sm 81/Rif 21：

含100μg利福霉素和200μg链霉素/ml的营养基；

-带或不带rtt标记的疫苗株S.tm Nal/2/Rif 9：

含100μg利福霉素和12.5μg萘啶酮酸/ml的营养基；

-中性Nal/Sm标记的野生株：

含100μg萘啶酮酸和200μg链霉素的营养基。

每组小鸡每天的检查，将5个新鲜粪样各悬浮在2ml生理氯化钠溶液中，再制备10^-1到10^-4的稀释液。

-定量测定：用刮勺将0.1ml原始悬液和稀释液施加到含1%乳糖和蔗糖、0.015%的溴百里酚蓝的营养琼脂上（测定大肠杆菌/肠杆菌的数目）。与此平行，将两者都施加到含具体抗生素的相同培养基上。为了定量测定与对照相比在免疫小鸡中的排泄和沙门氏菌菌落形成的减小，以千分数测定了沙门氏菌菌落数与肠杆菌菌落数之比，-定性测定：将抗生素肉汤加到剩余的原始悬液中。37℃孵育24小时后，将沙门氏菌转移到含具体抗生素添加剂的营养琼脂中。

对生长的沙门氏菌进行血清学和生化学验证，并经测定标记来验证。

作为与对照相比免疫小鸡中排泄和沙门氏菌菌落形成减少的定量测定，以千分数测定了沙门氏菌菌落数与肠杆菌菌落数之比。

实施例1

S.tm：为确定相同血清型菌株和对小鼠仅有中等（S.ent）或缺乏（S.inf和S.ana）毒性的血清型的菌株的“减毒当量（延长）增代时间”，分离原型疫苗株，为此，分离了自发染色体抗生素抗性克隆作为具有约29-34分钟的分级延长增代时间（野生株22分钟）的（Nal-twd单一和）Nal/Rif-stwd双标记株。

用刮勺将10⁹（和10¹⁰）cfu的野生株转移到含100μg（或分两步先50μg再400μg）萘啶酮酸/ml的营养基上，并37℃孵育约2天。将抗性克隆转移到营养琼脂上，为检验所得抗性，测定或多或少减小了的消光值（Spekol，样品管Zeiss-Jena，波长650nm，从细菌计数10⁷cfu开始，37℃水溶振荡培养3小时）。看似适当的克隆的增代时间用Abbott MS-26试验系统测定。如上所述，在含400μg利福霉素/ml的营养琼脂上，从增代时间为28分钟的克隆Nal 2中得到了抗性克隆。测定了这些抗性克隆的增代时间，用分级增代时间为约29-34分钟的Nal 2/Rif克隆确定了“减毒当量增代时间”的大致数值（见实施例3）。

实施例2

在17-25天龄小鸡中检测中性Nal/Sm标记的S.tm、S.ent、S.inf和S.ana野生株的所得菌落形成活性。

17-25天龄小鸡通过吸液管口服接受10⁶（或10⁷）cfu的中性标记的野生株。在10-15天期间，与肠杆菌数相比测定了定量的沙门氏菌菌落形成密度。

在选定的感染模型中（剂量为10⁶-10⁷cfu），口服感染后，在24小时后产生高菌计数的中性标记野生株的排泄，或在第3天到第6天粪样中沙门氏菌计数逐渐达到它们的最大值（最大值为总肠杆菌落的50‰）。8-10天后，沙门氏菌菌落降至肠杆菌菌落的1.0-0.1‰，并保持在此范围内较长一段时间。

该菌落形成动力学说明Nal/Sm中性标记的野生株适于测定免疫小鸡中减低的野生菌落形成。

实施例3

为了测定相同血清型菌株和对小鼠仅有中等毒性或缺少毒性的血清型菌株的“减毒当量（延长）增代时间”，通过最大可能延长传代时间/减毒水平及野生株排泄的最优减低的关系，确定了具有最适于小鸡/鸡的延长增代时间/减毒水平的S.tm Nal 2/Rif原型疫苗株。

将≤36小时龄的小鸡用10⁹cfu的分级增代时间为29-34分钟的S.tm系列双标记株中的不同菌株口服免疫，2周后用10⁶cfu野生株口服感染。与此平行，口服感染同龄对照小鸡。

