CN107446859B - 一株鸡毒支原体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株鸡毒支原体及其应用，所述的鸡毒支原体为鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)HNMga1，保藏编号：CGMCC NO：13857，保藏日期：2017年5月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京。本发明中的鸡毒支原体菌株HNMga1分离自发生典型呼吸困难、鼻窦炎的成年蛋鸡，具有稳定的生物学特性，对鸡具有较强的致病力，能够引起鸡发生典型的鼻窦炎、呼吸困难、死亡症状，且具有良好的免疫原性。利用本发明中的鸡毒支原体菌株HNMga1制备的疫苗安全可靠，对鸡的慢性呼吸道疾病具有较好的保护效果。

Description

一株鸡毒支原体及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及一株鸡毒支原体及其应用。

背景技术

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)又称鸡败血支原体，是引起鸡和火鸡等多种禽类慢性呼吸道病(chronic respiratory disease,CRD)或火鸡传染性窦炎的病原。其特征为咳嗽、流鼻涕、呼吸道啰音和张口呼吸。该病原体存在于病鸡和带菌鸡的呼吸道、卵巢、输卵管和精液中，带菌鸡胚可垂直传递给后代，公鸡可通过交配将病传遍全群。鸡群一旦染病即难以彻底根除。雏鸡比成年鸡易感，成年鸡常无明显症状，应激因子及其它呼吸道病原微生物、新城疫弱毒株、大肠杆菌等继发感染或协同作用，使病情恶化、症状明显。发病率与死亡率的高低，除与日龄和菌株有关外，并发感染、饲养管理、卫生条件以及应激等均有关系。发病率30％～40％，高者可达80％以上。死亡率1％～10％，高者可达20％～50％。MG是对家禽致病性较强，经济损失严重的支原体疾病，主要表现为淘汰或者饲料利用率、产蛋量降低，幼鸡生长不良、产蛋鸡产蛋减少、治疗费用增加。本病发展缓慢，病程较长，在鸡群中能长期蔓延.对养鸡生产危害极大。

随着人们长期用药不规范，使得MG获得对泰乐菌素、替米考星等药物产生了可遗传耐药性。目前疫苗免疫是预防MG感染的最主要手段，灭活疫苗具有安全、稳定和易保存等优点，解决了MG感染带来的产蛋率下降问题。然而疫苗使用降低了MG排放量从而减CRD症状，但不能抑制MG的水平传播。弱毒疫苗是目前用于预防CRD的主流疫苗，具有免疫反应快、用量少等优点。我国也有MG活苗F36株。F株是应用时间最长和最广泛的疫苗，能明显提高患病鸡的产蛋量。近年来人们发现其具有引发感染的潜在威胁，F株免疫没有取代其他毒株反而感染未接种的鸡群，MG F株可经蛋传方式传播给子代鸡。因此亟需一种新的具有安全、免疫原性好的菌株制备的疫苗对该病进行防治。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一株鸡毒支原体及其应用，该菌株毒力强，制备的疫苗安全、免疫性好。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一株鸡毒支原体，所述的鸡毒支原体为鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)HNMga1，保藏编号：CGMCC NO：13857，保藏日期：2017年5月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京。

一种鸡毒支原体在制备鸡毒支原体灭活疫苗方面的应用。

所述的鸡毒支原体灭活疫苗的制备方法为：将所述的鸡毒支原体依次经过培养、收获和灭活得到疫苗原液后，加入佐剂即得疫苗。

所述的佐剂为氢氧化铝佐剂。

所述的鸡毒支原体灭活疫苗的制备方法为：将鸡毒支原体接种到PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，3d后收取培养物，测定浓度，调整培养物中鸡毒支原体的菌数为2×10⁷CFU/mL，加入培养物体积分数0.2％的甲醛溶液，于37℃灭活12h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等体积的氢氧化铝佐剂，混合制得鸡毒支原体灭活疫苗。

本发明的有益效果：

1、本发明中的鸡毒支原体菌株HNMga1分离自发生典型呼吸困难、鼻窦炎的成年蛋鸡，在PPLO液体培养基上传代、固体培养基上分离得到，在PPLO液体培养基中增殖滴度高，达10⁷CFU/mL以上。

