KR101566376B1 - 신규 마이코플라즈마 시노비에 균주 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 닭에서 전염성 활막염과 호흡기 증상을 유발하는 주요 병원성 세균인 마이코플라즈마 시노비에(Mycoplasma synoviae) 국내 분리주에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 국내 사육 닭에서 분리되고, 높은 전염성 및 면역원성을 갖는 M. synoviae 분리주 중 M. synoviae MS-09-AR 백신주(기탁번호 : KCTC12342BP)에 관한 것이다.

Description

신규 마이코플라즈마 시노비에 균주{New strain of Mycoplasma synoviae}
본 발명은 닭에서 전염성 활막염과 호흡기 증상을 유발하는 주요 병원성 세균인 마이코플라즈마 시노비에(Mycoplasma synoviae) 국내 분리주에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 국내 사육 닭에서 분리되고, 높은 전염성 및 면역원성을 갖는 M. synoviae 분리주 중 M. synoviae MS-09-AR 백신주(기탁번호 : KCTC12342BP)에 관한 것이다.
Mycoplasma gallisepticum(MG), Mycoplasma synoviae(MS)는 닭 호흡기로 감염되어 산란율 저하, 기낭염, 전염성 활막염 등을 일으키고 다른 호흡기성 질병[뉴캣슬병(Newcastle disease; ND), 전염성기관지염(infectious bronchitis; IB), 조류 뉴모바이러스, 대장균] 등에 쉽게 감염될 수 있는 소인을 제공한다. M. synoviae 등에 의한 닭마이코플라즈마병은 국내 양계산업에 만연되어 있으며 만성적으로 진행되면서 난질의 저하, 계태아의 폐사율 증가, 유약한 병아리 생산량의 증가 등의 생산성 저하에 밀접한 세균성 질병으로서 양계농가의 경제적 손실을 야기한다. 이러한 마이코플라즈마균은 난계대 전염에 의하여 감염 성계에서 후대 병아리로 전달되는 수직전파와 개체 및 계군간의 수평전파가 모두 가능한 병원체이다. 현재 국내 종계군과 실용계군에서도 감염율이 매우 높은 것으로 확인되고 있으며, 국내외적으로 감염 종계군의 도태를 통한 종계군의 청정화를 위해 많은 노력을 기울이고 있다. 그러나, 국내와 같이 높은 감염율, 경제적인 비용 문제 등으로 인해 광범위한 도태정책을 펼 수 없는 나라는 효과적인 예방법에 대한 관심이 많다.
외국의 경우, 일부 국가에서 M. synoviae 사균 및 생균백신이 개발 또는 도입되어 사용되고 있으나, 현재 국내에서 M. synoviae 감염을 막기 위한 예방약이 없으며, 야외 감염의 진단에 사용하는 항원의 생산에는 국내 유행하는 균주가 아닌 외국 표준주를 이용하고 있다. 따라서 국내 계군의 마이코플라즈마병 감염의 보다 정확한 진단과 효과적인 예방을 위해서는 국내 유행 균주를 이용한 진단용 항원 생산과 예방약 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 현재 국내 양계에 감염되어 있는 M. synoviae 균주들을 분리동정하고 이 분리주들의 병원성과 유전적 특성을 비교분석을 거듭한 결과, 상기 새로운 마이코플라즈마 시노비에 균주 MS-09-AR 이 닭마이코플라즈마병 진단용 항원 성분 및 예방약 조성물로서 탁월한 효과를 나타냄을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 국내 양계 감염 균주의 진단 및 백신 제조에 유용한 종래 외국 표준주와 유전적으로 구별되는 새로운 M. synoviaee 균주를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KCTC12342BP의 마이코플라즈마 시노비에 균주를 제공한다.
본 발명에 의한 신규한 마이코플라즈마 시노비에 MS-09-AR 균주는 마이코플라즈마 시노비에의 야외 감염계군의 검색을 위한 진단용 항원 생산에 이용하거나, 이를 포함하는 백신 형태로 제조하여 닭에 접종함으로서 마이코플라즈마 시노비에에 의한 닭 마이코플라즈마병의 진단용 항원 생산과 백신, 예방약 개발로 국내 계군의 마이코플라즈마병의 보다 정확한 진단과 효과적인 예방이 가능하여 양계농가의 생산성 향상에 기여할 수 있으며, 아울러 향후 수입이 예상되는 예방용 백신의 대체효과를 통하여 국가 경제에 미치는 긍정적 효과가 클 것으로 기대된다.