与对照组相比，接受分级增代时间为29-34分钟的疫苗株的免疫小鸡，显示野生株的排泄明显减低（以肠杆菌菌落形成密度的千分数表示），特别是在口服免疫后5-10天后，偏差（随时间减小）在10¹-10²范围内。口服免疫后6-10天，免疫小鸡中沙门氏菌菌落形成密度与对照接近直线（肠杆菌计数的0.1‰范围内）。但在个别例子中，甚至在第10天后，免疫小鸡可显示减小的排泄在一个log级范围内。

对于增代时间≥33分钟的疫苗株，对野生株排泄的降低明显少，其中与对照的区别一般不超过10倍。基于“最大可能延长增代时间/减毒水平并仍优化减低野生株排泄”这一关系，增代时间为约32分钟的S.tm Nal 2/Rif 9（i.p.LD₅₀小鼠为约10⁶cfu）被确定为原型疫苗株，其（延长）增代时间约32分钟被用作“减毒当量”的大致数值。

实施例4

识别/检测鼠伤寒沙门氏菌克隆S.tm Nal 2/Rif 9（i.p.LD₅₀小鼠为约10⁶（野生株为约10¹）cfu；增代时间从22分钟延长到作为减毒当量的32分钟），对小鸡/鸡优化减毒，作为通过i.p和口服免疫产生对抗毒性感染的当量保护效果的优选疫苗株；（将这些规则相应地转用在另外的“肠炎”沙门氏菌）：

a.通过测定小鸡和小鼠的S.tm野生株和S.tm Nal 2/Rif 9疫苗株的i.p.LD₅₀率，对小鸡/鸡和小鼠对鼠伤寒沙门氏菌的极端差异的敏感性的初步试验。

对小鼠和两天龄小鸡，S.tm野生株和S.tm Nal 2/Rif 9疫苗株的不同i.p.LD₅₀率，以及对17天龄小鸡野生株的i.p.LD₅₀率示于表1中。

表1

S.tm野生株和S.tm Nal 2/Rif 9疫苗株：

小鼠和小鸡的对比i.p.LD₅₀率

S.tm 2天龄鸡 17天龄鸡 ICR小鼠

(cfu) (cfu) (cfu)

野生株 10⁶10⁸10¹

Nal 2/Rif9 10⁷n.t. 10⁶

表1的小鸡和小鼠的LD₅₀率说明小鸡对S.tm的敏感性较小，必须由疫苗株的低减毒水平来补偿。

b.识别对小鸡/鸡优化适应的鼠伤寒沙门氏菌疫苗株（有或无作为优化疫苗株的外膜突变的rtt标记），通过i.p和口服免疫可产生抗毒性感染的当量保护作用。

抗LD₇₅毒性感染的当量保护作用（两周后进行），可通过-在孵化后第2天用疫苗株S.tm Nal 2/Rif 9和S.tm Pur株（i.p.LD₅₀小鼠10^7.5cfu）和对小鸡过度减毒的Zoosaloral（i.p.LD₅₀10^8.2cfu）单次i.p.免疫：见表2；

-在孵化后≤36小时或第4天用，用S.tm Nal 2/Rif 9；S.tm Nal 2/Rif 9/Rtt；以及对小鸡过度减毒的小牛疫苗Zoosaloral单次口服免疫：见表3；

得到，作为“优化减毒”的标准。

表2

在第2天用10⁶cfu的具有不同减毒水平的突变体单次i.p.免疫获得抗毒性感染的免疫；在第16天用3×10⁸cfu的野生株侵袭（三次试验的平均值）。

i.p免疫:10⁶cfu,i.p.侵袭

S.tm疫苗株/试验株死亡率(%)

Nal 2/Rif 9 25

Pur^-81 25

Zoosaloral 30

对照 75

表3

用10⁹cfu的疫苗株和对小鸡过度减毒的Zoosaloral单次口服免疫，获得抗毒性感染的免疫；在第16天用i.p3×10⁸cfu的S.tm野生株侵袭（4次试验的平均值）。

口服免疫,i.p侵袭

第2天第4天

S.tm疫苗株/试验株 cfu 死亡率(%)

10⁹23 35

Nal 2/Rif 9

10⁸27 n.t.