2、本发明中的鸡毒支原体菌株HNMga1具有稳定的生物学特性，对鸡具有较强的致病力，能够引起鸡发生典型的鼻窦炎、呼吸困难、死亡症状，且具有良好的免疫原性。

3、利用本发明中的鸡毒支原体菌株HNMga1制备的疫苗安全可靠，对鸡的慢性呼吸道疾病具有较好的保护效果。

附图说明

图1为菌株HNMga1菌落4×显微镜下形态。

图2为菌株HNMga1菌体吉姆萨染色100×显微镜下形态。

图3为菌株HNMga1的PCR鉴定结果，图中的Marker为DL 2000bp，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，100bp；1为引物MB1，MB2对鸡毒支原体疫苗株F株(CVCC1652)的扩增结果；2为引物MB1，MB2对菌株HNMga1的扩增结果；3为阴性对照；从图中可以看出，模板PCR扩增片段约为1483bp，证明扩增片段为目的片段，符合预期设计大小。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1、鸡毒支原体的分离和鉴定

1.1病料采集

病料来自于2017年4月在河南省许昌市某大型蛋鸡场发生鼻窦炎、呼吸困难死亡的产蛋鸡的肺脏。

1.2培养基的制备

PPLO液体培养基：PPLO肉汤粉10.5g，葡萄糖2.5g，酵母粉2.5g，溶于440mL超纯水中，115℃灭菌15min，加入MEM培养基5mL、马血清50mL、青霉素8万单位、无菌质量分数10％精氨酸10mL和1％(w/v)酚红500μL。培养基于115℃灭菌15min后，于4℃保存备用。

PPLO固体培养基：加入1.5％(w/v)琼脂粉的PPLO液体培养基。培养基于115℃灭菌15min后，于4℃保存备用。

1.3支原体的分离培养

取适量病变肺组织放入研磨器中剪碎，加入2mL的灭菌PBS缓冲液，研磨，取上清液于EP管中。然后5000r/min低速离心5min后，用针管取上清液，在针管部安装0.22μm滤膜过滤，加入PPLO液体培养基中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养。培养近一周后，取1mL转接10mLPPLO液体培养基中再次培养，传代2～5代后液体颜色由红色变为黄色，取100μL涂布PPLO固体培养基表面，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。3～10d后，肉眼观察可见有圆形、微小、光滑、透明、露珠状菌落，在低倍显微镜下观察固体培养基上菌落的形态，形态为菌落中央颜色较深且致密的乳头状突起，典型的支原体“煎荷包蛋样”(见图1)。吉姆萨染色，油镜下观察菌体形态，为多形态，呈球形、卵圆形、弯曲的丝状、螺旋状(见图2)，命名为菌株HNMga1。

1.4菌株的鉴定

1.4.1设计引物

根据鸡毒支原体16S rRNA的序列设计一对通用引物，用于鸡毒支原体的扩增，引物序列如下：

MB1：5’-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3’(SEQ ID NO.1)

MB2：5’-CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.2)

预期扩增片段大小为1483bp。

1.4.2PCR鉴定

将菌株HNMga1接种PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养3d后，培养基由红色变为黄色，收集菌体，按照DNA提取试剂盒的操作步骤提取出菌株HNMga1的DNA，分光光度计测定浓度为100μg/mL，用MB1，MB2扩增进行PCR鉴定。同时，设置鸡毒支原体疫苗株F株(CVCC1652)为阳性对照。

PCR扩增反应体系为25μL：10×缓冲液2.5μL，2.5mM dNTPs 0.5μL，10μM/L通用引物MB1，MB2各1μL，5U/μL rTaq 1μL，100μg/mL DNA模板1μL，加入ddH₂O至25μL。

反应条件：95℃预变性5min，进入循环：95℃30s，57℃30s，72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物4℃保存。

扩增产物进行电泳，每孔加样10μL，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察结果(见图3)。图3看出，MB1，MB2扩增出符合预期大小片段，经测序与鸡毒支原体弱毒疫苗株F株(CVCC1652)(Genbank No.CP001873)同源性98％，测序结果如下。证明所分离的菌株HNMga1为鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)。

CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTTAACCCCAATCATGGACCCTACCTTAGACGGCTCCCTCCCTTTCGGGTTAGGCCACCGGCGTTGGGTATTGCCCACTTTCGTGGTTTGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCGAGAACGTATTCACCGCAACATGCTGATTTGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGAACTGAGACTGTTTTTGTGAGTTTCGCTCCAGGTCACCCTATCGCTTCTCTTTGTTCCAGCCATTGTATCACGTTTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAATTTATCACTGGCAGTCTCGCTAGAGTCCCCAACTTAATGATGGTAACTAGCAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCGTGCACCACCTGTACATCTGTTAGCCTCCGAACTTATTTCTAAGCCTTTGCAGAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTTTTCGTGTATCTTCGAATTAAACAACATGATCCACCGCTTGTGCGGGGTCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCATACTTGCGTACGTACTACTCAGGCGGAGAACTTAATGCGTTAACTGCAGCACTGACCTTATGGCCAACACTTAGTTCTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATCAGTGTCAGTATAGACCCAGCAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATATTTACGCATTTTACCGCTACACATGGAATTCCACTTGCCTCTGTCTCACTCTAGTTATATAGTTTTCATAGCCTCACAGCGTTAAGCACTGCACTTACACCACAAACTTTTATAACCACCTACGCACCCTTTACGCCCAGTAAATCCGGATAACGCTCGCCCCCTATGTATTACCGCGGCTGCTGGCACATAGTTAGCCGGGGCTTATTCATATGGTACCGTCAATTTTTAATTTTTCTTCCCATATAAAAGAACTTTACATACCGAAGTACTTCGTCGTTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGGGTTTCCCCCATTGCCGAAAATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTTCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTAGACCTCTCAGTCCGGCTACGCATCATCGTCTTGGTAGGCTCTTACCCCACCAACTAACTAATGCGCCGCAGACCCCTCTTAAACCGATAAATCTTTAAATGTGTTTTTTTCATGCACACATCCTATCCAGTATTAGCTCCAGTTTCCCGGAGTTATCCTCGAGTTAAAGGTAGGTTATCTACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAAGCATCCGAAGATGCTTCGTTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCATCCTGAGCCAGGATCAAACTCTGTCGACGCGT(SEQ ID NO.3)

1.5毒力试验

试验鸡为45日龄健康的鸡20只，均为鸡毒支原体ELISA抗体阴性。试验动物分为两组，对照组10只，试验组10只，两组试验动物随机分组。将HNMga1接种PPLO液体培养基，37℃、5％CO₂培养箱中培养3d后，测定菌体浓度，连续10倍稀释涂布固体平板，低倍镜下活菌计数，计算培养物原液菌体浓度，调整至10⁷CFU/mL，试验组动物通过喉气管接种1mL支原体液体培养物，对照组动物通过喉气管接种1mL灭菌的PPLO液体培养基。试验期为15d，每天观察试验动物的临床表现，测量体温，如试验动物死亡则立即进行剖杀，观察呼吸道病变病采集病料。于15d试验结束时，剖杀所有试验动物。

试验组动物在接种支原体24h后表现出临床症状：流涕，咳嗽、喘气、张口呼吸、头部肿胀等症状，7d后死亡1只，10d后死亡2只。对照组动物在试验期间体温正常且无明显的呼吸道症状。试验结束后剖杀试验组动物，同时剖杀10只对照组动物。采集病料，进行支原体分离。试验组剖检，眶下窦充满灰白色浆液性、粘性分泌物，气囊混浊、布满黄色干酪样渗出物。对照组剖检均未发生明显的病理变化，对照组的10份病料均未分离到支原体，试验组的10份病料中均分离到鸡毒支原体，菌落形态表现为“煎荷包蛋样”，PCR鉴定结果与HNMga1一致。

实施例2、疫苗的制备、安全性和效力试验

2.1疫苗的制备

将鸡毒支原体菌株HNMga1接种到PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，3d后收取培养物，测定浓度，调整培养物中鸡毒支原体的菌数为2×10⁷CFU/mL，每1000mL培养物加2mL甲醛溶液(质量分数37％)，于37℃灭活12h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等体积的氢氧化铝佐剂(Sigma公司，F5881)，混合制得鸡毒支原体灭活疫苗，疫苗中鸡毒支原体的菌数约为1×10⁷CFU/mL。

2.2疫苗的安全性试验：

选取45日龄健康鸡20只，均为鸡毒支原体ELISA抗体阴性。分为4组，每组5只。疫苗组3组，每组分别颈部皮下注射0.5mL、1mL、2mL本疫苗；对照组1组，颈部皮下注射2mL灭菌生理盐水。观察14d。观察期间，疫苗组和对照组的鸡精神状况、采食正常，未见精神不振、采食减少、流涕、呼吸困难、眼脸肿胀等不良反应。说明本发明的灭活疫苗安全。

2.3疫苗的效力试验

选取45日龄健康鸡100只，均为鸡毒支原体ELISA抗体阴性。分为5组，每组20只。具体为：疫苗1-4组：每组分别注射本疫苗0.1mL、0.2mL、0.3mL和0.5mL，第5组为未免疫组，注射0.5mL灭菌生理盐水。疫苗组和未免疫组4周后二免注射同等剂量的疫苗或灭菌生理盐水。二免后30d用10⁷CFU的HNMga1采取气管注射的攻毒方式进行攻毒。攻毒后14d内，观察所有鸡的临床症状。在攻毒后14d后，对所有鸡进行剖检，确定攻毒保护率，采集肺脏等器官进行鸡毒支原体分离培养。