도 1은 국내 분리 M. synoviae 균주들의 유전적 상관성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 국내 분리 M. synoviae 균주들과 외국 분리주(GenBank database)의 유전적 상관성 정도를 비교분석 한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규 마이코플라즈마 시노비에 균주에 관한 것이다. 본 발명자들은 국내 양계로부터 분리한 상기 신규 마이코플라즈마 시노비에 균주를 "MS-09-AR"이라 명명하고, 2012년 12월 27일자로 한국생명공학연구원 생명자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC12342BP를 부여받았다.
본 발명에 따른 상기 신규 마이코플라즈마 시노비에 균주 MS-09-AR은 외국 표준주와 확연히 구별되는 유전자형을 가지며, 국내 분리주의 대표적 유전자형을 가지는 균주로서, 국내 닭마이코플라즈마병에 대한 특이적 진단 및 예방용 백신주로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기 마이코플라즈마 시노비에 균주는 백신주로서 불활성화 하여 사독화한 상태로 포함될 수 있으며, 상기 MS-09-AR을 이용하여 제작한 약독화 균주로 포함될 수도 있다. 상기 불활성화 방법은 당업계에 통상적인 방법에 의할 수 있으며, 예를 들어 마이코플라즈마 시노비에 균주 배양액에 불활성화제(예: 0.2% formalized physiological saline solution 등)를 첨가하여 불활성화시키고 이에 보조제(예: ISA 70 등)를 첨가하여 불활성화 사독백신을 제조할 수 있다. 또한, 상기 약독화 균주는 당업계에 통상적인 약독화 방법에 의할 수 있으며, 예를 들어 돌연변이를 유발하는 화학물질, 박테리오파지, 백혈구 등을 이용하거나 유전공학적 기법으로 단일 또는 복수의 유전자를 결손 또는 손상시켜 병원성이 소실 또는 약화된 약독화 백신주를 제작할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 MS-09-AR 균주를 닭마이코플라즈마병 백신에 사용하는 경우, 상기 백신은 당업계에 통상적으로 알려진 방법으로 제조할 수 있으며, 상기 마이코플라즈마 시노비에 균주를 단독으로 또는 다른 질병 백신주와 혼합한 백신, 상기 균주를 불활화한 사독 백신, 상기 마이코플라즈마 시노비에 균주의 유전자를 사용하여 생산한 서브유니트(subunit) 백신, 벡터(vector) 백신, 키메라(chimera) 백신 또는 DNA 백신 등과 같은 다양한 형태로 제조될 수 있으므로, 그 활용도가 매우 넓다. 상기 백신은 당업계에서 통상적으로 사용하는 수의학적으로 수용가능한 매개체 또는 부형제를 포함할 수 있으며, 아주번트를 추가로 더 포함할 수 있다. 또한 상기 백신은 면역증강용 보조제를 더 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 하기 시험예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 예로 한정되는 것은 아니다.
[ 참고예 1] 국내 양계 M. synoviae 오염도 조사
국내 양계의 마이코플라즈마 시노비에에 대한 오염도를 확인하기 위하여 국내 원종계 11개 농가 45계군에 대하여 M. synoviae(MS) 항원 검사 및 항체 검사를 수행하여 항체 검사의 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 항원검사는 특이 프라이머(MS-F : 5’-GAGAAGCAAAATAGTGATATCA-3’, MS-R : 5’-CAGTCGTCTCCGAAGTTAACAA-3’)를 이용한 중합효소연쇄반응(PCR)법으로 M. synoviae의 특이적인 유전자 부위(210 bp)를 확인하여 검사하였고, 항체검사는 평판응집반응용 진단액(농림수산검역검사본부)과 ELISA 킷트(미국 IDEXX사 M. synoviae antibody test kit)를 함께 이용하여 수행하였다.
주령 계군수 검사 수수 계군 양성율(%) 개체 양성율(%)
<20주 17 536 10(58.8) 123(22.9)
20-40주 6 206 1(16.6) 1(0.4)
40-60주 11 340 6(54.5) 80(23.5)
60-80주 11 297 6(54.5) 33(11.1)
전체 45 1379 23(51.1) 237(17.1)
국내 원종계 11개 농가 45계군에 대한 MS항원검사 상에서는 2계사 4.4%가 양성으로 확인되었다. 그러나 상기 표 1의 결과에서, 낮은 항원 양성율과 달리 항체 검사 상에서 매우 높은 양성반응이 관찰되어 23계군 51%가 MS 항체를 갖고 있는 것으로 확인되었다. 일반적으로 M. synoviae 감염계는 균의 특성상 항원검사에서는 검출율이 낮고 항체검사에서는 용이하게 검출이 가능하다. 이 실험결과도 이러한 경향을 나타내는 것이다.