10⁹24 40

Nal 2/Rif 9/Rtt

10⁸26 n.t.

10⁹42 60

Zoosaloral

10⁸47 65

对照 75

如表2中所示，用所有疫苗株单次i.p免疫，使非生理的毒性感染死亡率从约75%降至≤30%。

如表3中所示，这种死亡率的降低-与Zoosaloral和增代时间≥33分钟且i.p.LD₅₀≥10^6.5cfu代谢漂移突变体相反-也可用疫苗株S.tm 2/Rif 9疫苗株（有或无rtt标记）单次口服免疫得到，因此，该疫苗株对小鸡已优化减毒。

另外，表3表明：

-小牛疫苗Zoocaloral的过度减毒，

-在第4天对抗毒性感染的保护性有效免疫较小。可假定，这是由于在第4天（龄）菌落形成抗性较高的原因，这应影响疫苗株的易位和通透性。

实施例5

S.tm.、S.ent.、S.inf和S.ana：分离通过“减毒当量（延长）增代时间”对鸡优化减毒的、作为（单和）双标记疫苗株的自发抗生素抗生克隆（也见实施例1）

用刮勺将10⁹-10¹⁰cfu的野生株转移到含400μg链霉素/ml的营养琼脂上，37℃孵育约2天。将抗性克隆转移到营养琼脂上，为检验所得抗性，在初步试验中测定与野生株相比或多或少减低的消光值（Spekol，样品管Zeiss-Jena，波长650nm，起始细菌计数10⁷cfu，37℃水浴中振荡培养3小时）（见实施例1），似乎合适的克隆的增代时间通过Abbott MS-2试验系统测定。如上所述，在第二步中，从增代时间延长了约3-6分钟的克隆中得到了利福霉素抗性克隆（含400μg利福霉素/ml的营养琼脂），测定了其增代时间，增代时间为约28-32分钟的Sm/Rif克隆优选作为双标记疫苗株。（优选使用Sm-stwd减毒而不是Nal-stwd减毒，因为作为外膜突变的ssq标记（见实施例6）-如在Sm/Rif疫苗株中（避开作为解旋酶突变的Nal-stwd减毒）-也可以提供对当今最有效的抗生素cipro-floxacin的高敏性。）

实施例6

向野生和疫苗株中再掺入ssq（“安全和治疗”）标记，优化疫苗株并提高其可接受性。

将新鲜培养物悬浮在PBS中，用100μg/ml的N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNG，21MET，Jena）处理达存活率10%。然后将其在含0.4μg氯霉素的营养肉汤中37℃孵育2小时，并按常规方法用1000IU青霉素/ml处理。在含0.4μg氯霉素（0.01μg ciprofloxacin、1.0μg强力霉素）/ml的营养琼脂上通过印痕（staming）法得到了不生长的克隆。作为ssq（对喹诺酮类有高敏性）株，这种克隆被确定及用作安全和治疗标记物，它优化疫苗株并提高其可接受性，它们

-在含0.4μg氯霉素、0.01μg ciprofloxacin或1.0μg强力霉素（以及常用的30μg红霉素）/ml的营养琼脂上不生长，

-显示期望的回复突变率≤10^-7。

外膜突变的回复突变率可在含20或30μg红霉素/ml的营养琼脂上较好地测定，因为当细菌计数高时，在高浓度ciprofloxacin、氯霉素和强力霉素下，休止（rest）生长转向二级生长。

适合的疫苗株具有ssq标记，并且经诱变处理不发生或仅有微小的共突变引起的增代时间延长/减毒的克隆。

实施例7

通过检测代谢漂移（stwd）单标记突变体和小鸡的双标记疫苗株的所得或残余的侵袭能力，鉴别对小鸡/鸡优化减毒的鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、婴儿沙门氏菌和鸭沙门氏菌疫苗株。

≤36小时龄的小鸡分别用10⁹cfu野生株、stwd单标记突变体和stwd双标记突变体口服感染。5-8天后处死小鸡，无菌条件下取出肝脏，匀浆，转移到营养琼脂上，剩余物与营养肉汤混合。生长的菌落和培养物进行O类鉴别和标记测定。