疫苗组与未免疫组鸡攻毒后有明显的差异，攻毒后，未免疫组第2d开始出现临床症状，流涕，咳嗽、喘气、张口呼吸，减食甚至绝食，7d后开始出现死亡，14d后共死亡8只，全部发病。剖检结果：眶下窦充满灰白色浆液性、粘性分泌物，气囊混浊、布满黄色干酪样渗出物。而疫苗组中，0.1mL疫苗组的20只鸡中有3只出现临床症状和病例变化；0.2mL疫苗组的20只鸡中有2只出现临床症状和病例变化；0.3mL和0.5mL疫苗组的20只鸡没有发病。免疫攻毒保护情况见下表。

注：“—”表示不适用。

由上表可以看出，本疫苗的最小免疫保护剂量为0.1mL，含菌量为1×10⁷CFU/mL。说明本发明的灭活苗具有良好的保护效果。

以上所述仅为本发明最佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一株鸡毒支原体及其应用

<160> 3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgcgtcgac agagtttgat cctggct 27

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgcggatccg ctaccttgtt acgactt 27

<210> 3

<211> 1483

<212> DNA

<213> 鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum）

<400> 3

cgcggatccg ctaccttgtt acgacttaac cccaatcatg gaccctacct tagacggctc 60

cctccctttc gggttaggcc accggcgttg ggtattgccc actttcgtgg tttgacgggc 120

ggtgtgtaca aaccccgaga acgtattcac cgcaacatgc tgatttgcga ttactagcga 180

ttccgacttc atggagtcga gttgcagact ccaatccgaa ctgagactgt ttttgtgagt 240

ttcgctccag gtcaccctat cgcttctctt tgttccagcc attgtatcac gtttgtagcc 300

caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccaat ttatcactgg 360

cagtctcgct agagtcccca acttaatgat ggtaactagc aataagggtt gcgctcgttg 420

cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accgtgcacc acctgtacat 480

ctgttagcct ccgaacttat ttctaagcct ttgcagagta tgtcaagacc tggtaaggtt 540

tttcgtgtat cttcgaatta aacaacatga tccaccgctt gtgcggggtc ccgtcaattc 600

ctttgagttt catacttgcg tacgtactac tcaggcggag aacttaatgc gttaactgca 660

gcactgacct tatggccaac acttagttct catcgtttac ggcgtggact accagggtat 720

ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgtg catcagtgtc agtatagacc cagcaagccg 780

ccttcgccac tggtgttcct ccatatattt acgcatttta ccgctacaca tggaattcca 840

cttgcctctg tctcactcta gttatatagt tttcatagcc tcacagcgtt aagcactgca 900

cttacaccac aaacttttat aaccacctac gcacccttta cgcccagtaa atccggataa 960

cgctcgcccc ctatgtatta ccgcggctgc tggcacatag ttagccgggg cttattcata 1020

tggtaccgtc aatttttaat ttttcttccc atataaaaga actttacata ccgaagtact 1080

tcgtcgttca cgcggcgttg ctcggtcagg gtttccccca ttgccgaaaa ttccctactg 1140

ctgcctcccg taggagtttg ggccgttctc agtcccaatg tggccggtag acctctcagt 1200

ccggctacgc atcatcgtct tggtaggctc ttaccccacc aactaactaa tgcgccgcag 1260

acccctctta aaccgataaa tctttaaatg tgtttttttc atgcacacat cctatccagt 1320

attagctcca gtttcccgga gttatcctcg agttaaaggt aggttatcta cgtgttactc 1380

acccgttcgc cactaagcat ccgaagatgc ttcgttcgac ttgcatgtat taggcacgcc 1440

gccagcgttc atcctgagcc aggatcaaac tctgtcgacg cgt 1483

Claims (4)

1.一株鸡毒支原体，其特征在于：所述的鸡毒支原体为鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum)HNMga1，保藏编号：CGMCC NO：13857，保藏日期：2017年5月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国北京。

2.一种如权利要求1所述的鸡毒支原体在制备鸡毒支原体灭活疫苗方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的鸡毒支原体灭活疫苗的制备方法为：将所述的鸡毒支原体依次经过培养、收获和灭活得到疫苗原液后，加入氢氧化铝佐剂即得疫苗。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的鸡毒支原体灭活疫苗的制备方法为：将鸡毒支原体接种到PPLO液体培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，3d后收取培养物，测定浓度，调整培养物中鸡毒支原体的菌数为2×10⁷CFU/mL，加入培养物体积分数0.2％的甲醛溶液，于37℃灭活12h，制得疫苗原液；再加入和疫苗原液等体积的氢氧化铝佐剂，混合制得鸡毒支原体灭活疫苗。

Images