또한 경기도 소재 13개 종계장 41개 계군을 대상으로 MS 항체양성률을 조사 분석하였다. 경기도 소재 종계농장(시산 전) MS 감염율 조사(항체검사) 결과를 하기 표 2에, 경기도 소재 종계농장(산란시기) MS 감염율 조사(항체검사) 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
농장 계군 시산전후 주령 항체검사결과 항체양성율(%)
1 1 동 시산전 17 주령 2/50 4%
2 동 시산전 17 주령 1/52 1.90%
3 동 시산전 17 주령 2/55 3.60%
4 동 시산전 17 주령 0/54 0%
5 동 시산전 17 주령 0/55 0%
2 1 동 시산전 17 주령 14/50 28%
2 동 시산전 17 주령 2/50 4%
3 1 동 시산전 17 주령 7/70 10%
2 동 시산전 17 주령 12/50 24%
4 1 동 시산전 19 주령 55/55 100%
2 동 시산전 19 주령 50/52 100%
3 동 시산전 19 주령 55/55 100%
전 체 계군양성율 10/12(83.3%),
개체양성율 198/648 (30.5%)
농장 계군 시산전후 주령 항체검사결과 항체양성율(%)
5 1 동 시산후 35 주령 52/52 100%
2 동 시산후 35 주령 52/52 100%
3 동 시산후 35 주령 53/53 100%
6 1 동 시산후 36 주령 53/53 100%
2 동 시산후 36 주령 53/53 100%
3 동 시산후 36 주령 54/54 100%
7 1 동 시산후 41 주령 52/52 100%
2 동 시산후 41 주령 49/51 96%
3 동 시산후 41 주령 48/52 92.30%
8 1 동 시산후 48 주령 50/50 100%
2 동 시산후 48 주령 46/54 85.10%
3 동 시산후 48 주령 48/50 96%
4 동 시산후 48 주령 47/50 94%
6 동 시산후 48 주령 50/51 98%
9 1 동 시산후 56 주령 51/51 100%
2 동 시산후 56 주령 51/51 100%
3 동 시산후 56 주령 55/55 100%
10 1 동 시산후 61 주령 54/54 100%
2 동 시산후 61 주령 50/50 100%
11 1 동 시산후 70 주령 52/52 100%
2 동 시산후 70 주령 53/53 100%
12 1 동 시산후 75 주령 54/54 100%
2 동 시산후 75 주령 54/54 100%
3 동 시산후 75 주령 54/54 100%
13 1 동 시산후 76 주령 49/50 98%
2 동 시산후 76 주령 50/50 100%
3 동 시산후 76 주령 50/50 100%
4 동 시산후 76 주령 51/51 100%
5 동 시산후 76 주령 50/50 100%
전 체 계군양성율 29/29(100%),
개체양성율 1491/1509(98.8%)
상기 표 2와 표 3의 전체 13개 농장을 기준으로 농장별 양성률 100%, 계군별 양성률 95.1%, 개체별 양성률 78.3%로 확인되었다. 시산 전인 12개 계군 중 10개 계군이 항체 양성반응이 확인되어 83.3%의 계군양성률을 보였으며 개체별로는 30.5%(198/648) 수준이었고(표 2), 또한 시산 후에는 검사된 29개 계군 모두 항체 양성으로 전환되었고 개체별 양성율은 98.8%(1491/1509)로 확인되어(표 3) 국내 양계의 마이코플라즈마 시노비에에 의한 감염률이 매우 높음을 확인할 수 있다.
[ 시험예 1] 유전자형 분석
13개 국내 마이코플라즈마 시노비에 분리주를 대상으로 병원성과 직접적으로 관련성이 있는 vlhA 유전자 염기서열을 분석하였다. 실험에 사용한 분리주들은 2007년부터 2011년 사이에 농림수산검역검사본부 조류질병과에 질병진단을 위해 의뢰된 닭 가검물의 기관, 관절 등으로부터 무균적으로 채취한 스왑시료에서 분리되었다. 균분리를 위해 스왑시료를 Frey(또는 PPLO) 액체배지 및 한천배지를 사용하여 배양하였다. 액체배지 배양시 배양액의 1/10의 용량이 되도록 스왑시료 부유액을 접종하여 37℃에서 10일간 배양한 후, 색깔의 변화가 있으면 한천배지에 도말하여 37℃에 3~5일간 배양하였다. 도말배지에서 전형적인 유두상의 집락 형성여부를 현미경하에서 관찰하고, 의심균에 대해 PCR을 이용한 유전자 검사법으로 M. synoviae 여부를 최종 확인하였다.