对于鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌，5天后细菌计数/g肝为约10³cfu，8天后为约10²cfu。与此相反，对婴儿沙门氏菌和鸭沙门氏菌细菌计数的定量测定在一较宽广范围内约10¹到≤10²cfu，8天后常只能通过繁殖才能检测到。婴儿沙门氏菌和鸭沙门氏菌的这些低细菌计数/克肝，显然与U.Methner的观察相关（博士论文，Leipzig大学，兽医系，1991）-婴儿沙门氏菌对小鸡的侵袭力小。

一般所得优选疫苗株（和单标记突变体）的侵袭能力-从培养后的菌落数测得-远没有达到同源野生株的数值，很明显这对接种成功是很重要的（Barrow P.A.等，Res. Microbiol.，1990，141，pp 851-853）。

实施例8

≤36小时龄小鸡口服免疫后和5天龄小鸡口服免疫后，S.tm Nal 2/Rif 9疫苗株（有或无rtt标记）的排泄百分比和持续时间的测定。

根据小鸡年龄和口服免疫，有或无rtt标记的疫苗株的、试验粪样中的百分比和最大可检测排泄持续时间示于图1中。

图1：

用10⁹cfu的无（·-）和有rtt标记（▲-）的S.tm Nal 2/Rif 9给≤36小时龄小鸡单次口服免疫以及用S.tm Nal 2/Rif 9（个别数据没有标出（一））在第4天口服免疫后，疫苗株的排泄率（繁殖后阳性样品的百分数）和持续时间（最后的阳性结果，检测限为约10个菌/克粪）。4到5次试验的平均值。

图1中显示下列事实：

-孵育后≤36小时免疫，测得S.tm Nal 2/Rif 9排泄32天。掺入rtt标记后，免疫三周后很少能检测到疫苗株。

-在第4天免疫，18天后仅偶而检测到S.tm Nal2/Rif 9（无rtt标记），明显由厌氧细菌引起的已存在的菌落形成抗性所致。

-阳性累积培养物的百分率与此类似。对于在≤36小时口服免疫，在约90%样品中还可检测到S.tm Nal 2/Rif 9；对于已用rtt标记优化的疫苗株，仅约40%的粪样仍为阳性。

测定了优选疫苗株S.tm Ssq/Sm 60/Rif 42、S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g、S.inf Sqq/Sm 153/Rif 7和S.ana Ssq/Sm 81/Rif 21的菌落形成动力学，其中孵化后≤36小时口服施用10⁹cfu，测定了两周时间内的每种沙门氏疫苗株在粪样的肠杆菌群中的比例，其中优选疫苗株（见上文）显示与疫苗株S.tm Nal 2/Rif 9/Rtt可比的排泄行为。

实施例9

在免疫小鸡中与对照相比，同源Nal/Sm中性标记野生株定量排泄的降低。

≤36小时龄小鸡接受疫苗株S.tm Nal 12/Rif 9/Rtt、S.tm Ssq/Sm 60/Rif 42、S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12、S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k、S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g、S.ent Ssq/Sm 24/Rif 3、S.inf Ssq/Sm 153/Rif 7和S.ana Ssq/Sm 81/Rif 21单价口服免疫，分别用10⁶（部分为10⁷）cfu的相应同源野生株在第17天感染，同龄小鸡作平行对照。

与对照组相比，与用S.tm原型疫苗株Nal 2/Rif 9所得结果相符，免疫小鸡显示野生株排泄明显减产，特别是在口服攻击后头5-10天内（从肠杆菌菌落形成密度测得，千分数）。偏差（随时间减小）在达10²范围内。从口服攻击后第6-10天，在免疫小鸡中沙门氏菌菌落形成密度与对照组接近直线（在肠肝菌计数的0.1‰范围内）。但在个别例子中，甚至第10天后免疫小鸡显示减低的排泄在一个log级范围内。

几乎不能期望完全消除个体感染动物中的沙门氏菌，因为鸡沙门氏菌、雏沙门氏菌这些病原体在小鸡中的表现行为象“正常菌群”。就中期而言，免疫小鸡/鸡的大大减低排泄与卫生措施结合应产生无沙门氏菌的鸡原种。

实施例10

对洗涤剂的敏感性增加

疫苗株S.tm Ssq/Sm 60/Rif 42、S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12、S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k、S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g、S.ent Ssq/Sm 24/Rif 3、S.inf Ssq/Sm 153/Rif 7、S.ana Ssq/Sm 81/Rif 21、S.tm Nal 2/Rif 9/Rtt与野生株相比，对阴离子洗涤剂，特别对十二烷基硫酸钠（SDS）的敏感性增加。这些疫苗株在浓度为0.5mg SDS/ml的适当营养琼脂（大致不含蛋白质）上不生长，野生株在5mg SDS/ml的营养琼脂上还生长。

将疫苗株悬浮在氯化钠生理盐水中，室温下30分钟内溶菌达约90%，而野生株的溶菌率仅为约10%。

从这些观察可以得出这样的结论，敏感性高的疫苗株，在环境中的生存能力减低，特别是在采取了卫生清洁措施后。

实施例11

从野生株中分离疫苗株

按如下方法将以下菌株与野生株分离：

-通过它们对100μg利福霉素和200μg链霉素/ml的营养琼脂的抗性以及在含0.4μg氯霉素（或分别含0.01μg ciprofloxacin、1.0μg强力霉素和30μg红霉素）/ml的营养琼脂上不生长，得到了下列疫苗株：

-S.tm Ssq/Sm 60/Rif 42，S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12，

S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k，S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g，

S.ent Ssq/Sm 24/Rif 3，S.inf Ssq/Sm 153/Rif 7和

S.ana Ssq/Sm 81/Rif 21

-利用其对100μg利福霉素和12.5μg萘啶酮酸^*/ml的营养琼脂的抗性以及在含30μg红霉素/ml的营养琼脂上不生长，得到了S.tm Nal 2/Rif 9/Rtt。

*与原始Nal 2/Rif 9株相比，rtt株对萘啶酮酸的抗性减低是rtt突变（掺入Nal 2/Rif 9中）的结果，它导致外膜通透性变化。

实施例12

疫苗株的大量培养、制备和应用

为了生产活疫苗，（无ssq标记的双标记疫苗株或）带ssq标记的三标记疫苗株在适当的完全培养基中孵育（液体培养），直到对数期结束。将细菌悬液与传统的稳定剂混合并冷冻干燥。

按此方法得到的疫苗株通常施用于≤36小时龄的小鸡，单次剂量为10⁸-10⁹cfu。成年鸡通常接受10⁹cfu口服单次免疫/加强免疫，或在产蛋期前经非胃肠道接受约10⁸cfu。

Claims

1、包含大环内酯抗生素敏感性标记(外膜标记)的至少一种减毒免疫原性沙门氏菌活疫苗株的用途，它用于制备对特异宿主的活疫苗，在由该特异宿主引起的另一宿主感染的情况下，该活疫苗有助于用大环内酯类抗生素对被感染动物进行有效的治疗。

2、从至少一种减毒的免疫原性活疫苗株制得的沙门氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗株具有一种外膜标记，该标记除任选对大环内酯类抗生素具有敏感性外，导致疫苗株对除大环内酯类抗生素外的特异的治疗有效抗生素的敏感性提高。

3、根据权利要求1或2的活疫苗，其特征在于该疫苗株包括用于减毒的至少一种染色体抗生素抗生突变，但不排斥对治疗有效的抗生素的敏感性提高。

4、根据权利要求2或3的活疫苗，其特征在于所述外膜标记使疫苗株对喹诺酮类、氯霉素类或四环素类抗生素的敏感性提高。

5、根据权利要求4的活疫苗，其特征在于所述外膜标记使疫苗株对抗生素ciprofloxacin的敏感性提高。

6、根据权利要求1-5的活疫苗，其特征在于疫苗株含有用于减毒的代谢漂移突变，包括链霉素抗性和/或利福霉素抗性。

7、根据权利要求1-6的活疫苗，其特征在于它包括至少一种血清型O-类B（如鼠伤寒沙门氏菌）、D（如肠炎沙门氏菌）、C（如婴儿沙门氏菌）和E（如鸭沙门氏菌）的疫苗株作为单、双、三或四疫苗。