특이 프라이머(VlhAF: 5‘-ATTAGCAGCTAGTGCAGTGGCC-3’, VlhAR2: 5‘-AGTAACCGATCCGCTTAATGC-3’)을 이용한 PCR법으로 vlhA 유전자를 증폭(315 bp 또는 372 bp)하여 dye termination sequencing system을 이용한 자동염기서열분석기(Macrogen사 의뢰)로 염기서열을 결정하였으며, Vector NTI(미국 Invitrogen사), MEGA 4(megaso- ftware, Tempe, AZ , USA) 염기서열분석 프로그램을 이용하여 균주들의 유전적 상관관계(유전자형)를 분석하여 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 결과에서, 결과 국내 분리주는 크게 3가지 유전자형(genotype)이 있는 것으로 확인 되었으며 MS-09-AR(MS02)균주가 포함된 그룹이 국내 분리주의 대표적인 유전자형임을 확인할 수 있다.
또한, GenBank database 상에 등록된 외국 분리주의 염기서열(11개)과 비교하여 상기 국내 분리주 대상의 분석방법과 동일한 방법으로 vlhA 유전자 염기서열을 분석하여 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 결과에서, 본 발명에 따른 MS-09-AR 균주의 유전자형은 외국 분리주들과도 확연히 구별됨을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 MS-09-AR 균주는 국내 양계에 유행하는 균주의 대표 균주로서, 외국 분리주를 사용하는 경우 검출되지 않는 국내 닭 마이코플라즈마병 감염의 특이적인 진단을 위한 항원성분으로 유용할 뿐 만 아니라, 예방약의 조성물로서도 매우 유효하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
[ 시험예 2] 국내 분리 MS 균주 병원성 조사
상기 시험예 1에서 확인된 국내 분리주의 대표적인 유전자형인 MS-09-AR(MS02)균주가 포함된 그룹의 균주 중, 백신주로서 유용하게 사용될 수 있는 균주를 선발하기 위하여, 질병진단 내역을 토대로 호흡기 상피세포에서 발견될 뿐 관절염 등의 경제성을 상실시키는 병증을 나타내지 않는 균주들은 배제하고, 관절염을 유발하는 5개 야외균주(MS-09-AR, MS-08-27, MS-08-Han, MS-08-TR, MS-08-Lee)를 대상으로 3주령 SPF 닭에서 병원성조사를 실시하였다.
3주령 SPF 닭 25마리를 상기 분리된 5개 야외균주의 각 균주당 5마리의 군으로 나누어 발바닥으로 상기 각 균주 시료를 0.1ml씩 접종한 뒤, 매일 관찰하면서 임상증상 발현유무를 확인하였다. 2주후 안락사시켜 관절염 유무, 균분리 및 혈청검사를 실시하였다.
관절염 발현정도를 조사하기 위해 부검을 실시하여 관절의 종대 및 삼출물 출현 등의 병변여부를 확인하였고, 무균적으로 기관 및 관절로부터 스왑시료를 채취하여 상기 참고예 1에 따른 방법으로 항원검사(균분리율) 및 항체검사(혈청검사)를 수행하여 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
균 주 명 분리장기 관절염 균분리율 혈청검사
기관 발바닥
MS-09-AR 관절 4/5 2/5 0/5 5/5
MS-08-27 기관 1/5 5/5 0/5 2/5
MS-08-Han 관절 0/5 0/5 0/5 2/4
MS-08-TR 기관 0/5 5/5 0/5 0/5
MS-08-Lee 기관 1/5 2/5 0/5 5/5
상기 표 4의 결과에서, 육안적 및 병리조직학적 검사결과 MS-09-AR균주의 경우 접종 5수 중 4수에서 발바닥이나 무릎관절에 염증소견이 관찰되고, 혈청검사 결과 MS-09-AR 균을 접종한 닭에서 모두 혈청 양성반응도 확인되어 면역원성이 우수함을 알 수 있다. 따라서 실제 농가에 있어서 닭의 경제성을 상실시키는 증상인 관절염 등의 병증을 나타내는 닭마이코플라즈마병의 원인균이며, 면역원성이 현저하게 뛰어난 MS-09-AR 균주가 백신주로서 매우 유용함을 확인할 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC12342BP 20121227

Claims (7)

  1. 기탁번호 KCTC 12342BP로 기탁된 마이코플라즈마 시노비에(Mycoplasma synoviae) 균주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 균주는 닭마이코플라즈마병 진단용인 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 시노비에 균주.
  6. 제1항의 마이코플라즈마 시노비에 균주의 불활성화 주를 포함하는 닭마이코플라즈마병 예방용 백신.
  7. 제1항의 마이코플라즈마 시노비에 균주의 약독화 주를 포함하는 닭마이코플라즈마병 예방용 백신.
KR1020120156224A 2012-12-28 2012-12-28 신규 마이코플라즈마 시노비에 균주 KR101566376B1 (ko)

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