8、根据权利要求6的活疫苗，其特征在于

-单疫苗由疫苗株S.tm Ssq/Sm 60/Rif 42（No.4242；保藏号DSM 8433）或S.tm Nal 2/Rif 9/Rtt（No.4223；保藏号DSM 8432）或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12（No. 4266；保藏号DSM 8435）或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k（No.4298；保藏号DSM 9362）或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g（No.4297；保藏号DSM 9361）或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 3（No.4296；保藏号DSM 9360）组成，

-双疫苗由上述一种S.tm疫苗株和S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 3组成，

-三或四疫苗由上述S.tm疫苗株之一，S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12k或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 12g或S.ent Ssq/Sm 24/Rif 3，S.ent Ssq/Sm 153/Rif（No.4298；保藏号DSM 8434）和/或S.ana Ssq/Sm 81/Rif 21（No.4279；保藏号DSM 8441）组成。

9、用于口服免疫小鸡以及口服或经非胃肠道免疫/加强免疫鸡以抗沙门氏菌感染的活疫苗，该活疫苗是从至少一种减毒的免疫原性疫苗株制得的，特别是根据权利要求1-8之一的活疫苗，其特征在于选择增代时间为约28-34分钟的疫苗株用于制备活疫苗。

10、沙门氏菌活疫苗的生产方法，该活疫苗的减毒水平被优化适合于宿主，并且从至少一种减毒的免疫原性沙门氏菌活疫苗株制得，其特征在于具有适于宿主的延长的增代时间的疫苗株用作减毒当量，其中适合于宿主（血清型）的疫苗株的具体延长的增代时间是在一次实验中确定的。

11、根据权利要求10的方法，其特征在于在初步试验中适于宿主的延长的增代时间是如此测定的：从一系列分级延长增代时间开始，根据最大可能减毒水平/延长的增代时间和野生株排泄的优化减低之间的关系选择适当的疫苗株，任选地将其延长的增代时间作为减毒当量转用到同属其它血清型。

12、根据权利要求10或11的优化适于小鸡或鸡的疫苗的制备方法，其特征在于选择疫苗株，其传代时间与野生株相比从约22分钟延长到了约28-34分钟。

13、根据权利要求12的方法，其特征在于所用疫苗株得自野生株，首先提供给野生株链霉素（Sm）或萘啶酮酸标记，使增代时间从22分钟延长到25-29分钟，然后再提供利福霉素（Rif）标记，进一步延长增代时间，分离作为增代时间为28-34分钟的适当疫苗株的克隆，再以已知方式制备疫苗如从形成的疫苗株中选择疫苗株来制备。

14、根据权利要求10-13的方法，其特征在于如鼠伤寒沙门氏菌（S.tm）、肠炎沙门氏菌（S.ent）、婴儿沙门氏菌（S.inf）和鸭沙门氏菌（S.ana）用作沙门氏菌血清型。

15、根据权利要求14的方法，其特征在于Sm-Rif代谢漂变与：

-增代时间为约31分钟的S.inf疫苗株，

-增代时间为约32分钟的S.ana疫苗株，

结合，用作小鸡/鸡优化减毒疫苗。

16、根据权利要求13-15的方法，其特征在于向Sm/Rif疫苗中掺入外膜标记，其对ciprofloxacin（氯霉素、强力霉素等）的敏感性增至4倍，同时排泄和在环境中的生存能力明显减小。

17、根据权利要求15或16的方法，其特征在于增加对ciprofloxacin的敏感性的标记通过诱变方法，或掺入野生株中或掺入Sm/Rif双标记疫苗株中，然后在0.5μg氯霉素/ml存在下进行常规青霉素筛选。

18、根据权利要求13-17的方法，其特征在于标记掺入的顺序是随意的。

19、根据权利要求10-18的方法，其特征在于无外膜标记的疫苗株用作疫苗。

20、增代时间为28-32分钟的沙门氏菌疫苗株。

21、根据权利要求20的沙门氏菌疫苗株，其为保藏号为8432、8433、8434、8435、9360、9361、9362和/或8441的疫苗株，以及增代时间为28-34分钟的它们的较高或较低减毒变异体。

22、根据权利要求20或21的疫苗株作为权利要求1或2的活疫苗用于口服免疫小鸡以及口服和经非胃肠免疫/加强免疫鸡抗沙门氏菌感染的用途。